VirWaTest, su örnekleri virüslerin tespiti için bir nokta-of-kullanım yöntemi

Enterik virüsler çoğunlukla yeraltı suyu, durgun su, akarsular, nehirler ve r su gibi farklı su rezervuarlarında bulunur. Onlar sağlık riskleri ile ilişkili ve insanlarda enfeksiyonlar sorumludur. Enterik virüsler genellikle gastroenteritneden ve çoğunlukla dışkı-oral rota yoluyla bulaşır.

Diğer su kaynaklı hastalıklar, özellikle gebelerde hepatit E ile ilgili önemli mortalite ile hepatit A virüsü ve hepatit E virüsleri ile akut hepatite neden olur. İnsani bağlamlar için önerilen su kalitesinin izlenmesi için gerçek protokoller, dışkı kontaminasyonunun bir göstergesi olarak E.Coli gibi bakterileri tutmak için tasarlanmıştır. Ama zaten birçok aktivasyon süreçlerine daha dirençli virüsler gibi diğer mikroorganizmalar ile herhangi bir korelasyon olduğu bilinmektedir.

Şimdiye kadar, insani kriz ortamlarında virüslerin tespiti, mevcut protokollerin bu bağlamların koşullarına uyarlanması ve örneklerin virüslerin moleküler tespiti için referans laboratuvarlara gönderilerek gerçekleştirilmiştir. Halk sağlığı risklerini azaltmak, salgınları önlemek ve insani müdahalelerin verimliliğini artırmak için görüş açısından viral patojenleri ve viral göstergeleri saptamak için yöntemlere ihtiyaç vardır. Biz üç adıma ayrılır 10 litrelik su örneklerinde virüslerin tespiti için bir yöntem öneriyoruz: Viral konsantrasyon, nükleik asit çıkarma, ve viral algılama.

Tüm bu adımlar şu anda laboratuarımızda kullanılmakta olan yöntemlerden uyarlanmıştır ve güç kaynağı ve dondurucu bağımlıları üreten taşınabilir reaktifler ve ekipmanlar kullanılarak görüş noktasında gerçekleştirilebilir. Ayrıca, gerektiğinde referans laboratuvarlara sevkiyat için nükleik asitlerin stabilitesini garanti etmek için metoduna koruyucu bir çözelti eklenmiştir. Önerdiğimiz yöntem VirWaTest olarak adlandırılır ve GenIUL ve Intermon Oxfam işbirliği ile geliştirilmiştir.

Başlamadan önce, test edilecek numune sayısı reaktifler ve malzeme hazırlanması için dikkate alınmalıdır. Temsili sonuçlar elde etmek için her su numunesinin iki kopyasını toplaması önerilir. Uygun miktarda malzeme varsa, aynı anda çeşitli numuneler test edilebilir.

Reaktifler ve malzemeler taşınmadan önce hazırlanmalı ve paketlenmelidir veya yöntemin gerekli olduğu yere sevk edilmelidir. Paketlenmeli malzemelerin ve küçük ekipmanların listesi tablo birde açıklanmıştır. İlgili ISO yöntemini izleyerek her su numunesine bir proses kontrolü olarak eklenecek bir bakteriyofaj MS2 stoku hazırlayın.

Daha sonra önceden 10 mL tüpler halinde yapılmış 10 ila 10 platformlama üniteleri içeren bir süspansiyon 10 mikrolitre dağıtmak ve su kurumasını bekleyin. Su numunesi başına bir tüp gerekli olacaktır. Ayrıca, toplanan numune başına 10 mL steril distile su içeren bir tüp hazırlayın.

Önceden floküle yağsız süt çözeltisi için, yağsız süt içeren bir tüp, deniz tuzu içeren bir fermuarlı plastik torba ve distile su içeren plastik bir şişe hazırlayın. pH ayarı için, sitrik asit içeren bir tüp, sodyum hidroksit içeren bir tüp ve 25 ve 50 mL'lik distile su içeren iki plastik kap hazırlayın. Test edilecek her su numunesi için, deniz tuzları ve sitrik asit bir fermuarplastik torbaya ekleyerek bir klima poşeti hazırlamak ve 5 mL tüp için lysis tampon ve nükleik asit koruyucu ekleyerek bir koruyucu çözelti.

Son olarak, dört fermuarlı plastik torbalar güç deterjan ekleyerek, dört nötralize poşet hazırlamak. Ayıklanacak her su numunesi için, manyetik parçacıklar ve etanol içeren bir beş mL tüp ve sırasıyla bir, iki ve üç yıkama tamponları bir, iki ve üç 200 mikrolitre içeren üç 2 mL tüp ve elüsyon tamponu içeren bir tüp hazırlayın. Newell termcycler kullanılıyorsa, her PCR testinde aynı anda iki farklı nükleik asit ekstraksiyonu analiz edilebilir.

Tüm PCR tahlilleri için moleküler biyoloji suyu hazırlayın. Protokolde açıklanan hacimlere ve konsantrasyonlara göre her hedef virüs için iki astar ve bir kanıt içeren karışımlar hazırlayın. Her virüs için, bir tüp tepsisi bir ila sekiz tüpler içine belirtilen hacimleri ekleyin.

Şeridi kesin, iki şerit halinde böl. 1'den 5'e, tüpler 6'dan 8'e kadar. Her virüs için, 10 ila 5, 10-7 ve 10-9 içeren hava kuru DNA süspansiyonları ve bilinen kopyaları önceden tüpler altı, yedi ve sekiz haline getirtılmıştır.

Bu konsantrasyon protokolü, düşük pH ve yüksek iletkenlik durumunun yağsız süt proteinlerini virüslerin absorbe ettiği floclar halinde organize etmeye iten organik flokülasyon prensibine dayanır. Flocs yerleştikten sonra, kolayca toplanabilir. Bir kapak ile sağlanan düz alt kova bir 10 litrelik su örneği toplamak.

Bir borudan toplanıyorsanız, su toplamadan önce birkaç saniye boyunca su çalışmasına izin verin. Peletleri görselleştirmek için berrak kovalar kullanmak önemlidir. Doğrudan güneş ışığından uzak taze bir yerde düz bir alan arayın Kova desteği altında bir pil bağlı bir manyetik karıştırıcı koyun ve her destek su örneği içeren kova yerleştirin.

Sitrik asit ve sodyum hidroksit yeniden düşünün ve tamamen çözülene kadar sallayın. Bir stand-up çanta içine distile su 500 mLs dökün ve manyetik karıştırıcı üzerine çanta yerleştirin. Bir deniz tuzu poşetve bir yağsız süt tüpü içeriğini ekleyin ve orta hızda beş dakika karıştırın.

Sitrik asit ve sodyum hidroksit kullanarak floküle yağsız sütün pH'ını 3,4 ile 3,6 arasında bir pH'ya ayarlayın. Manyetik karıştırıcıyı kapatın ve flocların görünür olduğundan emin olun. Bir el feneri flocs görselleştirme yardımcı olabilir.

Suya karıştıran bir mıknatıs bırakın. Manyetik karıştırıcıyı maksimum hızda ayarlayın ve açın. Proses kontrollü bir tüpe 10 mL distile su ekleyin.

Birkaç kez ters ve suya çözelti dökün. Suya bir örnek klima poşet içeriğini dökün ve beş dakika karıştırın. 3.4 ile 3.6 arasında olması gereken su örneğinin pH'ının olduğundan emin olun.

Gerekirse pH'ı ayarlayın. Önceden floküle yağsız süt çözeltisi 100 mLs ekleyin, kapağı ile kova mühür ve en az hızda sekiz saat karıştırarak su bırakın. Sekiz saat sonra manyetik karıştırıcıyı kapatın ve flocların en az beş saat daha yerleşmesine izin verin.

Bir pipet denetleyicisi, plastik bir tüp ve pipet ler bir çift kullanımına dayalı bir sistem ile, kova alt flocs rahatsız değil dikkat, supernatant atın. Su seviyesi karıştırma mıknatısulaşmak üzere yken, su akışını durdurmak için plastik tüp sıkmak ve kova pipet uzak hareket. Flocs resuspend ve bir stand-up plastik torbaya dökün kova çalkalayın.

Flocs bir saat daha yerleşmek için izin verin. Flocs rahatsız önlemek bir pipet kullanarak su supernatant dikkatle aspire. Bir pipet kullanarak flocs aspirate ve konik bir tüp içine aktarın.

Numune konsantresinin son hacmini not edin ve koruyucu çözeltiiçeren bir tüpe 1 mL aktarın. Süspansiyon ya alanında nükleik asit ekstraksiyon gerçekleştirmek için kullanılabilir, ya da daha fazla analiz için bir referans laboratuvara gemi. Flocs toplarken atılan su bertaraf edilmeden önce tedavi edilmelidir.

Atılan suyu içeren kovaya nötralize edici bir madde poşetinin içeriğini ekleyin. Suyu karıştırın ve otuz dakika hareketsiz bırakın. Daha sonra arıtılmış suyu genel atık olarak atın.

Manyetik parçacıklar manyetik pipet kullanılarak bir tüpten diğerine aktarılabilir. Çıkarma işlemini gerçekleştirmeden önce manyetik pipetin çalışmasına alışın. Rafta ekstraksiyon için gerekli reaktifi içeren tüpleri düzenleyin.

Diğer bir şey, soldan sağa: bağlama tamponu, yıkama arabellek ve elüsasyon tamponu. Tek kullanımlık plastik pipet kullanarak bağlayıcı tamponiçeren tüpe numune konsantresinin 1 mL'sini aktarın. Çözümü optimize etmek için tüpü on kez ters çevirin.

Solüsyonu oda sıcaklığında on dakika kuluçkaya yatırın ve sürekli olarak tek başına veya manuel olarak karıştırın. Manyetik bir pipet ve üç yıkama tamponu için yeniden kullanılabilir temiz bir ipucu kullanarak manyetik parçacıklar toplamak ve yıkama tampon bir içeren tüp içine manyetik parçacıklar bırakın. Otuz saniye boyunca ucu ile yavaşça solüsyon sallayarak yıkayın ve onları toplamak.

Bu yıkama işlemini iki ve üç tamponları yıkamak için tekrarlayın. Tampon üç yıkama manyetik parçacıkları toplamak ve elüsyon tampon içeren tüp içine bırakın. Sonra ucu atın.

Solüsyonu oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın ve solo orbital i kullanarak sürekli olarak karıştırın. Manyetik pipet üzerindeki ucu herhangi biri ile değiştirin ve elüsyon tamponundan tüm manyetik parçacıkları toplayın. Uçları bağlı parçacıklarla atın.

Nükleik asit, daha fazla analiz veya sevkiyat için depolanmalıdır elüsyon tampon, kalır. İnsan adenovirüslerini tespit etmek için hazırlanmış beş tüplü ve üç tüplü bir şerit kullanın. Protokole göre tüplere 1'den 5'e kadar su, PCR karışımı ve nükleik asit ekstrasyonu ekleyin.

Daha sonra, tüpler altı ila sekiz su ve PCR karışımı ekleyin. Termocycler her iki şeritler koyun ve uygun çalıştırmak seçin. Çalışma tamamlandıktan sonra, sonuçları toplayın ve elde edilen verileri analiz edin.

Sadece viral testler negatif sonuçlandığında, MS2 tespiti yapılmalıdır. MS2 tespiti için hazırlanmış tüp şeritleri kullanın ve PCR için uygun termal profili seçin. VirWaTest manyetik nükleik asit ekstraksiyonu QIAgen viral RNA ile karşılaştırıldı, insan adenovirüsleri ve MS2 ile çivili su örnekleri test ederek taklit edildi.

Azaltma testi p-değeri test her iki virüs için bir çıkarma yöntemi olarak QiAgen daha VirWaTest kullanarak önemli ölçüde daha yüksek viral kurtarma gösterir. Viral konsantrasyon için geliştirilen yöntem, Su numuneleri toplayan, geliştirilen konsantrasyon yöntemini uygulayarak onları konsantre eden ve çekirdekik asit çıkarma ve viral niceleme için Barselona'daki laboratuvara gönderen, Orta Afrika Cumhuriyeti ve Pedernales, Ekvador'da bulunan Oxfam yıkama ekiplerinin işbirliği ile sahada test edildi. Ekvador'da test edilen tüm örneklerde insan adenovirüsleri tespit edilirken, Bangui'de toplanan ve konsantre edilen beş örnekten biri insan adenovirüsleri açısından pozitif çıktı.

Geliştirilen yöntem, Bangui, Orta Afrika Cumhuriyeti Oxfam Intermon yıkama ekipleri ve Pedernales, Ekvador başka bir ekip tarafından değerlendirildiğinde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. VirWaTest bir erken uyarı sisteminin parçası olabilir veya su sanitasyonu ile ilgili kuruluşlar tarafından salgın araştırmasında kullanılabilir. Bu ekipman, insani kriz bağlamlarında viral hastalık olaylarını azaltmak amacıyla sudaki viral patojenlerin analizini ve su güvenliği yönetiminin geliştirilmesini kolaylaştırmaktadır.