Name: VirWaTest, su örnekleri virüslerin tespiti için bir nokta-of-kullanım yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Keşfedin VirWaTest yöntemiyle su örneklerinde enterik virüsleri tespit etme tekniğini. Bu taşınabilir ve uygun maliyetli yöntem, insani krizlerde su güvenliğini artırarak halk sağlığını korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VirWaTest bir araştırma projesi HıF tarafından finanse edildi (Insani yenilik fonları) ELHRA programı (geliştirme öğrenme & Insani yardım için araştırma). Yazarlar bu çalışmada nazikçe işbirliği yapan WASH ekipleri kabul eder. Ekvador numunelerin Analizi Oxfam Ecuador ve Dirección de araştırma de la Universidad de Las Americas tarafından finanse edildi (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas Barcelona Üniversitesi 'nde bir Serra-Hunter adam.

1. hazırlama ve paketleme
Not: ambalajlanabilir malzemeler/ekipmanlar Tablo 1' de listelenir. Proses kontrolü, konsantrasyon reaktifler, nüklik asit ekstraksiyon reaktifler ve algılama reaktifleri için gerekli reaktifler ele almak için eldiven kullanın. Nüklik asit ekstraksiyonu için gerekli reaktifleri işlemek için koruyucu gözlük takın.
<ol><li>Proses kontrolü
	<ol>
<li>MS2 bakteriyofaj hisse senedi kültürünü (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) içeren 1 x 1010 PFU/ml LABORATUVARıNDA ıso prosedürü 10705-1:199514' ü izleyerek hazırlayın.</li>
		<li>Sonra, 10 ml tüp içine 1 x 108 PFU içeren boru başına süspansiyon 10 μL kısım ve su 37 °c ' de Buharlaştırıcı izin. Su örneği başına bir tüp kullanın.</li>
		<li>Ayrıca, toplanan örnek başına 10 mL steril damıtılmış su içeren bir tüp hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Konsantrasyon reaktifler
	<ol>
<li>Preflocculated yağsız süt çözeltisi için (PSM), 5 10 L su örnekleri konsantre aşağıdaki miktarlarda kullanın.<ol>
<li>5 gr yağsız süt içeren plastik bir tüp hazırlayın.</li>
			<li>16,66 g deniz tuzları içeren bir fermuar Plastik çanta hazırlayın.</li>
			<li>500 mL damıtılmış su içeren plastik bir şişe hazırlayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PH ayarı için gerekli reaktifleri hazırlayın. PSM pH 'Sını ve 5 10 L su örneklerini ayarlamak için aşağıdaki miktarları kullanın.<ol>
<li>10 mL plastik boruya 5 gr sitrik asit 1-hidrat ekleyin. DIKKAT: göz ile temas ettiğinde sitrik asit ciddi irritasyona neden olur. Bu durumda, göz dikkatli bir şekilde su ile birkaç dakika durulayın. Eğer tahriş devam ederse, tıbbi tavsiye isteyin.</li>
			<li>10 mL plastik tüpüne 2 gr sodyum hidroksit koyun. DIKKAT: Sodyum hidroksit şiddetli cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir. Yutulması durumunda, ağzını durulayın. Kusma. Eğer gözler ile temas ederse, birkaç dakika su ile dikkatli bir şekilde durulayın. Sonra, tıbbi tavsiye isteyin.</li>
			<li>25 mL steril damıtılmış suyu plastik bir kabına koyun.</li>
			<li>Plastik bir kap içine steril distile su 50 mL koyun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Flocculation için kullanılan numune Klima poşeti hazırlayın, nükleik asitleri korumak için kullanılan koruyucu çözüm, ve nötralize poşet atılan su ve malzemeleri nötrleştirmek için. Test edilecek her 10 L su örneği için aşağıdaki tutarları kullanın.<ol>
<li>15 g deniz tuzları ve 8 g sitrik asit 1-hidrat bir fermuar plastik torba içine klima poşet koyun.</li>
			<li>2 ml liziz tampon (malzeme tablosu) ve 0,3 ml nüklik asit koruma ajanı (malzeme tablosu) 5 ml tüpüne ekleyin. Dikkat: Lysis tampon guanidin tiyosiyanat ve Triton X-100 içerir. Asit ile temas toksik gazı serbest bırakmaktadır ve yutulması, solunduğu veya deriyle temas ederse zararlı olur. Yutulması durumunda, ağzını durulayın. Kusma. Cilt ile temas ederse, bol su ile yıkayın. Sonra, tıbbi tavsiye isteyin. Nüklik asit koruma maddesi cilt ve göz tahrişine neden olur ve yutulması durumunda zararlı olur. Cilt veya gözler ile temas ederse, birkaç dakika boyunca bol su ile durulayın. Her durumda, özellikle yutulması ve iyi hissetme, tıbbi tavsiye isteyin.</li>
			<li>4 fermuar plastik torbalara 40 g deterjan tozu koyun. DIKKAT: Toz deterjan göz tahrişine neden olur. Eğer gözleri ile temas halinde, birkaç dakika için bol su ile durulayın. Tahriş devam ederse veya Yutulursa, tıbbi tavsiye isteyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Nüklik asit ekstraksiyon reaktifler
	<ol>
<li>50 μL manyetik parçacıklar (malzeme tablosu) ve 1 ml etanol 96% ' i 5 ml 'lik bir tüpün içine koyun ve bağlayıcı tamponu oluşturur. DIKKAT: manyetik parçacıklar tamponu, asitler veya ağır metal iyonlarıyla temas ettiğinde toksik gaz oluşturan ve yutulduğunda veya deriyle temas ettiğinde toksik olan sodyum azid içerir. Eğer yutulur veya cilt ile temas, bol su ile ağız veya cilt durulayın ve tıbbi tavsiye isteyin. Etanol son derece yanıcı bir sıvı ve buharı ve ciddi göz tahrişi neden olur. Isı, sıcak yüzeyler, kıvılcımlar ve diğer herhangi bir ateşleme kaynağından uzak tutun. Cilt veya gözler ile temas ederse, bol su ile durulayın. Büyük miktarlarda su Yutulması durumunda ve/veya solunması durumunda, temiz havaya dışarı gidin. Her durumda, tıbbi tavsiye isteyin.</li>
		<li>Ekleme 500 μL, 600 μL, ve 200 μL tampon 1, 2 ve 3, sırasıyla (malzeme tablosu), üç 2 ml tüpler yıkama. Dikkat: yıkama tamponları, solmuş veya yutulması ve cildi ve gözleri tahriş ederse zararlı olan guanidinyum tiyosiyanat ve guanidinyum klorür içerir. Asitler ile temas çok toksik gaz bültenleri. Eğer cilt veya gözler ile temas halinde, bol su ile durulayın. Yutulması durumunda, ağız bol suyla durulayın. Kusma. Her zaman tıbbi tavsiye isteyin.</li>
		<li>0,5 mL tüpüne 120 μL elüsyon tampon (malzeme tablosu) ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>HAdV ve MS2 algılama reaktifler Not: bir 8-kuyu termocycler kullanılırsa, Iki farklı nüklik asit ekstraksiyon reaksiyonları her PCR tahlil aynı anda analiz edilebilir. Tüm PCR teknolojileri için, 1,5 mL tüplerine molekül biyoloji suyu hazırlayın.<ol>
<li>
HAdV algılama
		<ol>
<li>10 μL 22,5 μM AdF ileri astar, 10 μL 22,5 μM AdR ters astar ve 5 μL 11,25 μM AdP prob (Tablo 2) içeren bir karışımı hazırlayın.</li>
			<li>2,5 bir tüp şeridi 1 ' den 8 ' e kadar boru karışımı μL ekleyin. Oda sıcaklığında kurutun, tüpleri kapatın ve onları ışıktan korunmaya devam edin.</li>
			<li>Kesme Strip iki şerit içine bölme: Tüpler 1-5 ve tüpler 6-8.</li>
			<li>Güçlendirilmiş HAdV bölgesinin nükvotit dizisini içeren DNA süspansiyonlarını seri olarak seyreltme hazırlayın. 1 x 105, 1 x 107ve 1 x 109 GC/ml tüplere 6-8 Içeren hava-kuru 1 μL süspansiyonlar. Not: astarları, sondayı ve havayı kurutulan süspansiyonları içeren tüpleri ışığa karşı korunur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
MS2 algılama
		<ol>
<li>10 μL 25 μm pecson-2F ileri astar, 10 μL 25 μM pecson-2R ters astar ve 2,5 μL 25 μM PecP-2 prob (Tablo 2) içeren bir karışımı hazırlayın.</li>
			<li>2,25 bir tüp şeridi 1 ' den 8 ' e kadar boru karışımı μL ekleyin. Oda sıcaklığında kurutun, tüpleri kapatın ve onları ışıktan korunmaya devam edin.</li>
			<li>Kesme Strip iki şerit içine bölme: Tüpler 1-5 ve tüpler 6-8.</li>
			<li>Adım 1.4.1.4 olarak devam edin ama bunun yerine MS2 için tasarlanmış standart bir süspansiyon kullanın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. viral konsantrasyon
Not: örnek toplama, reaktif hazırlama, Flocculation, flokların ya koleksiyonu ve atık imha prosedürleri sırasında her zaman eldiven kullanın. Reaktif hazırlama prosedürü sırasında koruyucu gözlük takın.
<ol><li>Örnek toplama
	<ol>
<li>Bir kapak ile düz bir alt kova 10 L su örneği toplayın. Her örnek için en az iki çoğaltır toplayın. Not: Pelet görselleştirmek için net kova kullanmak önemlidir. Su numunesi askıya alınan malzeme (örneğin, kum, yosun) içeriyorsa, tortu izin ve, daha sonra, yeni bir kova su süpernatant toplamak.</li>
		<li>Her su örneği için toplanan hacminin yanı sıra konum ve tahsilat tarihini de kaydedin.</li>
		<li>Bir kova desteği altında bir pil bağlı bir manyetik karıştırıcı koymak ve destek üzerine su örneği içeren kova yerleştirin. Not: taze bir yerde düz bir yüzey arayın ve doğrudan güneş ışığından su örnekleri içeren kova tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Reaktifler hazırlama
	<ol>
<li>
pH ayar reaktifleri
		<ol>
<li>Sitrik asit tozu ve sodyum hidroksit Pelet içeren tencere içine dökün 25 ve 50 mL distile su, sırasıyla.</li>
			<li>Sitrik asit ve sodyum hidroksit tamamen çözününceye kadar elle yavaşça sallayın. DIKKAT: suyu sodyum hidroksit pelletine dökmeyin. Bunun yerine, su üzerinde sodyum hidroksit Pellet dökün.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preflocculated yağsız süt
		<ol>
<li>Bir manyetik karıştırıcı üzerinde bir stand-up çanta yerleştirin ve içine damıtılmış su 500 mL dökün. Çanta içine karıştırma mıknatıs bırakın ve manyetik karıştırıcı açın.</li>
			<li>Bir deniz tuzu poşeti ve bir yağsız süt tüp içeriğini stand-up çantasına dökün ve onları çözmek için orta hızda 5 dakika karıştırın.</li>
			<li>PH 3,4 ile 3,6 arasında olduğundan emin olmak için bir Pasteur pipet kullanarak PSM çözümüne 3 mL sitrik asit ekleyin. PH gösterge şeritleri kullanılarak PSM çözeltisi pH 'Sını ölçün. PH 3,5 'e yaklaştıkça daha küçük miktarlarda sitrik asit ve sodyum hidroksit ekleyin.</li>
			<li>Manyetik karıştırıcı kapatın ve flokların ya görünür olduğundan emin olun. Flocs görselleştirmeye yardımcı olmak için bir el feneri kullanın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Flokülasyon
	<ol>
<li>Su içine karıştırma mıknatıs bırakın, maksimum hızda manyetik karıştırıcı ayarlayın ve açın. Karıştırma mıknatıs dönmeye başlar emin olun.</li>
		<li>Bir proses kontrol tüpüne 10 mL distile su ekleyin. Viral stok rehydrate ve suya çözüm dökmek için birkaç kez tüp tersine çevirin.</li>
		<li>Su içine bir örnek Klima poşet içeriğini dökün ve 5 dakika boyunca karıştırın.</li>
		<li>PH gösterge şeritleri kullanılarak su örneğinin pH değerini ölçün. PH 3,4 ve 3,6 arasında yatıyor emin olmak için su örneği için sitrik asit veya sodyum hidroksit birkaç damla ekleyin. PH 3,5 'e yaklaştıkça daha küçük miktarlarda sitrik asit ve sodyum hidroksit ekleyin.</li>
		<li>100 mL PSM çözüm 100 mL kapsayıcı kullanarak ekleyin.</li>
		<li>Kapağı ile kova mühür, minimum hızda manyetik karıştırıcı ayarlamak ve 8 h için karıştırma su bırakın.</li>
		<li>Manyetik karıştırıcı kapatın ve su hala en az 5 h için flokların ya yerleşmek izin vermek için izin verin.</li>
	</ol></li>
	<li>FLOC koleksiyonu
	<ol>
<li>Pipet kumandasının, iki pipetin ve plastik tüpten oluşan bir Sifonlama sistemi inşa ederek suyun flocs üzerinde boşaltma için su süpernatant Aspire.<ol>
<li>Pipet denetleyiciye 10 mL 'Lik bant ucu pipet takın. Sonra, Pipet ucunu plastik tüpe takın.</li>
			<li>10 mL 'Lik açık uçlu pipetin filtresini Cımbız kullanarak çıkarın ve pipeti plastik tüpe takın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Yere boş bir kova yerleştirin.</li>
		<li>Açık uçlu pipetin ucunu suya batırın. Flocs rahatsız önlemek için su yüzeyine yakın tutmak için emin olun. Su süpernatant bant-End pipet ulaşıncaya kadar aspirate.</li>
		<li>Plastik tüpü teyp-uç pipete bağlı olarak çimdik ve pipetten ayırın.</li>
		<li>Tüpü boş bir kova içine yerleştirin. Boş kova su akışını izin tüp üzerindeki basıncı bırakın.</li>
		<li>Su seviyesini karıştırma mıknatıs ulaşmak ve kova uzak pipet taşımak üzere olduğunda su akışını durdurmak için plastik tüp çimdik.</li>
		<li>Flokların ya pelletini ve 500 ml stand-up plastik torba içine dökün kova sallayın. Flokların ya 1 h daha fazla razı izin verin.</li>
		<li>50 ml 'lik pipet ve manuel pipet kontrolörü kullanarak su süpernatant dikkatle Aspire, flocs rahatsız kaçınarak.</li>
		<li>Bir 100 ml pipet kullanarak flokların ya aspirate ve 50 ml dereceli santrifüjli tüp aktarmak. Örnek konsantre son hacminin aşağı Not ve 1 mL bir Pasteur pipet kullanarak, koruyucu çözüm içeren 5 mL tüp aktarın. Not: konsantre numunenin son hacminin mümkün olduğunca doğru ve kayıtlı olarak ölçülmesi için Santrifüjlü tüpün mezun olması önemlidir.</li>
		<li>Alanda nüklik asit ekstraksiyon gerçekleştirin. Alternatif olarak, virüs içeren koruyucu solüsyonu 15 güne kadar 20-30 °C ' de saklayın veya daha fazla analiz için bir referans laboratuvarına sevk etme.</li>
	</ol></li>
	<li>Atık imha ve malzeme yeniden kullanımı
	<ol>
<li>Bir nötralize Ajan poşet içeriğini atılan su içeren kova ekleyin. Su karıştırın ve sonra, 30 dakika boyunca hala bırakın.</li>
		<li>Tedavi edilen suyu genel atık olarak atın.</li>
		<li>Pipetleri ve plastik tüpü kovanın içine yerleştirin. Kova su ile doldurun ve bir nötralize Ajan poşet içeriğine dökün.</li>
		<li>Onları sterilize etmek için en az 30 dakika yıkayın ve kalan nötralizasyon ajanı kaldırmak için bol temiz su ile durulayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. nüklik asit ekstraksiyonu
Not: eldivenleri kullanın ve nüklik asit ekstraksiyon prosedürü sırasında her zaman koruyucu gözlük takın.
<ol><li>
Manyetik pipet çalışması
	<ol>
<li>Ekstraksiyon yapmadan önce manyetik pipetin çalışmasını tanıyın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nüklik asit ekstraksiyon
	<ol>
<li>Ekstraksiyon için gerekli reaktifler içeren tüpleri, soldan sağa doğru: bağlayıcı tampon, yıkama tamponları ve elüsyon tampon olarak düzenleyin. Numunelerin sayısına göre uygun sayıda tüp ayarlayın veya analiz ediliyor çoğaltır.</li>
		<li>1 mL örnek konsantresi, tek kullanımlık Pasteur pipet kullanarak bağlayıcı tamponu içeren tüpe aktarın. Solüsyonu homojenize etmek için tüp 8X ' i 10X 'a çevirin.</li>
		<li>Çözümü, Güneş enerjili orbital ya da el ile kullanarak sürekli karıştırma sırasında oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kulkarın.</li>
		<li>Manyetik pipet ve üç yıkama tamponları için yeniden kullanılabilir temiz bir uç kullanarak manyetik parçacıklar toplayın.</li>
		<li>Manyetik parçacıkları 500 içeren tüpün içine bırakın. 30 s ucu ile çözümü yavaşça sallayarak yıkayın ve onları toplayın.</li>
		<li>Manyetik parçacıkları, 600 μL yıkama tamponu 2 içeren tüpüne aktarın. 30 s ucu ile çözümü yavaşça sallayarak yıkayın ve onları toplayın.</li>
		<li>Manyetik parçacıkları, 200 μL yıkama tamponunun 3 ' ü içeren tüpüne aktarın. 30 s ucu ile çözümü yavaşça sallayarak yıkayın ve onları toplayın.</li>
		<li>Manyetik parçacıkları, elüsyon tamponunu içeren tüpün içine bırakın ve ucu atın.</li>
		<li>Güneş enerjili orbital kullanarak sürekli karıştırma sırasında çözüm oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kulkarın. Not: manyetik parçacıkların elüsyon tamponunun içinde karıştırma önemli bir adımdır. Bir orbital eksikliği durumunda, sürekli el kuluçbe süresi boyunca karıştırın.</li>
		<li>Manyetik Pipetteki ucu yeni bir tane ile değiştirin ve manyetik partikülleri elüsyon tampondan toplayın. Moleküler algılama yöntemlerine müdahale ettikleri için manyetik partikülleri elüsyon tamponunu tamamen kaldırtığınızdan emin olun.</li>
		<li>Ucunu ona bağlı parçacıklar ile atın. PCR analizine devam edin, elüsyon tamponunu bir referans laboratuvarına sevk edin veya daha fazla analiz için ek tamponu 4 °C ' de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. pil ile çalışan sekiz-tüp gerçek zamanlı termocycler ile viral algılama
Not: nüklik asit algılama prosedürü sırasında eldiven kullanın ve her zaman koruyucu gözlük takın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için yeni bir PCR deneyi yapılırken eldivenleri yenilerini değiştirin.
<ol><li>
HAdV nicel PCR
	<ol>
<li>2, 4 ve 5 numaralı tüplere 14 μL çekirdeksiz su ekleyin.</li>
		<li>1-5 tüplere 4 μL PCR karışımı ekleyin.</li>
		<li>Örnek A 'dan tüp 1 ' e ve 14 μL 'den Tüp 3 ' e örnek B 'ye 14 μL nükleik asit ekstraksiyonu ekleyin.</li>
		<li>2 μL ayıklanan nükleik asitleri, örnek A 'dan tüp 2 ' ye ve 2 μL 'ye örnek B 'den tüp 4 ' e ekleyin. Beş-tüp şeridi kapatın.</li>
		<li>6, 7 ve 8 numaralı tüplere 14 μL çekirdeksiz su ekleyin.</li>
		<li>6, 7 ve 8 numaralı tüplere bu karışımı 4 μL ekleyin ve kapatın.</li>
		<li>Her iki şerit termocycler koyun ve uygun çalıştırmak seçin (Tablo 3).</li>
		<li>Su tüpünü atın ve elde edilen nüklrik asidi dondurucuda, mümkünse ya da yoksa, ikinci bir testin gerçekleştirilmesi gerektiğinde ışığa karşı korunan taze bir yerde tutun.</li>
		<li>Mikropipetler, raf, çalışma malzemesi ve tüm malzemeyi düzgün bir nüklik asit temizleyici ile temizleyin ve kullanılan ucu, eldivenleri ve tüpleri içeren plastik torbası atın. DIKKAT: Nüklik asit çıkarıcı çok yanıcı bir sıvı ve buharıdır. Sprey sis nefes ve gözler veya cilt ile sıvı herhangi bir temas önlemek etmeyin. Aksi takdirde, hemen bol su ile durulayın ve tıbbi tavsiye isteyin.</li>
		<li>Sonuçları toplayın ve elde edilen verileri analiz edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MS2 nicel PCR
	<ol>
<li>2, 4 ve 5 numaralı tüplere 14 μL çekirdeksiz su ekleyin.</li>
		<li>4 μL PCR karışımı ekleyin ve 0,5 μL ters transkriptaz enzimi için tüpler 1-5.</li>
		<li>Örnek A 'dan tüp 1 ' e ve 14 μL 'den Tüp 3 ' e örnek B 'ye 14 μL nükleik asit ekstraksiyonu ekleyin.</li>
		<li>1 μL ayıklanan nükleik asitleri, örnek A 'dan tüp 2 ' ye ve 1 μL 'ye örnek B 'den tüp 4 ' e ekleyin. Beş-tüp şeridi kapatın.</li>
		<li>15,5, 5, 6, 7 ve 8 numaralı tüplere atom içi ücretsiz su ekleyin ve kapatın.</li>
		<li>4 μL PCR mix ve 0,5 μL ters transkriptaz enzim 6, 7 ve 8 Tüpler ekleyin.</li>
		<li>Her iki şerit termocycler koyun ve uygun çalıştırmak seçin (Tablo 3).</li>
		<li>4.1.10 için 4.1.8 adımlarda açıklandığı gibi devam edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>The Sphere Project. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Sphere+Project%3A+Humanitarian+Charter+and+Minimum+Standards+in+Humanitarian+Response%22">The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response</a>. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).</li>
<li>Bartram, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBartram%2C+J+%22Water+Safety+Plan+Manual%3AStep-by-step+risk+management+for+drinking-water+suppliers%22">Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+Drinking-water+Quality%22">Guidelines for Drinking-water Quality</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%2225+Years+Progress+on+Sanitation+and+Drinking+Water%22">25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).</li>
<li>Girones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogens+in+water+-+The+pros+and+cons+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques.</a> Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).</li>
<li>Rodriguez-Manzano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+and+new+fecal+indicators+and+pathogens+in+sewage+treatment+plants%2C+microbiological+parameters+for+improving+the+control+of+reclaimed+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water.</a> Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).</li>
<li>Puig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+adenoviruses+and+enteroviruses+in+polluted+waters+by+nested+PCR+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).</li>
<li>Carter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterically+infecting+viruses%3A+Pathogenicity%2C+transmission+and+significance+for+food+and+waterborne+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection.</a> Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).</li>
<li>Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Documenting+the+epidemiologic+patterns+of+polyomaviruses+in+human+populations+by+studying+their+presence+in+urban+sewage%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li>
<li>Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+using+human+adenovirus+as+a+viral+water+quality+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator.</a> Water Research. 96, 308-326 (2016).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).</li>
<li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ISO+10705-1%3A1995%3A+Water+quality+-+Detection+and+enumeration+of+bacteriophages+-+Part+1%3A+Enumeration+of+F-specific+RNA+bacteriophages%22">ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages</a>. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).</li>
<li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel%2C+Mytilus+edulis%3A+the+first+Scandinavian+report%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).</li>
<li>Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR+for+determining+the+infectivity+of+bacteriophage+MS2+upon+inactivation+by+heat%2C+UV-B+radiation%2C+and+singlet+oxygen%3A+Advantages+and+limitations+of+an+enzymatic+treatment+to+reduce+false-positive+results%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).</li>
<li>Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+of+infectious+human+adenoviruses+and+JC+polyomaviruses+in+water+by+immunofluorescence+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay.</a> Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).</li>
<li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses%2C+bacteria+and+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

VirWaTest yöntemi, deneyimli olmayan kullanıcılar tarafından kullanım noktasında virüs ve nüklik asit ekstraksiyonu su örneklerinden konsantrasyonu sağlar. Bu, uygun maliyetli, hızlı ve basit bir protokoldür. Konsantrasyon, düşük pH ve yüksek iletkenlik koşullarında yağsız süt proteinlerinin, virüslerin adsorbe olduğu flokların ya içine toplu hale getiren, yağsız süt kullanılarak organik flocculasyon ilkesine dayanır. Ne zaman flokların ya sediment, onları toplamak kolay, 10 L su konsantre mümkün hale, geleneksel ultrace...

Herhangi bir insani acil durum ilk aşamalarında, temiz su temini, sanitasyon ve hijyen erişim etkilenen bu hayatta kalmak için önemlidir. Bu nedenle, su kalitesini izlemek suyun kaynaklı salgınları önlemek için bir önceliktir. Bu kontamine su sıklıkla hastalıkların kökeni bilinmektedir, ama genellikle Hepatit E virüsü gibi viral salgınlar kaynaklarını belirlemek zordur (HEV), konvansiyonel laboratuvar yöntemlerinin kullanılabilirliği bile. Su kalitesinin kontrolü fib1,2,3,4' ün ölçülmesini temel alır. Ancak, fib yokluğunda ve Rotavirüs (RoV), norovirüs (Nov) veya HEV5,6gibi viral su kaynaklı patojenlerin varlığı arasında hiçbir korelasyon olmadığı konusunda kapsamlı olarak belgelenmiştir. Böylece, FıB 'ye dayanan su kalitesi kriterlerinin kullanılması, su kaynaklı viral patojenlerin varlığı ile ilgili risklerin hafife almasına neden olabilir. İnsan adenovirüsler (hadv) veya spesifik patojenler gibi gösterge virüslerinin gözetimi, viral patojenlere maruz kalmanın tanımlanması ve insan enfeksiyonunun potansiyel kaynağını tanımlamak için yararlı olacaktır7,8, 9,10 ve sanitasyon tedbirlerinin etkinliğini doğrulamak için11.
Bugüne kadar, bu senaryolarda virüslerin tespiti yetenekli personel ve karmaşık lojistik üzerinde dayanılır. VirWaTest (virwatest.org), kullanım noktasında su örneklerinden gelen virüslerin konsantrasyonu ve daha sonra tespiti için basit, uygun maliyetli ve taşınabilir bir yöntemin geliştirilmesine yöneliktir.
Virüs konsantrasyonu, 10 L su numunelerinin organik flocculasyonu ilkesine dayanmaktadır ve bu da virüsler daha küçük hacimlerde12,13' te kurtarılır. Flokların ya toplanır ve virüsler yapışıklıkların bir tampon eklenir ve onlar daha fazla değil, oda sıcaklığında saklanan nüklik asitler bozulması önler 2 hafta.
Nükle asit ekstraksiyon yöntemi, nüklik asitlerin adsoryat ettiği manyetik partiküllerin kullanımına dayanır. Onlar bir yıkama tampondan diğerine transfer edilebilir ve sonunda parçacıklar iliştirmek için bir manyetik pipet kullanarak elüsyon tampon içine. Viral nüklik asit süspansiyonları, PCR bazlı moleküler yöntemler kullanılarak tespit edilebilecek bir referans laboratuvarına sevk edilebilir. Her nükleik asit ekstraksiyon için, iki farklı miktarlarda numunenin kökeni enzimatik inhibisyonu dışarı kural test edilir. Alternatif olarak, minimum ekipman kullanılabilirliği ile, PCR testleri kullanım noktasında çalıştırılabilir. Tüm işlem bir güç kaynağından bağımsız olarak gerçekleştirilecek şekilde tasarlanmıştır (Şekil 1).
İnsan tarafından atılan ve yüksek konsantrasyonlarda Atıksu örneklerinde bulunan HAdV algılamak için nicel bir PCR tahlil, kullanım noktasında çalışacak şekilde adapte edilmiştir. HAdV insan dışkı viral göstergeler olarak kullanılır. MS2 bakteriyofaj için bir PCR de MS2 bu yana proses kontrolü olarak VirWaTest kullanılır adapte edilmiştir. Yöntem ilgi herhangi bir virüs tespiti için özelleştirilmiş olabilir.
Kalkınma sonrası, VirWaTest yöntemi, gerçek durumlarda protokolün uygulanması hakkında geribildirim sağlayan Orta Afrika Cumhuriyeti (RCA) ve Ekvador iki farklı ayarlarında kullanıcılar tarafından uygulandı.
Bizim bilginiz için, bu kullanım noktasında virüslerin konsantrasyonu ve algılanmasını sağlayan ilk işlemdir, herhangi bir güç kaynağı bağımsız, büyük ekipman, ve donma/soğutma koşulları. Sağlam sonuçlar elde etmek için her bir su örneğinin iki çoğaltır toplamak için tavsiye edilir.

<table><tbody><tr><td>5x SICAK YANGINPol Probu qPCR Mix Plus (ROX)</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-14-00001</td>, <td>Solis Biodyne'in 5x HOT FIREPol Probu qPCR Mix Plus (qPCR Karışımı), 50 Reaksiyon</td></tr><tr><td>Kapaklı 8 Mikrotüp Şeritler</td><td>dD Biolab</td><td>840637</td><td>Düşük Profilli, İnce Duvarlı, Kantitatif ve Kalitatif PCR</td></tr><tr><td>Pilleri ve Manyetik Karıştırıcı GenIUL için Güç Adaptörleri</td><td></td> için Uyarlanmıştır <td>900011674</td><td>12V araba gücü içerir adaptör</td></tr><tr><td>Kova Desteği</td><td>GenIUL</td><td>900011648</td><td>Alüminyum destek</td></tr><tr><td>Kovası, 10 L</td><td>Cater4You</td><td>10LTR</td><td>Polipropilen, Kurcalamaya Dayanıklı, Berrak renkli</td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpü, 50 mL</td><td></td><td>LabBox CTSP-E50-050</td><td>Polipropilen, Steril, Dereceli, Etekli</td></tr><tr><td>Sitrik Asit 1-Hidrat, 500 g</td><td>PanReac AppliChem</td><td>1410181211</td><td>Saf, İlaç Sınıfı, 1 Kilogram</td></tr><tr><td>Şeffaf PET Şişe</td><td>LabBox</td><td>FPET-500-088</td><td>Şeffaf Renk, PET, Kapak Dahil Değildir</td></tr><tr><td>Difco Yağsız Süt, 500 g</td><td>Becton Dickinson</td><td>232100</td><td>Susuz</td></tr><tr><td>DNA/RNA Kalkanı, 250 mL</td><td>Zymo Research</td><td>R1100-250</td><td>DNA/RNA Koruma Ortamı, 250 mL</td></tr><tr><td>Easy9 Pipet Kontrol Cihazı</td><td>LabBox</td><td>EAS9-001-001</td><td>0.3 & mu; m filtre, 0,1 ila 100 mL arası pipetler, Otoklavlanabilir silikon pipet tutucu</td></tr><tr><td>Eppendorf Tüpü, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030121023</td><td>Polipropilen, Safe-Lock</td></tr><tr><td>Eppendorf Tüpü, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>Polipropilen, Safe-Lock</td></tr><tr><td>Eppendorf Tüpü, 5 mL</td><td>dD Biolab</td><td>999542</td><td>Polipropilen, Steril,</td></tr><tr><td>Dereceli Etanol %96 V/V, 1 L</td><td>Panreac AppliChem</td><td>361085-1611</td><td>UV, IR&nbsp; ve HPLC</td></tr><tr><td>Laboratuvar Cımbızları</td> için <td>LabBox</td><td>FORS-007-002</td><td>İnce, Kavisli Uçlu, L= 120 mm</td></tr><tr><td>Manyetik Karıştırıcı</td><td>GenIUL</td><td>900017000</td><td>Pille Çalışan</td></tr><tr><td>Marker</td><td>dD Biolab</td><td>929203</td><td>Siyah, Ekstra İnce Uç, Suya Dayanıklı, Hızlı Kuruyan, Plastik ve Cam Eşyalar</td></tr><tr><td>İçin Mikrotüpler için Mikro Rota-Rack</td><td>dD Biolab</td><td>37782</td><td>4 Modül, U x G x Y= 208 x 100 x 100 mm</td></tr><tr><td>Mini8 Gerçek Zamanlı PCR Döngüleyici</td><td>Coyote Biosciences, Çin</td><td>Mini-8</td><td>Taşınabilir, 12V Güç Kaynakları veya Harici Pillerle Çalışır, İki Kanal, 8 Tüp Kapasitesi</td></tr><tr><td>NucliSens Lysis Buffer</td><td>Biomerieux</td><td>200292</td><td>48 İzolasyona kadar Reaktifler, Ortam Sıcaklığında Saklayın</td></tr><tr><td>Açık Uçlu Serolojik Pipet, 10 mL</td><td>Deltalab</td><td>900136N</td><td>Steril, Ayrı Ayrı Sarılmış (Kağıt/Plastik)</td></tr><tr>PET <td>Şişeler İçin</td>PE <td>Vidalı Kapak PP28</td><td>LabBox</td><td>TP28-004-020</td></tr><tr><td>pH Gösterge Şeridi</td><td>LabBox</td><td>WSPH-001-001</td><td>Aralık pH 2.8 ila pH 4.4, Paket Başına 50 Şerit</td></tr><tr><td>Plastik Test Tüpü</td><td>Quimikals</td><td>300913</td><td>Kapak İçeriği</td></tr><tr><td>Polietilen Pastör Pipet LabBox</td><td></td><td>PIPP-003-500</td><td>Dereceli, 7 mL Toplam Hacim, Vidalı Kapaklı Steril</td></tr><tr><td>Olmayan Polipropilen Vidalı Şişe, 150 mL</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td>Vidalı kapak, Steril, 100 mL'ye kadar dereceli</td></tr><tr><td>Vidalı Kapaklı Polipropilen Vidalı Matara, 60 mL</td><td>Deltalab</td><td>409526G</td><td>Vidalı kapak, Steril, 50 mL'ye kadar</td></tr><tr><td>Dereceli Toz Toz Deterjan</td> <td>-</td><td></td> <td>Çamaşır yıkamak için Normal Toz Sabun</td></tr><tr><td>Manyetik Karıştırıcı</td><td>GenIUL</td> <td>için Güç Kabloları900011692</td><td>Piller ve manyetik karıştırıcılar arasındaki bağlantı</td></tr><tr><td>QuickPick Manyetik Alet</td><td>BioNobile</td><td>24001</td><td>Manyetik parçacıklar için el aleti</td></tr><tr><td>Kutuda QuickPick İpuçları</td><td>BioNobile</td><td>24296</td><td>RNaz İçermeyen, Otoklavlanmış, 96 Ünite</td></tr><tr><td>QuickPick XL gDNA Manyetik Parçacıklar</td><td>BioNobile</td><td>SN51100</td><td>3.2 mL</td></tr><tr><td>Deniz</td><td>Tuzları Sigma-Aldrich</td><td>S9883-500G</td><td>Okyanus suyunun çözünmüş tuzlarının bileşimine çok benzeyen yapay bir tuz karışımı</td></tr><tr><td>Silikon Boru</td><td>LabBox</td><td>SILT-006-005</td><td>5 Metrelik Rulo, İç&nbsp; &oslash; x Dış&nbsp; &oslash;= 6 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit Peletler, %98,5 - 100,5</td> <td>VWR Kimyasalları</td><td>28244295</td><td>Peletler, 1 Kg</td></tr><tr><td>Güneş Döner Platform</td><td>SOL-EXPERT Grubu</td><td>70020</td><td>Akrilik Plaka, 10 RPM, 300 Grama Kadar Destekler</td></tr><tr><td>SOLIScript 1 Adımlı Prob Kiti</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-57-00250</td>, <td>Solis Biodyne'in 5x Tek Adımlı Prob Karışımını (qPCR Karışımı) ve 40x Tek Adımlı SOLIScript Karışımını (Ters Transkriptaz Enzimi) İçerir, 250 Reaksiyon</td></tr><tr><td>SPEEDTOOLS RNA Virüs Ekstraksiyon Kiti</td><td>BioTools</td><td>21.141-4197</td><td>BioTools'un BAW tamponunu (yıkama tamponu 1), BAV3 tamponunu (yıkama tamponu 2 ve 3) ve BRE tamponunu (elüsyon tamponu) içerir.</td></tr><tr><td>SpinBar Okhaedral Karıştırma Mıknatısı</td><td>dD Biolab</td><td>045926</td><td>Pivot Halkası, L x&nbsp; &oslash; = 38 x 8 mm, Mavi</td></tr><tr><td>Bant Uçlu Serolojik Pipet, 10 mL</td><td>Deltalab</td><td>PN10E1</td><td>Steril, Ayrı Ayrı Sarılmış (Kağıt/Plastik)</td></tr><tr><td>Bant Uçlu Serolojik Pipet, 50 mL</td><td>Deltalab</td><td>900043</td><td>Steril, Ayrı Ayrı Sarılmış (Kağıt/Plastik)</td></tr><tr><td>Termi-DNA-Tor - Nükleik Asit Sökücü</td><td>BioTools</td><td>22001-4291</td><td>Malzeme ve yüzeylerden nükleik asitlerin, bakterilerin, mantarların ve mikoplazmanın uzaklaştırılması, 450 mL</td></tr><tr><td>Su Moleküler Biyoloji Reaktifi, 1L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td>Nükleaz ve Proteaz İçermez, 0.1 & mu; m Filtreli</td></tr><tr><td>Whirl-Pak Torba, 540 mL</td><td>Deltalab</td><td>200361</td><td>Sabit alt</td></tr><tr><td>Fermuarlı Kilit Düz Çanta</td><td>LabBox</td><td>BZIP-080-100</td><td>Polietilen, U x G= 120 x 80 mm</td></tr></tbody></table>

virwatest, su örnekleri virüslerin tespiti için bir nokta-of-kullanım yöntemi

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

İnsanlar ve hayvanlar tarafından atılan virüsler su kaynaklarını kirletebilir ve bu su içme, gıda sulama, yıkama, vb. için kullanıldığında insan sağlığına risk teşkil edebilir. Klasik dışkı bakteri göstergesi her zaman viral patojenlerin varlığını kontrol etmez, böylece viral patojenlerin ve viral göstergelerin tespiti, özellikle insani senaryolar ve bölgelerde risk azaltma önlemlerinin benimsenmesi için geçerlidir. su kaynaklı viral salgınlar sık görülür.
Şu anda, dışkı göstergesi bakterilerinin (FıB) ölçülmesine izin veren çeşitli ticari testler, kullanım noktasında test etmek için kullanılabilir. Ancak, bu tür ticari testler virüslerin algılanması için kullanılabilir değildir. Çevresel su örneklerindeki virüslerin algılanması, birkaç litreye daha küçük hacimlere yoğunlaşmasını gerektirir. Dahası, bir kez konsantre, virüslerin tespiti nüklenik asit ekstraksiyon ve moleküler algılama (örn., viral genomların polimeraz zincir reaksiyonu [PCR]-based) gibi yöntemlerle dayanır.
Burada açıklanan yöntem, 10 L su numuneleri virüslerin konsantrasyonu yanı sıra, basit ve taşınabilir ekipman ile kullanım noktasında viral nüklerik asitlerin çıkarılması sağlar. Bu, çeşitli virüsler için kullanım noktasında su örneklerinin test edilmesini sağlar ve insani senaryolardaki yanı sıra, donanımlı bir laboratuvarda mevcut olmayan herhangi bir bağlamda yararlıdır. Alternatif olarak, yöntem, su numuneleri ve daha fazla analiz için oda sıcaklığında bir laboratuvarda konsantre nakliye mevcut virüs konsantre sağlar.

Yöntem geliştirme
Bu prosedür GenIUL ve Oxfam ıntermón işbirliği ile su ve gıda virüsler Kontaminants Laboratuvarı geliştirilmiştir. Bu üç farklı adımda oluşur. Birincisi, viral parçacık konsantrasyonu, daha önce12,17,18açıklanan bir yağsız süt flokülasyon yöntemi bir adaptasyon olduğunu. Orijinal Yöntem bir güç kaynağı...

Burada VirWaTest sunuyoruz, hangi kullanım noktasında su örneklerinden virüslerin konsantrasyonu ve tespiti için basit, uygun fiyatlı ve taşınabilir bir yöntemdir.

VirWaTest, su örnekleri virüslerin tespiti için bir nokta-of-kullanım yöntemi

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Enterik virüsler çoğunlukla yeraltı suyu, durgun su, akarsular, nehirler ve r su gibi farklı su rezervuarlarında bulunur. Onlar sağlık riskleri ile ilişkili ve insanlarda enfeksiyonlar sorumludur. Enterik virüsler genellikle gastroenteritneden ve çoğunlukla dışkı-oral rota yoluyla bulaşır.Diğer su kaynaklı hastalıklar, özellikle gebelerde hepatit E ile ilgili önemli mortalite ile hepatit A virüsü ve hepatit E virüsleri ile akut hepatite neden olur. İnsani bağlamlar için önerilen su kalitesinin izlenmesi için gerçek protokoller, dışkı kontaminasyonunun bir göstergesi olarak E.Coli gibi bakterileri tutmak için tasarlanmıştır. Ama zaten birçok aktivasyon süreçlerine daha dirençli virüsler gibi diğer mikroorganizmalar ile herhangi bir korelasyon olduğu bilinmektedir.Şimdiye kadar, insani kriz ortamlarında virüslerin tespiti, mevcut protokollerin bu bağlamların koşullarına uyarlanması ve örneklerin virüslerin moleküler tespiti için referans laboratuvarlara gönderilerek gerçekleştirilmiştir. Halk sağlığı risklerini azaltmak, salgınları önlemek ve insani müdahalelerin verimliliğini artırmak için görüş açısından viral patojenleri ve viral göstergeleri saptamak için yöntemlere ihtiyaç vardır. Biz üç adıma ayrılır 10 litrelik su örneklerinde virüslerin tespiti için bir yöntem öneriyoruz: Viral konsantrasyon, nükleik asit çıkarma, ve viral algılama.Tüm bu adımlar şu anda laboratuarımızda kullanılmakta olan yöntemlerden uyarlanmıştır ve güç kaynağı ve dondurucu bağımlıları üreten taşınabilir reaktifler ve ekipmanlar kullanılarak görüş noktasında gerçekleştirilebilir. Ayrıca, gerektiğinde referans laboratuvarlara sevkiyat için nükleik asitlerin stabilitesini garanti etmek için metoduna koruyucu bir çözelti eklenmiştir. Önerdiğimiz yöntem VirWaTest olarak adlandırılır ve GenIUL ve Intermon Oxfam işbirliği ile geliştirilmiştir.Başlamadan önce, test edilecek numune sayısı reaktifler ve malzeme hazırlanması için dikkate alınmalıdır. Temsili sonuçlar elde etmek için her su numunesinin iki kopyasını toplaması önerilir. Uygun miktarda malzeme varsa, aynı anda çeşitli numuneler test edilebilir.Reaktifler ve malzemeler taşınmadan önce hazırlanmalı ve paketlenmelidir veya yöntemin gerekli olduğu yere sevk edilmelidir. Paketlenmeli malzemelerin ve küçük ekipmanların listesi tablo birde açıklanmıştır. İlgili ISO yöntemini izleyerek her su numunesine bir proses kontrolü olarak eklenecek bir bakteriyofaj MS2 stoku hazırlayın.Daha sonra önceden 10 mL tüpler halinde yapılmış 10 ila 10 platformlama üniteleri içeren bir süspansiyon 10 mikrolitre dağıtmak ve su kurumasını bekleyin. Su numunesi başına bir tüp gerekli olacaktır. Ayrıca, toplanan numune başına 10 mL steril distile su içeren bir tüp hazırlayın.Önceden floküle yağsız süt çözeltisi için, yağsız süt içeren bir tüp, deniz tuzu içeren bir fermuarlı plastik torba ve distile su içeren plastik bir şişe hazırlayın. pH ayarı için, sitrik asit içeren bir tüp, sodyum hidroksit içeren bir tüp ve 25 ve 50 mL'lik distile su içeren iki plastik kap hazırlayın. Test edilecek her su numunesi için, deniz tuzları ve sitrik asit bir fermuarplastik torbaya ekleyerek bir klima poşeti hazırlamak ve 5 mL tüp için lysis tampon ve nükleik asit koruyucu ekleyerek bir koruyucu çözelti.Son olarak, dört fermuarlı plastik torbalar güç deterjan ekleyerek, dört nötralize poşet hazırlamak. Ayıklanacak her su numunesi için, manyetik parçacıklar ve etanol içeren bir beş mL tüp ve sırasıyla bir, iki ve üç yıkama tamponları bir, iki ve üç 200 mikrolitre içeren üç 2 mL tüp ve elüsyon tamponu içeren bir tüp hazırlayın. Newell termcycler kullanılıyorsa, her PCR testinde aynı anda iki farklı nükleik asit ekstraksiyonu analiz edilebilir.Tüm PCR tahlilleri için moleküler biyoloji suyu hazırlayın. Protokolde açıklanan hacimlere ve konsantrasyonlara göre her hedef virüs için iki astar ve bir kanıt içeren karışımlar hazırlayın. Her virüs için, bir tüp tepsisi bir ila sekiz tüpler içine belirtilen hacimleri ekleyin.Şeridi kesin, iki şerit halinde böl. 1'den 5'e, tüpler 6'dan 8'e kadar. Her virüs için, 10 ila 5, 10-7 ve 10-9 içeren hava kuru DNA süspansiyonları ve bilinen kopyaları önceden tüpler altı, yedi ve sekiz haline getirtılmıştır.Bu konsantrasyon protokolü, düşük pH ve yüksek iletkenlik durumunun yağsız süt proteinlerini virüslerin absorbe ettiği floclar halinde organize etmeye iten organik flokülasyon prensibine dayanır. Flocs yerleştikten sonra, kolayca toplanabilir. Bir kapak ile sağlanan düz alt kova bir 10 litrelik su örneği toplamak.Bir borudan toplanıyorsanız, su toplamadan önce birkaç saniye boyunca su çalışmasına izin verin. Peletleri görselleştirmek için berrak kovalar kullanmak önemlidir. Doğrudan güneş ışığından uzak taze bir yerde düz bir alan arayın Kova desteği altında bir pil bağlı bir manyetik karıştırıcı koyun ve her destek su örneği içeren kova yerleştirin.Sitrik asit ve sodyum hidroksit yeniden düşünün ve tamamen çözülene kadar sallayın. Bir stand-up çanta içine distile su 500 mLs dökün ve manyetik karıştırıcı üzerine çanta yerleştirin. Bir deniz tuzu poşetve bir yağsız süt tüpü içeriğini ekleyin ve orta hızda beş dakika karıştırın.Sitrik asit ve sodyum hidroksit kullanarak floküle yağsız sütün pH'ını 3,4 ile 3,6 arasında bir pH'ya ayarlayın. Manyetik karıştırıcıyı kapatın ve flocların görünür olduğundan emin olun. Bir el feneri flocs görselleştirme yardımcı olabilir.Suya karıştıran bir mıknatıs bırakın. Manyetik karıştırıcıyı maksimum hızda ayarlayın ve açın. Proses kontrollü bir tüpe 10 mL distile su ekleyin.Birkaç kez ters ve suya çözelti dökün. Suya bir örnek klima poşet içeriğini dökün ve beş dakika karıştırın. 3.4 ile 3.6 arasında olması gereken su örneğinin pH'ının olduğundan emin olun.Gerekirse pH'ı ayarlayın. Önceden floküle yağsız süt çözeltisi 100 mLs ekleyin, kapağı ile kova mühür ve en az hızda sekiz saat karıştırarak su bırakın. Sekiz saat sonra manyetik karıştırıcıyı kapatın ve flocların en az beş saat daha yerleşmesine izin verin.Bir pipet denetleyicisi, plastik bir tüp ve pipet ler bir çift kullanımına dayalı bir sistem ile, kova alt flocs rahatsız değil dikkat, supernatant atın. Su seviyesi karıştırma mıknatısulaşmak üzere yken, su akışını durdurmak için plastik tüp sıkmak ve kova pipet uzak hareket. Flocs resuspend ve bir stand-up plastik torbaya dökün kova çalkalayın.Flocs bir saat daha yerleşmek için izin verin. Flocs rahatsız önlemek bir pipet kullanarak su supernatant dikkatle aspire. Bir pipet kullanarak flocs aspirate ve konik bir tüp içine aktarın.Numune konsantresinin son hacmini not edin ve koruyucu çözeltiiçeren bir tüpe 1 mL aktarın. Süspansiyon ya alanında nükleik asit ekstraksiyon gerçekleştirmek için kullanılabilir, ya da daha fazla analiz için bir referans laboratuvara gemi. Flocs toplarken atılan su bertaraf edilmeden önce tedavi edilmelidir.Atılan suyu içeren kovaya nötralize edici bir madde poşetinin içeriğini ekleyin. Suyu karıştırın ve otuz dakika hareketsiz bırakın. Daha sonra arıtılmış suyu genel atık olarak atın.Manyetik parçacıklar manyetik pipet kullanılarak bir tüpten diğerine aktarılabilir. Çıkarma işlemini gerçekleştirmeden önce manyetik pipetin çalışmasına alışın. Rafta ekstraksiyon için gerekli reaktifi içeren tüpleri düzenleyin.Diğer bir şey, soldan sağa: bağlama tamponu, yıkama arabellek ve elüsasyon tamponu. Tek kullanımlık plastik pipet kullanarak bağlayıcı tamponiçeren tüpe numune konsantresinin 1 mL'sini aktarın. Çözümü optimize etmek için tüpü on kez ters çevirin.Solüsyonu oda sıcaklığında on dakika kuluçkaya yatırın ve sürekli olarak tek başına veya manuel olarak karıştırın. Manyetik bir pipet ve üç yıkama tamponu için yeniden kullanılabilir temiz bir ipucu kullanarak manyetik parçacıklar toplamak ve yıkama tampon bir içeren tüp içine manyetik parçacıklar bırakın. Otuz saniye boyunca ucu ile yavaşça solüsyon sallayarak yıkayın ve onları toplamak.Bu yıkama işlemini iki ve üç tamponları yıkamak için tekrarlayın. Tampon üç yıkama manyetik parçacıkları toplamak ve elüsyon tampon içeren tüp içine bırakın. Sonra ucu atın.Solüsyonu oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın ve solo orbital i kullanarak sürekli olarak karıştırın. Manyetik pipet üzerindeki ucu herhangi biri ile değiştirin ve elüsyon tamponundan tüm manyetik parçacıkları toplayın. Uçları bağlı parçacıklarla atın.Nükleik asit, daha fazla analiz veya sevkiyat için depolanmalıdır elüsyon tampon, kalır. İnsan adenovirüslerini tespit etmek için hazırlanmış beş tüplü ve üç tüplü bir şerit kullanın. Protokole göre tüplere 1'den 5'e kadar su, PCR karışımı ve nükleik asit ekstrasyonu ekleyin.Daha sonra, tüpler altı ila sekiz su ve PCR karışımı ekleyin. Termocycler her iki şeritler koyun ve uygun çalıştırmak seçin. Çalışma tamamlandıktan sonra, sonuçları toplayın ve elde edilen verileri analiz edin.Sadece viral testler negatif sonuçlandığında, MS2 tespiti yapılmalıdır. MS2 tespiti için hazırlanmış tüp şeritleri kullanın ve PCR için uygun termal profili seçin. VirWaTest manyetik nükleik asit ekstraksiyonu QIAgen viral RNA ile karşılaştırıldı, insan adenovirüsleri ve MS2 ile çivili su örnekleri test ederek taklit edildi.Azaltma testi p-değeri test her iki virüs için bir çıkarma yöntemi olarak QiAgen daha VirWaTest kullanarak önemli ölçüde daha yüksek viral kurtarma gösterir. Viral konsantrasyon için geliştirilen yöntem, Su numuneleri toplayan, geliştirilen konsantrasyon yöntemini uygulayarak onları konsantre eden ve çekirdekik asit çıkarma ve viral niceleme için Barselona'daki laboratuvara gönderen, Orta Afrika Cumhuriyeti ve Pedernales, Ekvador'da bulunan Oxfam yıkama ekiplerinin işbirliği ile sahada test edildi. Ekvador'da test edilen tüm örneklerde insan adenovirüsleri tespit edilirken, Bangui'de toplanan ve konsantre edilen beş örnekten biri insan adenovirüsleri açısından pozitif çıktı.Geliştirilen yöntem, Bangui, Orta Afrika Cumhuriyeti Oxfam Intermon yıkama ekipleri ve Pedernales, Ekvador başka bir ekip tarafından değerlendirildiğinde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. VirWaTest bir erken uyarı sisteminin parçası olabilir veya su sanitasyonu ile ilgili kuruluşlar tarafından salgın araştırmasında kullanılabilir. Bu ekipman, insani kriz bağlamlarında viral hastalık olaylarını azaltmak amacıyla sudaki viral patojenlerin analizini ve su güvenliği yönetiminin geliştirilmesini kolaylaştırmaktadır.

virwatest-point-use-method-for-detection-viruses-water

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Deniz ve tatlı su sistemlerinin virüslerin ciro oranı bir azalma ve yeniden oluşmaları tekniği ile tahmin edilebilir. Veriler araştırmacılar, su sistemlerinde virüs aracılı mikrobiyal ölüm oranları anlaması için izin verir.

Su Sistemleri Virüs Üretim Oranlar tahmin

Bu çalışma, MST araçları olarak önerilen insan / / sığır domuz DNA virüsleri, adenovirüs ve polyomaviruses, belirli bir miktar tayini için qPCR kullanarak suda nitrat dışkı / idrar kirlenme veya kontaminasyon kaynağının belirlenmesi için maliyet-etkin bir yöntem açıklanır.

Özgül İnsan ve Hayvan Virüsler Mikrobiyal Kaynak Takip için maliyet-etkin Yöntemi

Bu protokol, su bazlı tespiti için alternatif adımlar olarak teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon numune konsantrasyonu sisteminin kullanımı ve ısı ayrışma...

Su bazlı Algılamak için Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon ve Isı Disosiyasyon Adımlar kullanır A Modifiye EPA Method 1623<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Ve<em&gt; Giardia spp.</em

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

İnsan adenovirüsünün sivri uçları kullanılarak küçük hacimli su örnekleri için optimal viral konsantrasyon koşullarını belirlemek için bir yaklaşım geliştirilmiştir. Burada açıklanan teknikler, diğer viral hedefler için konsantrasyon parametrelerini tanımlamak için kullanılır ve büyük ölçekli viral konsantrasyon deneylerine uygulanır.

Sudan Viral Konsantrasyon için Küçük Bir Ses Prosedürü

EPA Metod 1615, çevre ve içme sularındaki enterovirüsleri ve norovirüsleri konsantre etmek için elektropozitif bir filtre kullanır. Bu el yazması, Yöntem 1615 analizleri için numune toplama prosedürünü açıklamaktadır.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu

Burada, Buffalo Green Monkey böbrek hücresi hattını kullanarak toplam kültürlenebilir virüsleri ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. Prosedür, çevresel ve içme sularında bulaşıcı virüslerin oluşumunu ölçmek için standartlaştırılmış bir araç sağlar.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

Burada, ters transkripsiyon-kantitatif PCR kullanarak çevresel ve içme sularında enterovirüs ve norovirüsü ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. EPA Metodu 1615'ten alınan bu standardize prosedürle yeraltı sularından ortalama virüs geri kazanımı, poliovirüs için %20 ve murin norovirüsü için %30 idi.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

Bir anyon reçine tabanlı yöntemi bioaerosol sıkışma tabanlı örnekleme virüslerin gösterdi sıvı için uyarlanmış değişimi. Aşağı akım moleküler algılama ile birleştiğinde, yöntem bioaerosols virüslerden facile ve hassas algılanması için izin verir.

Anyon Exchange reçine kullanma Bioaerosols--dan virüs tespiti

Çevresel su ve atık su örneklerinden virüs konsantrasyonu, öncelikle virüslerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için gerçekleştirilen zorlu bir görevdir. Çeşitli virüs konsantrasyon yöntemleri geliştirilmiş ve test edilmiş olsa da, burada farklı numune tiplerine sahip RNA virüsleri için ultrafiltrasyon ve yağsız süt topaklaşmasının etkinliğini gösteriyoruz.

Yağsız Süt Flokülasyonu ve Ultrafiltrasyon Kullanılarak Çevresel Su ve Atık Su Numunelerinden Virüs Partiküllerinin Konsantrasyonu

Keşfedin VirWaTest yöntemiyle su örneklerinde enterik virüsleri tespit etme tekniğini. Bu taşınabilir ve uygun maliyetli yöntem, insani krizlerde su güvenliğini artırarak halk sağlığını korur.

VirWaTest, su örnekleri virüslerin tespiti için bir nokta-of-kullanım yöntemi

Daha fazla video keşfet