Name: Referansta bulunmadığı Pasifik Istiridyeleri neredeyse sıralı cDNA Kütüphanesi üretimi için bir converging stratejisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Keşfedin, yerel pazarlardan alınan Pasifik istiridyelerinden RNA kullanarak biyoteknolojik gen klonlama yöntemini. Kamuya açık referans dizileriyle karşılaştırma yaparak maliyetli dizilemeyi atlayabilir ve hızlıca cDNA kütüphanesi oluşturabilirsiniz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Çin doğal Bilim Vakfı (Grant numaraları 31471703, A0201300537 ve 31671854 için L.L., Grant numarası 31470435 G.Y.) ve 100 yabancı yetenekler planı (Grant numarası JSB2014012 için) tarafından desteklenmektedir.

Not: Şekil 1' de şematik bir genel bakış gösterilir.
1. örnek toplama
<ol><li>İstiridye numuneleri alın. İstiridyeler sırasında buz üzerinde istiridye tutun, taşıma ve laboratuar kullanımı ve işlem öncesinde 4-7 gün içinde satın aldıktan sonra. Not: Bu protokol Için, istiridye, Nanjing (Ningde, Fujian, Çin ve Lianyungang, Jiangsu, Çin), Haijie Aquatic ürün şirketi Qingdao (Qingdao, Shandong, Çin kökenli), Jucheng kaynaklanan Zhong Cai toptan Market satın alındı Aquatic ürün şirketi-Yantai (Yantai, Shandong, China) ve Jinxiu Aquatic ürün şirketi Qingdao (Qingdao, Shandong, China) kaynaklanan).</li>
</ol>2. guanidinyum Thiocyanate tarafından RNA yalıtımı-fenol ekstraksiyon
<ol><li>İstiridye dokusu numunesi hazırlanması<ol>
<li>Her bir istiridye örneğinin yaklaşık geometrik merkezinden sterilize edilmiş bir neşter ile yaklaşık 100 mg homojen yumuşak doku çıkarın ve numuneleri sıvı nitrojen haline aktarın.</li>
		<li>1 saat için-80 °C ' de donma ve biyolojik atık olarak atmak için istiridyelerin kalan kısmını ötenize etme.</li>
		<li>Bir harç (200 mL) sıvı azot 50 mL ile dolu bir ince toz içine flaş dondurulmuş istiridye dokusu grind.</li>
		<li>Tartmak 75 her numunenin dondurulmuş dokusunun mg steril bir 1,5 ml Santrifüjlü tüp içine ve 1 ml guanidinyum Thiocyanate-fenol ekstraksiyon reaktif ile karıştırın. Numuneyi 14.000 x g 'de 4 °c ' de 15 dakika boyunca santrifüjün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yeni bir 1,5 ml Santrifüjü tüpüne süpernatant aktarın, 200 μL kloroform ekleyin ve mix Sütlü-beyaz döner kadar 10-15 s için bir Vortex Mikser kullanarak iyice karıştırın.</li>
	<li>14.000 x g 'de 15 dakika boyunca 4 °c ' de santrifüjün ve üst sulu tabakası, 200 μL pipet ile dikkatle yeni bir 1,5 ml Santrifüjlü tüpüne interfaz rahatsız etmeden aktarın.</li>
	<li>500 μL isoproses alkol ekleyin ve örnekleri hafifçe inversion ile karıştırın, sonra örnekleri buzda 20 dakika boyunca bırakın. 14.000 x g 'de 4 °c ' de 8 dk 'da santrifüjün ve süpernatant çıkarın.</li>
	<li>% 75 EtOH 1 mL içinde Pelet her resuspend ve 5 dk için 4 °C 14.000 x g Santrifüjü tüm supernatant kaldırın.</li>
	<li>2,5 adımı bir kez yineleyin. Oda sıcaklığında 6 dk için Pellet kuru. Daha uzun süre kurumayın; Aksi takdirde, bir sonraki adımda RNA Pelet çözülür zor olabilir.</li>
	<li>Kuru RNA Pelet 25 μL DEPC (dietylpyrocarbonate)-tedavi su ve buz üzerinde tüp tutmak çözülür. RNA örneklerini 24 saat içinde kullanın.</li>
</ol>3. Ters transkripsiyon tarafından cDNA Kütüphanesi üretimi
<ol><li>Her RNA örneği için, 10 μL pipet kullanarak bir ticari Ters transkripsiyon sistemini kullanarak bir reaksiyon karışımı hazırlayın: 4 μL MgCl2 çözeltisi, 2 μL 10X reaksiyon tamponu, 2 μL dntp çözeltisi, 0,5 μL RNase inhibitörü, 0,7 ΜL AMV Reverse Transcriptase, 0,5 μL oligo (dT) 15 astar, 1 μL ayıklanan RNA örneği ve 9,3 μL H2O bir 300 ΜL PCR tüp içine.</li>
	<li>42 °C ' de 60 dk için bir PCR Termocycler içinde karıştır ve sonra sıcaklığı 5 dakika için 95 °C ' ye yükseltin.</li>
	<li>Oluşturulan cDNA kütüphanesini-20 °C ' de 12 aya kadar saklayın.</li>
</ol>4. mitokondriyal gen amplifikasyon ve arıtma
<ol><li>10 μL pipet kullanarak PCR karışımını hazırlayın. 0,25 μL (1,25 U) yüksek doğruluk DNA Polymerase, 2 μL dNTP çözeltisi (2,5 mM her dNTP), 0,5 μL COX1 veya ND ileri astar (100 μM), 0,5 μL karşılık gelen COX1 veya ND ters astar (100 μM), 1 μL cDNA Kütüphanesi ekleyin , 5 μL 5x tampon çözeltisi ve 16 μL a 300 μL PCR tüpüne H2O damıtılmış.</li>
	<li>Aşağıdaki parametreleri kullanarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirin: 95 °C ' de (süre 5 dk) ilk denatürasyon adımından sonra 35, 55 °C ' de (30 s) bir tavlama aşamadan oluşan PCR reaksiyon döngüleri, 72 °C ' de (2 dk) uzama adımı ve 95 °C ' de (30 s) denatürasyon adım , 72 °C ' de 5 dakika boyunca bir sonlandırılması uzama adımını gerçekleştirin.</li>
	<li>Elde edilen PCR ürününün kalitesini agaroz jel elektroforezi ile doğrulamak için PCR ürününün 5 μL değerini kullanın. 759 ya da 748 temel çiftleri sırasıyla tek bir bant olarak amplifikatörleşmiş COX1 veya ND geni gözlemlemek.</li>
	<li>PCR ürününün geri kalanını bir pck Temizleme Kiti ile temizler.<ol>
<li>Numune için 100 μL ' PCR-A ' (yüksek konsantrasyonlarda kaotropik tuzları11içeren DNA bağlama tamponu) ekleyin. İçeriği karıştırmak için kısaca Vortex.</li>
		<li>Arıtma sütununu 2 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. 4.4.1 reaksiyon karışımı pipet. sütuna. 14.000 x g , oda sıcaklığında 1 dakika Santrifüjü.</li>
		<li>Santrifüj tüpünden filtrat atın. Sütunu 2 mL Santrifüjlü tüpe döndür, 700 μL ' W2 ' çözümünü sütun içine ekleyin ve 14.000 x g 'de 1 dakika oda sıcaklığında Santrifüjü (' W2 ', kalıntı chaotropik çıkarılması için yüksek konsantrasyonlarda etanol içeren bir yıkama çözümüdür Arıtma sütunundan tuzları).</li>
		<li>Süzyünü atın ve sütunu 2 mL Santrifüjü tüpüne geri dönün. 400 μL ' W2 ' solüsyonu sütununa ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika için 14.000 x g 'de santrifüjün.</li>
		<li>1 mL deiyonize su ön ısı 65 °C ' de metal blok ısıtıcısına kadar. Yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne sütun aktarın. 65 °C ' den 25 μL pipet, beyaz sütun membranın merkezine sıcak ön ısıtmalı deiyonize su. Membranın oda sıcaklığında 1 dakika bekletine izin verin.</li>
		<li>14.000 x g 'de Santrifüjü oda sıcaklığında 1 dakika boyunca çıkarın ve sütunu atın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Temizleşmiş PCR ürününü-20 °C ' de 12 aya kadar saklayın.</li>
</ol>5. mitokondriyal gen sıralaması ve karşılaştırma
<ol><li>Uygun COX1 veya ND ileri astar kullanarak Sanger sıralamalar için adım 4,5 ' dan arındırılmış PCR örneklerini sıralı astar olarak gönderin. İsteğe bağlı olarak, COX1 veya ND ters astar çift yönlü sıralama için de kullanılabilir.</li>
	<li>Sıralama sonuçlarını aldıktan sonra, NCBı nüklotide BLAST online aracını (blast.ncbi.nlm.nih.gov) kullanarak (NCBı taksonomi kimliği: 29159) Pasifik Oyster referans gerinim genom dizisi ile dizileri karşılaştırın (Şekil 2 ve Şekil 3 ).</li>
</ol>6. genleri MgUGD ve MgUXS klonlama için cDNA kütüphanesi uygulanması
<ol><li>Yükseltmek ve mgugd ve mguxs genleri ilgili ileri ve ters astarlar mgugd ve mguxs tarafından PCR tarafından 4,1 adımları aşağıdaki kullanarak arındırmak. 4,4 için.</li>
	<li>1,5 mL santrifüj tüpüne 2 μL sindirim tamponu (10X konsantre) ve 6 μL deiyonize su aktarın. Yan ı ve Xho ı (1 μL her biri, 20 U) kısıtlama endonükleases ile birlikte saf MgUGD veya MgUXS PCR ürünleri 10 μL ekleyin. 37 °C ' de 3 saat boyunca kulküt atın.</li>
	<li>Önceden sindirilmiş pET-30A vektörünü hazırlayın: pET-30A vektörünün 500 ng 'yi yeni bir 1,5 mL Santrifüjlü tüpüne aktarın ve sesi deiyonize su kullanarak 16 μL 'ye yerleştirin. 2 μL sindirim tamponu (10X konsantre) ile birlikte, nde ı ve Xho ı (1 μL her, 20 U) kısıtlama restriksiyon endonükleazlarına benzer ekleyin.<ol>
<li>Karışım 37 °C ' de 3 saat boyunca inküden sonra, 1 μL alkalin fosfataz (1 U) ekleyin ve 37 °C ' de ek bir saat boyunca Inküye yapın. Önceden ısıtılan metal blok ısıtıcısına 10 dakika boyunca 75 °C ' de ısıtarak alkalin fosfataz ısınmaya hazır hale getirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sindirilmiş MgUGD veya MgUXS DNA ürünlerinin 4 μL 'sini taze 1,5 mL Santrifüjlü tüplere aktarın ve 4 μL sindirilmiş pET-30A vektörünü ekleyin. 1 μL ligasyon tamponu (10X), 1 μL T4 ligaz (3 U) ekleyin ve reaksiyon karışımını 22 °C ' de 3 saat boyunca inkübasyon yapın.</li>
	<li>Elektroyetkin E. coli Mach1 yetkili hücreleri, ligasyon ürünlerini kullanarak Elektroporasyon ile dönüştürün. Dönüştürülmüş hücreleri 50 μg/mL kanamycin içeren LB agar plakalarına yayın. 37 °C ' de hücreler için 16 h.</li>
	<li>Plasmid özgü T7 organizatör ve Terminator astar kullanarak Sanger sıralama tarafından istenen ekleme kolonileri doğrulayın. Onaylanmış bakteriyel klonlar plazmidler hazırlayın.</li>
</ol>7. MgUGD ve MgUXS ifade ve aktivite testleri
<ol><li>Dönüşüm E. coli bl21 (de3) MgUGD ve MgUXS genler taşıyan plazmids Ile yetkili hücreler ve 50 μg/ml kanamycin içeren lb agar plakaları üzerinde dönüştürülmüş hücreler yayıldı. 37 °C ' de hücreler için 16 h.</li>
	<li>50 μg/ml kanamisin ile birlikte 5 ml lb orta olarak tek bir koloni geliştirin. Kültürü 400 mL LB orta seviyeye aktarın ve 200 rpm 'de 37 °C ' de sürekli olarak titremesi, 600 Nm (OD600) dalga boyunda optik yoğunluğa kadar yaklaşık 0,5 emilimine ulaşır.<ol>
<li>İnkübasyon sıcaklığını 20 °C ' ye azaltın ve 400 μL isopropresl β-D-thiogalactopyranoside (konsantrasyon 1 M) ekleyin. Rekombinant proteinlerin ifadesine 3 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4.500 x g 'de santrifüjleme Ile 4 °c ' de 15 dakika hasat hücreleri. 10 ml lizis tampon (100 mm NaCl, 50 mm Tris/HCL, 1% Triton X-100, 1 mm phenylmethylsulfonyl-fluorid (PMSF), pH 8,0) içinde Pelet askıya.</li>
	<li>Hücreleri sonication ile 20 dk (40, 4 °C ' de 15 s için 20 μm genlik açık/kapalı döngüleri) ile bozar. 14.000 x g 'de 4 °c ' de 20 dakika santrifüjün ve aktivite testi için süpernatant toplayın.</li>
	<li>2 μL ' lik UDP-glikoz (10 mM) ile 2 μL hücre lysate inkükleştirici ile MgUGD 'nin aktivite tahlili gerçekleştirin, 4 μL NAD+ (10mm), 4 μL MgCl2 (10 mm), 2 μL Tris/HCL tampon (500 mm, pH 7,5) ve 6 μL deiyonize H2O yeni bir 1,5 mL santrifüjli tüp ve 37 °C ' de 30 dakika boyunca inküye.</li>
	<li>2 μL (10 mM) UDP-glukuronik asit ile 2 μL hücre lysate kuluçkaya tarafından MgUXS aktivite tahlil gerçekleştirin, 2 μL Tris/HCl tampon (500 mM, pH 7,5), ve 14 μL deiyonize H2O yeni bir 1,5 ml santrifüjli tüp içinde ve inküser 37 °c 30 dakika.</li>
	<li>Her karışımı için 20 μL metanol ve 40 μL kloroform ekleyerek, adım 7,5 ve 7,6 reaksiyonları gidermek. Örnek karışımları vortekslenir sonra, 4 °c ' de 6 dakika için 14.000 x g Santrifüjü ve her tüpün üst sulu tabakası toplayın.</li>
	<li>500-700 den m/z aralığında negatif iyonizasyon modunda MALDı-TOF Kütle spektrometresi kullanarak reaksiyon ürünlerini analiz edin. 1 μL 2, 5-dihiddroxybenzoic asit numune matris (1% w/V 50% sulu acetonitrile) ile örnek karışımı Mix. Beklenen m/z değerleri 579 ve 535 UDP-glukuronik asit ve UDP-Xylose için sırasıyla gözlemlemek (Şekil 4).</li>
</ol>

<ol><li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+a+DNA+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+identification+of+dried+shellfish+%28oyster%2C+clam+and+mussel%29+products+sold+on+the+Chinese+market%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay%2C+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li>
<li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica%2C+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid%2C+reflects+their+reproductive+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li>
<li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+%28Haemosporidia%29+from+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li>
<li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li>
<li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+systematics+of+armadillos+%28Xenarthra%2C+Dasypodidae%29%3A+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein & Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li>
<li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein & Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li>
<li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
<li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-glucose+4-epimerase+and+%CE%B2-1%2C4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">UDP-glucose 4-epimerase and β-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600(2018).</li>
<li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Sunulan protokol, COX1 ve ND genlerinin genel olarak kullanılabilen bir istiridye DNA genomu veritabanı ile karşılaştırılması yoluyla bölgesel deniz ürünleri piyasalarının benzer fenotipi ile başvurulmayan istiridye örneklerinin genetik tanımlaması sağlar. Bu yöntemin önemi, sadece tek bir PCR reaksiyonu sanal cDNA kütüphanesinin değerlendirilmesi için gerekli olduğu için basitliği içinde yatıyor. İki adet üretilen mitokondriyal COX1 ve ND genleri, her bir istiridye tarafından RNA ekstrelerinin ters transkripsiyonu ile o...

Yaşam referanslı biyolojik materyalin satın alınması, uzun teslimat süreleri, girişimci mantık veya ülkeye özgü gümrük yönetmeliklerine bağlı olarak zor olabilir. Alternatif olarak, gerekli biyolojik malzeme de fenotipik olarak özdeş örneklerden toplanan olabilir. Ancak, bu örnekler genotip düzeyinde önemli ölçüde değişebilir, ve bu nedenle aynı türlerin dijital olarak saklanan referans genomlar ile karşılaştırmalar genellikle zor veya hatta boşuna yeni kaynaklı malzemenin uyumsuzluğu nedeniyle işlenir Mevcut DNA amplifikasyon yöntemleri. Bireysel numunelerin son derece sağlam genleri sıralaması, cDNA kütüphanelerinin kalite değerlendirmesi için sıkça referans genleri olarak kullanılan, kayıtlı mitokondriyal genler gibi türler1' i tanımlamak için yaygın olarak kullanılan ve güçlü bir araçtır2 ,3,4,5,6. Burada sunulan yöntemin temel gerekçesi, atıf genomunun karşılık gelen dizilerine kıyasla bireysel anonim istiridye örneklerinde mitokondrial gen sıralarının yüksek korunmasında diğer genlerin de bir nükleer DNA7' ye göre mitokondriyal DNA evriminin genel olarak daha hızlı oranı verildiğinde, bilimsel ve endüstriyel olarak ilgili genlerin geniş bir yelpazede amplifikasyon ve yalıtımına izin vererek, sadece kamuya açık bir şekilde kullanarak başvuru olarak kullanılabilir sıralama verileri.
Burada açıklanan yöntemin genel amacı, istiridye genlerinin klonlanması için şablon DNA 'Sı olarak kullanılabilecek neredeyse sıralı bir istiridye cDNA Kütüphanesi oluşturmak için optimize edilmiş bir iş akışı sunabilmenizi sağlamaktır. Sanal sıralamanın içinde, de Novo genom sıralamasının kaçınması; Bunun yerine, bilinen, dijital olarak saklanan referans sırası, sonunda bir kitaplık (veya önceden var olan bir tane eklenir) oluşturan cDNAs üretimi için astar kullanmak veya tasarlamak için doğrudan kullanılır. Amaç, bir yakınsak cDNA Kütüphanesi üretmektir, yani oluşturulan cDNA dizileri ve referans sırası arasındaki benzerlikler düşük yüksek divergence sıralanmış olabilir. Referans genler olarak sitokrom C oksidaz altbirim 1 (COX1) ve NADH dehidrogenaz (ND) kullanmanın önemli bir avantajı, bu mitokondriyal genlerin yüksek korunması nedeniyle coğrafi olarak çok sayıda istiridye numunelerinin profillenmiş olabileceği anlamına gelmiştir. Bu iyi kurulan işaretçileri ile yaklaşımı kanıtlanmış olan, daha sonra şeker nüklerotid biyosentezi katılan iki enzim adayları için uygulama göstermek ve endüstriyel alaka olabilir,8,9, 10. Pasifik istiridye biyoteknolojik potansiyeli hala keşfedilmemiş. Böylece, neredeyse sıralı cDNA Kütüphanesi hazırlamak için bu yakınma yöntemi de bu ilgili biyolojik malzeme cDNA oluşturmak isteyen uzman olmayan araştırmacılar için uygun olacağına inanıyoruz.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Kimyasallar: < / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 1 Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>9002-93-1</td> <td>* Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>2,5-Dihidroksibenzoik asit</td><td>Alfa Aesar</td><td>490-79-9</td> <td>* Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Merck</td><td>75-05-8</td> <td>* Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>Agaroz. moleküler biyoloji</td><td>Biowest Chemicals</td><td>111860</td><td>*Alternatif distribütörler mümkün</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Solarbio</td><td>69-52-3</td><td>*Alternatif distribütörler mümkün</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Lingfeng, Shanghai</td><td>67-66-3</td><td>*Alternatif distribütörler mümkün</td></tr><tr><td>DEPC su</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0601</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Jinhuada, Guangzhou</td><td>64-17-5*</td><td>Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>Guanidinyum tiyosiyanat-fenol reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>TRIzol reaktifi</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Enerji Kimyasalları</td><td>288-32-4</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>İzopropil alkol</td><td>Nanjing Kimyasal Reaktif</td><td>67-63-0</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>İzopropil ve beta;- D-tiyokalaktopiranosit</td><td>Solarbio</td><td>367-93-1</td><td>*Alternatif distribütörler mümkün</td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Solarbio</td><td>25389-94-0</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Thermo Fisher</td><td>22700025</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Thermo Fisher</td><td></td> <td>10855021*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Jinhuada, Guangzhou</td><td>67-56-1</td><td>*Alternatif distribütörler olası</td></tr><tr><td>MgCl2 hekzahidrat</td><td>Xilong Huagong</td><td>7791-18-6</td><td>*Alternatif distribütörler mümkün</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Xilong Huagong</td><td>7647-14-5</td><td>*Alternatif distribütörler mümkün</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>Duly Biotech</td><td>53-84-9</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>Fenil-metilsülfonil florür</td><td>Macklin</td><td>329-98-6</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>77-86-1</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>UDP-glikoz</td><td>Wuhu Nuowei Chemicals</td><td>28053-08-9</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>UDP-glukuronik asit</td><td>SIGMA</td><td>63700-19-6</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>< güçlü > Araçlar / Aletler: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MALDI-TOF kütle spektrometresi</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>Metal blok ısıtıcı</td><td>Long Yang Scientific Instruments</td><td>Thermoshaker HB20</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>PCR termodöngüleyici</td><td>Hema</td><td>9600</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>< güçlü > Enzim ve Kitleri: < / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kez; Ligasyon tamponu</td><td>Thermo Scientific</td><td>B69</td> <td>* Alternatif distribütörler 5</td></tr><tr><td>kez mümkündür; PrimeSTAR tampon</td><td>Takara</td><td>9158A</td><td></td></tr><tr><td>Alkalin fosfataz</td><td>ThermoFisher FastAP</td><td>EF0654</td><td>*Alternatif distribütörler mümkündür</td></tr><tr><td>COX ileri astar</td><td>Genscript</td><td>ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG</td><td></td></tr><tr><td>COX ters astar</td><td>Genscript</td><td>ACTTGACCAAAAACATAAGACATG</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Tampon</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>*Alternatif distribütörler olası</td></tr><tr><td>dNTP karışımı</td><td>Invitrogen</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>MgUGD ileri astar</td><td>Genscript</td><td>ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT</td><td></td></tr><tr><td>MgUGD ters astar</td><td>Genscript</td><td>ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG</td><td></td></tr><tr><td>MgUXS ileri astar</td><td>Genscript</td><td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC</td><td></td></tr><tr><td>MgUXS ters astar</td><td>Genscript</td><td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td><td></td></tr><tr><td>ND ileri astar</td><td>Genscript</td><td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td><td></td></tr><tr><td>ND ters astar</td><td>Genscript</td><td>ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC</td><td></td></tr><tr><td>PCR Temizleme Kiti</td><td>AxyGen</td><td>AP-PCR-250</td><td>*Alternatif distribütörler olası</td></tr><tr><td>pET-30a(+) vektör</td><td>Merck Millipore</td><td>69909</td><td></td></tr></tbody></table>

referansta bulunmadığı pasifik istiridyeleri neredeyse sıralı cdna kütüphanesi üretimi için bir converging stratejisi

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

Yeni hücre hatları veya genom sıralama projelerinin geliştirilmesi gibi önemli deneylerde daha önce kullanılan referans türlerinin biyolojik malzemesine erişim, genellikle daha fazla çalışmalar veya üçüncü şahıslar için sağlamak zordur numunelerin tüketici doğası. Şimdi yaygın Asya, Avustralya ve Kuzey Amerika 'nın Pasifik kıyılarında dağıtılan rağmen, bireysel Pasifik Oyster örnekleri genetik olarak oldukça çeşitlidir ve bu nedenle doğrudan gen kütüphaneler için başlangıç malzemesi olarak uygun değildir. Bu yazıda, cDNA kitaplıkları oluşturmak için bölgesel deniz ürünleri pazarlarından elde edilen başvurulmayan Pasifik Oyster örneklerinin kullanımını gösteriyoruz. Bu kütüphaneler daha sonra halka açık istiridye genomu ile karşılaştırıldığında ve en yakın ilgili Kütüphane mitokondriyal referans genler sitokrom C oksidaz altbirim ı (COX1) ve NADH dehydrogenase (ND) kullanılarak seçildi. Oluşturulan cDNA kütüphanesinin uygunluğu Ayrıca, UDP-Xylose ' in biyosentezi için sorumlu olan, UDP-glukuronik asit dehidrojenaz (UGD) ve UDP-Xylose sentaz (uxs) enzimlerini kodlayan iki genin klonlanması ve ifadesiyle gösterilmiştir. UDP-glikoz.

Şekil 1 , Pasifik Oyster bireylerinden türetilen yakınsak cDNA kütüphanesinin açıklanan hazırlık yönteminin şematik bir özetini gösterir. Şekil 2 , referans malzemenin COX1 ve ND gen dizilerinden yüksek sapma sahip, uzaktan ilgili bir istiridye örneğinin COX1 ve ND genlerinin sıralarını gösterir. Şekil 3 , referans materyalinin COX1 ve ND gen dizilerinden düşük sapma sahip, yakından ilgili bir istiridye örneğinin COX1 ve ND genlerin...

Başvurulmayan Pasifik Oyster örneklerinden RNA örneklerinin nasıl kullanılacağı ve neredeyse sıralı bir cDNA Kütüphanesi oluşturmak için kamuya açık genom verileriyle karşılaştırıldığında genetik malzemeyi değerlendirmek için bir strateji tarif ediyoruz.

Referansta bulunmadığı Pasifik Istiridyeleri neredeyse sıralı cDNA Kütüphanesi üretimi için bir converging stratejisi

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

Bu yöntemle ele almak istediğimiz temel soru, biyoteknolojik olarak ilgili genlerin klonlanması için yerel gıda pazarlarından satın alınan malzemelerden alınan RNA örneklerini nasıl kullanabileceğimizdir? Burada, pasifik istiridyelerini bu yaklaşımı ve potansiyel daha fazla uygulamayı göstermek için bir vaka çalışması olarak kullanıyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı, istiridye örneklerinin geleneksel genom veya cDNA diziliminin atlatılabildiğidir.Bunun yerine, sitokrom c oksidaz alt birimi I ve NADH dehidrogenaz dizileri en yakından ilgili örneği seçmek için Pasifik istiridye halka açık referans dizileri ile karşılaştırıldı. Bu örnekten hazırlanan cDNA, biyoteknolojik olarak ilgili genlerin klonlanmasında doğrudan kullanılabilir ve bu genler genel dizi bilgileri kullanılarak seçilebilir. Prosedürü gösteren Yongmei Lyu ve Yuquan Li, Glycomics ve Glikan Biyomühendislik Araştırma Merkezi Nanjing Tarım Üniversitesi'nden iki lisansüstü öğrencileri olacaktır.İstiridye dokusu örneği hazırlamak için, her istiridye numunesinin yaklaşık geometrik merkezinden yaklaşık 100 miligram homojen yumuşak dokuyu kesmek için sterilize edilmiş bir neşter kullanın. Numuneyi 50 mililitre sıvı nitrojenle dolu bir harç içine aktarın. Flaş dondurulmuş istiridye dokusunu ince bir toz haline getirin.Steril 1.5 mililitrelik santrifüj tüpüiçine her numunenin dondurulmuş doku 75 miligram tartmak ve guanidinium tiyokyanat-fenol ekstraksiyon reaktif bir mililitre ile karıştırın. Bu yordamın en kritik adımı RNA çıkarma adımıdır. RNA bozulmasını en aza indirmek için, istiridye dokusu ve RNA çıkarma hasat arasındaki süreyi azaltmak esastır.Numuneyi 14, 000 kez g ve 4 santigrat derece 15 dakika santrifüj edin. Yeni bir 1.5 mililitrelik santrifüj tüp supernatant aktarın, kloroform 200 mikrolitre ekleyin ve karışım süt beyaz dönene kadar 10 ila 15 saniye boyunca bir girdap karıştırıcı üzerinde iyice karıştırın. Sonra, santrifüj daha önce olduğu gibi 15 dakika.200 mikrolitrelik pipetle, üst sulu tabakayı, interfazı bozmadan, 1,5 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpe dikkatlice aktarın. Santrifüj tüpüne 500 mikrolitre izopropil alkol ekleyin ve numuneleri karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Daha sonra örnekleri 20 dakika buzda bırakın.Santrifüj 14, 000 kez g ve sekiz dakika boyunca dört derece santigrat, ve supernatant çıkarın. Peleti bir mililitrede %75 etanolle yeniden askıya alın ve 14, 000 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj. Tüm supernatant çıkarın ve etanol yıkama tekrarlayın.Peletleri oda sıcaklığında altı dakika kurulayın. Daha sonra, kurutulmuş RNA peletini DEPC ile işlenmiş suyun 25 mikrolitresinde eritin ve tüpü buzda tutun. RNA örneklerini 24 saat içinde kullanın.Bir cDNA kitaplığı oluşturmak için, önce el yazmasına göre çözeltiler ekleyerek 300 mikrolitrelik bir PCR tüpteki her RNA numunesi için bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Tüp içine çıkarılan RNA örneğinin bir mikrolitresini ekleyin. Karışımı bir PCR termocycler'da 60 dakika 42 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve sıcaklığı 5 dakika boyunca 95 dereceye yükseltin.Oluşturulan cDNA kitaplığını eksi 20 santigrat derecede 12 aya kadar saklayın. İlk olarak, el yazmasına göre hazırlanan PCR karışımları içeren tüplere oluşturulan cDNA kitaplığından bir mikrolitre ekleyin. PCR tüplerini PCR termocycler'a yerleştirin ve pcr amplifikasyonu ilk denatürasyon adımı ve bir uzama adımı, bir uzama adımı ve el yazmasına göre bir denatürasyon adımından oluşan 35 PCR reaksiyon döngüsüyle gerçekleştirin.Döngülerden sonra, beş dakika boyunca bir sonlandırma adımını gerçekleştirin. Agarose jel elektroforezinin kalitesini doğrulamak için PCR ürününün beş mikrolitresini kullanın. Güçlendirilmiş COX1 veya ND genini sırasıyla 759 veya 748 baz çiftlerinde tek bir bant olarak gözlemleyin.PCR ürünün geri kalanını arındırmak için, her numuneye yüksek oranda chaotropic tuz içeren 100 mikrolitre DNA bağlayıcı tampon ekleyin. Girdap kısaca içeriğini karıştırmak için. Bir arınma sütunu iki mililitrelik bir santrifüj tüpü içine yerleştirin.Pipet kolon içine reaksiyon karışımı. Oda sıcaklığında bir dakika için 14,000 kez g bir santrifüj monte sütun ile tüp yerleştirin. İki mililitrelik santrifüj tüpten filtrasyon attıktan sonra, 14,000 kez g santrifüj ederek 700 ve 400 mikrolitre yıkama çözeltisi W2 ile iki kez yıkayın.Sonra, bir mililitre deiyonize suyu 65 santigrat dereceye ısıtın. Sütunu yeni bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne ve önceden ısıtılmış deiyonize suyun 25 mikrolitrepipeti beyaz kolon zarının ortasına aktarın. Membran oda sıcaklığında bir dakika bekletin.Daha sonra, oda sıcaklığında bir dakika için 14, 000 kez g sütun ile tüp santrifüj. Sütunu atın ve saflaştırılmış PCR ürünlerini eksi 20 santigrat derecede 12 aya kadar saklayın. İsteğe bağlı olarak, COX1 veya ND ters astarlar da çift yönlü sıralama için kullanılabilir.Sanger sıralama için, ilgili COX1 veya ND ileri astar kullanın. Sıralama sonuçlarını aldıktan sonra, NCBI Nucleottide BLAST çevrimiçi aracını kullanarak dizileri Pasifik istiridye referans suşunun genom dizisi ile karşılaştırın. MgUGD ve MgUXS genlerinin daha önce yapıldığı gibi PCR ile güçlendirmek ve arındırmak için ilgili ileri ve ters astarları kullanın.Sindirim tamponu ile saflaştırılmış PCR ürünleri incubating sonra, 1.5 mililitrelik santrifüj tüp içinde pET-30a 500 nanogram eriterek önceden sindirilmiş pET-30a vektör hazırlamak ve 16 mikrolitre kadar kontüzyonlu su ekleyin. Daha sonra, tüp içine 10 kez konsantre sindirim tampon ve 20 birim kısıtlama enonukleases Nde1 ve Xho1 her biri bir mikrolitre iki mikrolitre ekleyin. Karışımı 37 derecede üç saat kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, bir birim alkali fosfataz bir mikrolitre ekleyin ve ek bir saat için 37 derece santigrat de kuluçka. Daha sonra, alkali fosfataz inaktive etmek için 10 dakika boyunca 75 santigrat derece önceden ısıtılmış metal blok ısıtıcı tüp yerleştirin. MgUGD ve MgUXS genleri taşıyan E.coli BL21 hücreleri yetiştirdikten sonra, iki litrelik sallayarak şişe 400 mililitrelik LB orta içine kültür aktarmak, ve 37 santigrat derece sıcaklıkta 200 rpm bir shaker üzerine yerleştirin.Üç saat sonra, 600 nanometre dalga boyunda bir fotometre üzerinde optik yoğunluğu kontrol edin ve yaklaşık 0,5 bir emilime ulaştığından emin olun. Sonra shaker sıcaklığını 20 santigrat dereceye düşürün. Üç saat boyunca rekombinant proteinlerin ekspresyonunu indüklemek için tek molar IPTG 400 mikrolitre ekleyin.Hücreleri hasat sonra, dört santigrat derece 20 dakika sonication tarafından hücreleri bozabilir. Santrifüj 14, 000 kez g ve 20 dakika için dört derece santigrat, ve aktivite testi için yeni bir tüp içinde supernatant toplamak. Aktivite tadına varmadıktan sonra, MgUXS ve MgUGD karışımlarına 20 mikrolitre metanol ve 40 mikrolitre kloroform ekleyerek reaksiyonları söndürün.Girdap örnek karışımları ve santrifüj 14, 000 kez g altı dakika ve dört derece santigrat için. MALDI-TOF kütle spektrometresi için yeni tüpler her tüpün üst sulu tabakasıtoplayın. Bu deneyde, son derece farklı bir numunenin COX1 ve ND gen dizilerinin dizi hizalaması Pasifik istiridye suşu referansı ile karşılaştırıldı.Kırmızı oklar referans sırası ile elde edilen cDNA örneklerinin sırası arasındaki nükleotit farklılıklarını gösterir. Yakından ilişkili bir istiridye örneğinin COX1 ve ND genlerinin dizileri, Pasifik istiridye suşreferansından düşük sapma göstermektedir. MALDI-TOF kütle spektrometresi, endüstriyel olarak ilgili mgugd ve MgUXS genlerini klonlamak için cDNA kütüphanesinin başarılı bir şekilde uygulanmasını göstermektedir.Jel görüntü de udp-glukuronik asit ve UDP-ksyoz art arda ifade ve saflaştırılmış MgUGD ve MgUXS enzimatik eylem tarafından oluşturulan tanımlar. Bu yöntem, referans sırası ve elde edilen işaretleyici dizileri arasında mükemmel bir eşleşme gerektirmez ve araştırmacıya referanssız istiridyelerle çalışması için güven vermelidir. Prensip olarak, bu yöntem, yakından ilişkili bir referans türünden dizilerin kamuya açık olduğu referanssız biyolojik numunelere uygulanabilir.Bu yöntem, uzman olmayan araştırmacıların potansiyel biyolojik öneme sahip genetik materyallere kolayca erişmelerine izin verir ve daha fazla bilim adamının kolayca erişilebilen ancak tam olarak tanımlanmış biyolojik örneklerle çalışmasının önünü açmaktadır.

a-converging-strategy-for-generation-virtually-sequenced-cdna-library

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Mevsimsel hipoksik fiyort dikey derinliği süreklilik çevre genomik DNA izole bir fosmid kütüphane inşaatı açıklanmıştır. Çıkan klon kütüphanesi 384-kuyucuğu içine aldı ve mansap sıralama ve fonksiyonel tarama, otomatik bir koloni toplama sistemi uygulama tarafından arşivlenir.

Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

Burada T7 lineer RNA amplifikasyon dayalı gen ekspresyon analizi için iki tek okudum ve eşleştirilmiş sonuna Illumina mRNA Seq sıralama kütüphaneler hazırlanması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, toplam RNA başlayan sadece 10 nanogram gerektirir ve tüm transkript temsil eden son derece tutarlı bir kütüphane oluşturur.

10 nanogram Total RNA tek okuyun ve Eşleştirilmiş Sona mRNA-Seq Illumina Kütüphaneler

Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Yetkin ektodermde bir yanıtı indükleyebilen genlerin ekspresyon klonlaması için bir Xenopus oosit ve hayvan başlığı sistemini tanımlıyoruz ve bu tür genlerin sonraki analizi için teknikleri tartışıyoruz. Bu sistem, çok çeşitli gen ürünlerinin fonksiyonel olarak tanımlanmasında faydalıdır.

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Bu iletişim kuralı için siteleri işleme eşleme pre-mRNA 3' ucu bir yöntemi açıklar.

A-seq2 ile kütüphane hazırlık sıralama 3' ucu

Büyük ölçekli gRNA kitaplıkları oluşturmak için yöntemleri basit, verimli ve maliyet-etkin olmalıdır. Biz gRNA kütüphaneler hedef DNA Enzimatik sindirim üzerinde dayalı üretim için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem CORALINA (kapsamlı gRNA Kütüphane üretimi kontrollü nükleaz faaliyetleri ile) pahalı özel Oligonükleotid sentezi için bir alternatif sunuyor.

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

Mikroskobik organizmaların genomik sıralama sırasında kontaminasyon büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. İşte, bir tardigrade tek bir örnekten genom genomik DNA tüm genom amplifikasyon olmadan bulaşma riskini en aza indirmek için olduğu kadar az 50 pg ile sıralamak için bir yöntemi göstermektedir.

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Biz Maya fizyon basit bastırıcı ekran protokolünde mevcut. Bu yöntem etkili, alkil-Alerjik ve kez tek bir genomik locus meydana gelen mutasyonlar için seçici değildir.  Protokol bir mutasyon veya bir uyuşturucu nedeniyle büyüme kusurları sıvı kültüründe hafifletmek bastırıcılarının yalıtmak için uygundur.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

Halka açık cDNA/ORF kaynaklarını kullanarak Drosophila'daki UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli inşası için bir yöntem olan CRISPR tabanlı modüler montaj (CRISPRmass) için bir protokol sunuyoruz. CRISPRmass, çeşitli plazmit kütüphanelerini düzenlemek için uygulanabilir.

UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli yapısı için CRISPR tabanlı modüler montaj

Bu makale, doku mimarisini korurken çeşitli transkriptomların yüksek çözünürlüklü haritalanmasını sağlayan Stereo-seq kullanarak formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku bölümlerinden konakçı, viral, fungal ve mikrobiyom RNA'sının kapsamlı uzamsal transkriptomik profilini çıkarmak için bir protokol sunmaktadır.

Stereo-seq ile Türden Bağımsız Transkriptomların Kapsamlı Uzamsal Profili

Keşfedin, yerel pazarlardan alınan Pasifik istiridyelerinden RNA kullanarak biyoteknolojik gen klonlama yöntemini. Kamuya açık referans dizileriyle karşılaştırma yaparak maliyetli dizilemeyi atlayabilir ve hızlıca cDNA kütüphanesi oluşturabilirsiniz.

Referansta bulunmadığı Pasifik Istiridyeleri neredeyse sıralı cDNA Kütüphanesi üretimi için bir converging stratejisi

Daha fazla video keşfet