Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez tarafından çok-Locus değişken-sayı tandem-balık tekrar Analizi-patojen Bakterium Yersinia ruckeri

Bu MLB genotileme protokolü, uluslararası öneme sahip bir balık patojenik bakterisi olan Yersinia ruckeri'nin epidemiyolojisi ve küresel nüfus yapısı anlayışımızı büyük ölçüde artırmıştır. Daha önce kurulmuş Yersinia ruckeri yazma şemaları ile karşılaştırıldığında, çok yüksek bir gerinim çözünürlüğü sunar. Prosedür basit, ucuz ve kolayca laboratuvarlar arasında karşılaştırılabilir taşınabilir sonuçlar verir.

Bu teknik tanısal özgüllüğü büyük ölçüde artırır ve enfeksiyon takibini sağlar. Örneğin, artık sık sık öldürücü Olmayan çevresel suşları fon karşı mevcut öldürücü Yersinia ruckeri klonları ayırt edebilirsiniz. Prosedürü gösteren Saima Nasrin Mohammad, bizim laboratuvarda bir teknisyen olacaktır.

Başlamak için, Petri yemekleri üzerinde herhangi bir uygun agar türü üzerinde Yersinia ruckeri saf kültürleri ekmek için steril aşılama döngüleri kullanın. 22 derecede 1-2 gün veya 15 santigrat derece 3-4 gün kuluçka. Bundan sonra, aşılama döngüleri kullanarak, her Petri kabından tek bir temsili koloni seçin ve 50 mikrolitre ultra saf su içeren 1,5 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın.

Girdap kısa bir süre ve 100 santigrat derece bir ısıtma bloğu üzerinde yedi dakika kuluçka. Daha sonra, üç dakika için 16, 000 g santrifüj ve dikkatle boş 1.5 mililitrelik santrifüj tüpler içine supernatant şablon DNA aktarmak için bir pipet kullanın. Bir sonraki adıma geçin veya DNA'yı 20 santigrat derecede saklayın.

Ana karışımları hazırlamak için, önce analiz edilecek bakteri örneklerinin sayısına göre reaktif hacimleri hesaplayın, ayrıca bir negatif ve bir pozitif kontrol ve son %10 fazla hacmi, el yazmasında ayrıntılı olarak hesaplayın. Farklı astar konsantrasyonları kullanıldığını unutmayın. İki ayrı santrifüj tüpünde, PCR teşpin başına bir adet, multipleks PCR artı ana karışım, astar ve RNase içermeyen su ekleyin.

Girdap hazırlanan ana düşük hızda yavaşça karıştırır ve sonra, pcr şeritler veya plakalar üzerinde ayrı ayrı kuyular içine ayrı ayrı her ana karışımı 22 mikrolitre dağıtmak. Daha sonra, her iyi ana karışım içeren her hazırlanan DNA şablonu üç mikrolitre ekleyin;bakteri örnek başına iki kuyu, her bir test için bir. Pozitif kontrol için doğrulanmış yersinia ruckeri sudan DNA ve negatif kontrol için ultra saf su kullanın.

Mühür ve santrifüj kısaca. Hazırlanan reaksiyonları bir PCR termik çevrimciye yükleyin ve programı el yazmasına göre ayarlayın. Program üç saatten kısa bir süre içinde tamamlanacak.

Üreticinin önerilerine göre, bir kez TBE tampon agarose jel tozu ekleyin 1.5 ağırlık / hacim yüzdesi ve ısı çözmek için. Döküm den önce, çözünmüş jel çözeltisini akan suyun altında kısa bir süre soğutun, 50 mikrolitre jel çözeltisi ve karışımı başına 5 mikrolitre floresan nükleik asit boyası ekleyin. Döküm tepsisini birleştirin ve seviyeleyin.

Örnek sayısına uygun konileri ekleyin. Döküm içine jel çözeltisi dökün ve katılaşmak için bekleyin. Bundan sonra, bir jel elektroforez sisteminde bir kez TBE tampon jel içeren döküm batırın.

Beş mikrolitre PCR ürününün yeni PCR şeritlerinde iki mikrolitre yükleme boyasıyla karıştırın. Karışımların beş mikrolitresini jeldeki kuyulara aktarın. En az bir kuyu boş kaydedin.

Referans için boş kuyuya beş mikrolitre DNA merdiveni ekleyin. Elektrotları takın ve jeli yaklaşık bir saat boyunca 15 santimetrede 110 volta çalıştırın. PRC amplicons temsil eden birden fazla bantvarlığını doğrulamak için uv tabanlı jel görüntüleme sistemi kullanın.

PCR amperatörlerinin onaylanmasının ardından, PCR ürünlerini 1 ila 10 arasında saf suda seyreltmek için yeni PCR şeritleri veya plakaları kullanın. Girdap ve santrifüj kısaca. Bir duman dolap çalışırken, formamid ve referans boyutu standart çözüm oluşan bir santrifüj tüp bir ana karışımı hazırlamak.

Analiz edilecek PCR ürün sayısına göre, el yazmasında ayrıntılı olarak reaktif hacimleri kullanın. %10 fazla hacim bekleyin. Girdap kısaca ve mevcut kılcal elektroforez sistemi için uygun bir PCR plaka üzerinde bireysel kuyular içine 9.5 mikrolitre dağıtmak.

Ardından, seyreltilmiş PCR ürün 0,5 mikrolitre ekleyin. Mühür ve santrifüj kısaca. Daha sonra, numuneleri içeren plakayı bir PCR termik atöre yükleyin ve numuneleri süresiz olarak dört santigrat dereceye kadar soğutmadan önce üç dakika boyunca 95 derecede denatüre edin.

Bir dakika için 1000 g santrifüj, dikkatle mühür kaldırmak ve üreticinin talimatlarına göre kalibre kılcal elektroforez sistemi üzerine plaka yükleyin. Parça analizi kılcal elektroforez çalıştırın, tercih edilen cihaz için uygun reaktifler kullanarak, ve el yazması açıklamaya göre çalışma koşullarını ayarlayın. Yersinia ruckeri VNTR kılcal elektroforez boyutu arama için, ilk ithalat kapiller elektroforez gen Mapper 5 yazılımı içine dosyaları ithalat.

Analiz yöntemini microsatellite Default olarak ayarlayın, boyut standardı altında uygun ürün seçimini seçin ve ardından Analiz düğmesine basın. Boyut eşleme düzenleyicisi aracılığıyla, boyut standart parçalarının doğru tanımlamasını doğrulayın ve görünür de olsa hatalı ayırmaları düzeltin. Ardından, okunacak örneği seçin, ÇizimI Görüntüle düğmesine basın ve boyutlandırma tablosunun görünümünü etkinleştirmek için A'yı Denetle düğmesine basın.

Üst paneldeyken, VNTR amperonlarını temsil eden beş tepeye tıklarken Denetimi basılı tutun. Yalnızca vurgulanan beş tepenoktasının özelliklerini gösteren boyutlandırma tablosunu filtrelemek ve her VNTR locusunun downstream uygulaması için boyut çağrılarını kaydetmek için G'ye basın. Kapiller elektroforez sırasında önyargılı amplikon hareketlilik paternlerini hesaba katmak için, elde edilen boyut çağrılarını locusa özgü değişkenlerle birlikte çalıştırarak doğru VNTR tekrar sayılarını hesaplayın.

Formül, otomasyon için bir elektronik tablo şablonu içinde uygulanabilir. Elektronik tabloda, yuvarlak hesaplanan VNRT yineleme, akış aşağı çözümlemesi öncesinde en yakın toplamda sayılır. BioNumerics yazılımında, yeni bir veritabanı oluşturun ve MLVA eklentisini etkinleştirmeyi tercih edin.

Deneme türü panelinde, yeni deneme türü oluştur'a, Karakter türünü seçin ve sorulduğunda varsayılan ayarları kullanın' tuşuna basın. Ardından yeni denemeyi seçin ve değer aralığı olarak sıfırdan 100'e kadar kullanan 10 VNTR loci'nin her biri için yeni karakterler ekleyin. Ana panelde, alma alanları ve karakterleri seçerek Yersinia ruckeri VNTR yineleme sayımları ve yöntem verilerini aktarın.

Bunun depolandığı dosyayı bulun ve Hedef türü sütununda seçim yapın. VNTR'ler için bu, uygun karakter değerini seçmek anlamına gelirken, çeşitli meta veriler giriş bilgileri alanları olarak sınıflandırılır. Yapılan seçimler, işlemi daha sonra kolaylaştırmak için şablon olarak depolanabilir.

MST küme çözümlemesi için ayrılan içe aktarılan örnekleri seçin ve karşılaştırmalar panelinde yeni karşılaştırma oluştur düğmesini tıklatın. MST'nin görsel sunumu için istenirse, örnekleri belirli bir meta veri özelliğine göre renkli gruplara ayırın. Ardından, seçilen örnekleri temel alan bir MST diyagramı oluşturmak için kategorik veriler için Gelişmiş küme çözümlemesi ve MST'yi seçin.

Bölüm parametreleri, çapraz uzunluklar, düğüm dal etiketleme, vb ekleyerek MST görsel sunum değiştirin. Gerekirse, Sonsınıf görüntü seçimini kullanarak sonlanan MST'yi istenilen biçimde dışa aktarın. Multipleks PCR'den sonra jel elektroforez görüntüsü, örnek içeren 12 şeridin tümlerinde birden fazla amplikonrun varlığını doğrular ve ilk şerit kullanılan DNA merdivenini temsil eder.

Kapiller elektroforezden kaynaklanan elektroferogramlarda farklı VNTR loci boyut ve boya etiketleme kombinasyonuna göre tanımlanabilir. Turuncu zirveler kullanılan boyut standardını temsil eder. Yersinia Ruckeri'nin MLVA profillerine dayanan örnek bir minimum yayılan ağaç, beş farklı Norveç çiftliğinde Atlantik somonundan çıkarılan izole edici ler gösterilmiştir.

Çiftlik kökenine bağlı açık bir kümelenme eğilimi görülebilir. Farklı Yersinia ruckeri klonları mlva tarafından belirlenmesi hakim, örneğin, balık türlerinin özellikle coğrafi bölgelerde, zaten bu patojene karşı aşılama stratejileri geliştirmek için istismar edilmiştir.