Name: In vivo doğrudan reprogramming Resident glial hücreler Interneurons viral vektörler ıntracerebral enjeksiyon ile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Öğrenin, AAV viral vektörlerle fare beyinlerindeki NG2-glia hücrelerini parvalbumin-pozitif internöronlara doğrudan yeniden programlama yöntemini. Bu teknik, psikiyatrik bozukluklar için hücre replasman tedavilerine yönelik araştırmalarda kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Marcella birtele Avrupa Birliği Horizon 2020 programı (H2020-MSCA-ıTN-2015) tarafından Marie Skłodowska-Curie yenilikçi eğitim ağları ve Grant Sözleşmesi No. 676408 altında finanse edilmiştir. Daniella Rylander Ottosson Isveç Araştırma Konseyi (2017-01234) tarafından finanse edilmiştir.

<ol><li>Barker, R. A., Parmar, M., Studer, L., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Trials+of+Stem+Cell-Derived+Dopamine+Neurons+for+Parkinson%27s+Disease%3A+Dawn+of+a+New+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human Trials of Stem Cell-Derived Dopamine Neurons for Parkinson's Disease: Dawn of a New Era.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 569-573 (2017).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622(2014).</li>
<li>Parmar, M., Torper, O., Drouin-Ouellet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+for+Parkinson%27s+disease%3A+A+journey+through+decades+toward+the+light+side+of+the+Force%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy for Parkinson's disease: A journey through decades toward the light side of the Force.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li>
<li>Su, Z., Niu, W., Liu, M. L., Zou, Y., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+conversion+of+astrocytes+to+neurons+in+the+injured+adult+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">In vivo conversion of astrocytes to neurons in the injured adult spinal cord.</a> Nature Communication. 5, 3338(2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascl1+Converts+Dorsal+Midbrain+Astrocytes+into+Functional+Neurons+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ascl1 Converts Dorsal Midbrain Astrocytes into Functional Neurons In Vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9336-9355 (2015).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).</li>
<li>Grande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+impact+on+direct+neuronal+reprogramming+in+vivo+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Environmental impact on direct neuronal reprogramming in vivo in the adult brain.</a> Nature Communication. 4, 2373(2013).</li>
<li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+astrocytes+to+neuroblasts+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of astrocytes to neuroblasts in the adult brain.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1164-1175 (2013).</li>
<li>Weinberg, M. S., Criswell, H. E., Powell, S. K., Bhatt, A. P., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vector+Reprogramming+of+Adult+Resident+Striatal+Oligodendrocytes+into+Functional+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Viral Vector Reprogramming of Adult Resident Striatal Oligodendrocytes into Functional Neurons.</a> Molecular Therapy. 25 (4), 928-934 (2017).</li>
<li>Pereira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+of+Resident+NG2+Glia+into+Neurons+with+Properties+of+Fast-Spiking+Parvalbumin-Containing+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming of Resident NG2 Glia into Neurons with Properties of Fast-Spiking Parvalbumin-Containing Interneurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 742-751 (2017).</li>
<li>Rivetti di Val Cervo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+dopamine+neurons+from+human+astrocytes+in+vitro+and+mouse+astrocytes+in+a+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Induction of functional dopamine neurons from human astrocytes in vitro and mouse astrocytes in a Parkinson's disease model.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 444-452 (2017).</li>
<li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+%26+Clinial+Development%22%5BJournal%5D)">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy Methods & Clinial Development. 10, 1-7 (2018).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+neurons+via+direct+conversion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Generation of induced neurons via direct conversion in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 7038-7043 (2013).</li>
<li>Kawaguchi, Y., Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+physiological+subgroupings+of+nonpyramidal+cells+with+parvalbumin-+and+calbindinD28k-immunoreactive+neurons+in+layer+V+of+rat+frontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Correlation of physiological subgroupings of nonpyramidal cells with parvalbumin- and calbindinD28k-immunoreactive neurons in layer V of rat frontal cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (1), 387-396 (1993).</li>
<li>Grealish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A9+dopamine+neuron+component+in+grafts+of+ventral+mesencephalon+is+an+important+determinant+for+recovery+of+motor+function+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is an important determinant for recovery of motor function in a rat model of Parkinson's disease.</a> Brain. 133 (Pt 2), 482-495 (2010).</li>
<li>Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+dopaminergic+neurons+of+nigral+and+ventral+tegmental+area+subtypes+in+grafts+of+fetal+ventral+mesencephalon+based+on+cell+morphology%2C+protein+expression%2C+and+efferent+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections.</a> Journal of Neuroscience. 25 (27), 6467-6477 (2005).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

In vivo doğrudan yeniden programlama CRE-fare suşları ifade AAV FLEX vektörler kullanılarak elde edilebilir. Yeniden programlama etkinliğine ilişkin fare suşları arasındaki farklılıkların gözlendiği dikkate alınmalıdır. Striatum içinde vivo yeniden programlama için, NG2-CRE fare hattı diğer suşları ile karşılaştırıldığında daha verimli olduğu kanıtlanmıştır. Yeni bir hayvan gerinim kullanmaya başlamadan önce, hayvanların yaşı genellikle bu protein ifadesinin özgüllüğünü etkilediği için, zaman içinde CRE ifadesi ile ilgili fare sağlayıcı kurallarını kontrol etmek önemlidir. NG2 glia dışındaki hücrelerde CRE ifadesi için bir risk olduğu için çalışmalarda, 12 haftadan büyük hayvanlar in vivo yeniden programlama için kullanılmadı. Sadece Synapsin-FLEX-GFP yapı ile enjekte kontrol hayvanların sürekli varlığı ve izlenmesi tavsiye edilir. Bu, hiçbir yeniden programlama genleri (ALN) kullanılırsa, mevcut olmamalıdır GFP-pozitif hücreler için hayvanların izlenmesi sağlar.
Yeni yeniden programlanmış nöronlar tanımlamak için, bu protokolde açıklanan bir neuron-specific tanımlama yöntemi çok önemlidir. Bu, bir Homotopik bölgede yeniden programlama yaparken, özellikle alaka düzeyi olan endojen çevreleyen hücrelerden yeniden programlanmış nöronların uygun bir şekilde tanımlanması ve ayırt edilmesini sağlar.
Viral enjeksiyon için doğru yapıyı hedeflemek de önemlidir. Bu nedenle, viral enjeksiyon için stereotaktik cerrahi önemlidir ve özellikle beynin küçük yapılarını hedeflerken, doğruluk ile yaklaşmak gerekir.
Daha önce de aynı yeniden programlama faktörleri kullanarak in vitro yeniden programlama deneylerine dayanan in vivo yeniden programlama sonucunu tahmin etmek için güvenilir olmadığını11 göstermiştir. Bu nedenle tüm ilgi faktörleri in vivo olarak test edilmesi gerekir. Bizim ellerimizde, pek çok farklı faktör kombinasyonu, bu genlerin diğer nöronların gelişimine bağlı olmasına rağmen, aynı nöronların alt tipini (yani,11 in vivo interneurons) verir.
Yeniden programlanmış nöronlar için tam hücreli yama kelepçe hassas bir tekniktir ve doku işleme iyi bir sonuç için önemlidir. Buz gibi soğuk Krebs çözeltisi ile perfüzyon doku kalitesini arttırır. Ayrıca, yamalı nöronların dikkatle tedavi edilmesi gerekir. Yeniden programlanmış nöronlar olgunlaşma ve fenotipi kimlik biraz tüm hücreli yama kelepçe kullanılarak değerlendirilebilir olsa bile, bu hücreler tamamen onların endojen meslektaşları ile karşılaştırılabilir değildir. Yeniden programlanmış hücre kimliğini daha fazla onaylamak için genom sıralaması (örn. RNA sıralaması) gibi ek analiz türleri kullanılmalıdır.
Burada açıklanan teknik, nöronal değişimin beyinde gerekli olduğu gelecekteki tedavilerin gelişimi için düşünülebilir. In vivo yeniden programlama hala erken aşamalarında ve insanlara çeviri henüz öngörülmüştür rağmen, bu teknik, beyin ve çalışma hücresi olgunlaşma in vivo eksojen gen fonksiyonunu değerlendirmek için bir yöntem sağlayabilir.

Bu yöntemin genel hedefi verimli bir şekilde beyin yerleşik glia in vivo fonksiyonel ve Subtype özgü nöronlar gibi parvalbumin-interneurons ifade dönüştürmek için. Bu bir eksojen hücre kaynağına gerek kalmadan beyin hastalıkları için alternatif bir hücre replasman tedavisinin gelişmesine yönelik bir adım ileri sağlar. Aynı zamanda hücre kader anahtarları situ çalışma için bir araç oluşturur.
Beyin yeni nöronlar üretmek için sadece sınırlı bir kapasiteye sahiptir. Bu nedenle, nörolojik hastalıklarda, beyin tamiri için eksojen hücre kaynaklarına ihtiyaç vardır. Bunun için, birincil dokudan hücreler, kök hücre türetilen hücreler ve yeniden programlanmış hücreler dahil olmak üzere yıllar boyunca farklı hücre kaynakları yoğun araştırmaya maruz kalmıştır1,2,3. Doğrudan nöronlar içine Resident beyin hücrelerinin yeniden programlama beyin içinde roman nöronlar oluşturmak için hastanın kendi hücrelerini kullanır gibi beyin tamiri için çekici bir yöntem sağlayabilir son bir yaklaşımdır. Bugüne kadar, birkaç rapor içinde vivo yeniden programlama beyin Viral vektör teslimat ile göstermiştir4,5,6,78,9 gibi farklı beyin bölgelerinde korteks, omurilik, striatum ve orta beyin5,10,11, yanı sıra bozulmamış ve lezioned beyin5,8,11,12. İnhibitör ve uyarıcı nöronlar elde edilmiştir4,8, ancak bu hücrelerin hassas fenotipi veya işlevselliği henüz ayrıntılı olarak analiz edilmedi.
Bu protokolde, in vivo yeniden programlanmış nöronların daha verimli bir şekilde yeniden programlanması ve hücreye özgü tanımlaması açıklanmaktadır. İşlevsellik ve immünohistokimyasal özelliklere dayalı nöronal olgunlaşma ve fenotip karakterizasyonu işlevsel değerlendirme için bir protokol sağlıyoruz.
Biz bir CRE-indüklenebilir AAV vektör ve bir GFP muhabir in vivo yeniden programlanmış nöronlar tanımlamak için kullanılır. Viral vektörler bu seçim retrovirüs7,8kullanımına alternatif olarak, hedeflenen hücrelerin sayısını artırarak, hem bölme ve beyin bölünmeyen hücreleri bulaşan avantajına sahiptir. Bir nöron özgü synapsin odaklı FLEX muhabiri (GFP), özellikle yeni oluşturulan nöronlar algılamak için bize sağladı. Önceki çalışmalar, aynı zamanda belirli hücre türlerinde yeniden programlama genler ve gazetecilerin ifade izin in vivo yeniden programlama7,9için Subtype özgü Rehberleri kullandık. Ancak, bu yöntem muhabir ve nöronal işaretçileri ortak ifade postmortem analizi ile yeniden programlanmış nöronların daha fazla tanımlanması gerekir. Burada açıklanan bir neuron-specific muhabir, kullanımı, doğrudan bir kimlik sağlar. Bu başarılı bir dönüşüm doğrudan bir kanıtı sağlar ve yama kelepçe Elektrofizyoloji için gerekli olan bir canlı hücre kimlik sağlar.

<table><tbody><tr><td><AAV5 KLONLAMA VE VIRAL VEKTÖR HAZIRLAMA IÇIN GÜÇLÜ >REAKTİFLER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CA-FLEX</td><td>AddGene</td><td>38042</td><td></td></tr><tr><td>Ascl1</td><td>AddGene</td><td>67291</td><td>NM_008553.4</td></tr><tr><td>Lmx1a</td><td>AddGene</td><td>33013</td><td>NM_0033652.5</td></tr><tr><td>Nurr1</td><td>AddGene</td><td>35000</td><td>NM_013613.2</td></tr><tr><td>GFP-syn</td><td>AddGene</td><td>30456</td><td></td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) dizisi 1</td><td></td><td></td><td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga</td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) dizileri 2</td><td></td><td></td><td>tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagtgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td></tr><tr><td>pDP5</td><td>Plazmid Fabrikası</td><td>PF435</td><td></td></tr><tr><td>pDP6</td><td>Plazmit Fabrikası</td><td>PF436</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal sığır serumu)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)+ Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salini)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>14190094</tr><tr><td>HEK293 hücreleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85120602-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Şişeler</td><td>BD Falcon</td><td>10078780</td><td>175 cm2</td></tr><tr><td>Tris H-CL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td> TE tamponu için 10 mM, pH 8.0 kullanın; lizis tamponu için 50mM, pH 8.5 kullanın; IE tamponu için 20 mM, pH 8.0 kullanın; elüsyon tamponu için 20 mM, pH 8.0 </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>kullanın: İnvitrojen</td><td>EDTA: AM9260G</td><td> TE tamponu için 1 mM EDTA </td></tr><tr><td>Ultra saf su</td><td></td><td></td> kullanın, <td> bakınız Ultra saf su sistemi </td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C5080</td><td>2.5 M</td></tr><tr><td>Dulbecco&akut; s fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td> HBS İÇİN 140 mM kullanın; Lysis Buffer için 150 mM kullanın; IE tamponu için 15 mM kullanın; elüsyon tamponu için 250 mM </td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td> kullanın <td> Lizis Tamponu için: 1 mM </td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj sızdırmazlık tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>Quick-Seal&reg; &nbsp; Polipropilen Tüp</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep & trade; &nbsp; Yoğunluk Gradyan Orta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>10 mL şırınga-18G iğne</td><td>BD</td><td>305064</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar cam şişeleri</td><td>VWR</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>Anyon değişim filtresi</td><td>PALL laboratuvar</td><td>MSTG25Q6</td><td> Mustang Q membranlı Acrodisc ünitesi </td></tr><tr><td>Santrifüj filtre ünitesi</td><td>Merck</td><td>Z740210-24EA</td><td> Amicon Ultra-4 cihazı </td></tr><tr><td>Endotoksin İçermeyen Plazmid DNA İzolasyon Kitleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A33073</td><td></td></tr><tr><td>Na2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Falcon tüpü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüpü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352070</td><td></td></tr><tr><td>Cam Şişeler</td><td>Novatech</td><td>30209-1232</td><td> CGGCCTCAGFGAGCGA </td></tr><tr><td>Ters Terminal Tekrarı (ITR) dizisi</td><td></td><td></td> için İleri Astar <td> GGAACCCCTAGTGATGGAGTT </td></tr><tr><td>Ters Terminal Tekrarı (ITR) dizisi</td><td></td><td></td> için Ters Astar <td> CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG </td></tr><tr><td>5&akut; FAM / 3 ve akut; BHQ1 probu</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 mm filtre</td><td>Merck</td><td>SLGV004SL</td><td>Millex-GV filtre</td></tr><tr><td><güçlü>EKİPMAN AAV5 VİRAL VEKTÖR HAZIRLAMA</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dondurucu -20 &°; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dondurucu -80 ° C; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buzdolabı +4 & derece; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV viral oda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf Su sistemi</td><td>Merck</td><td>Milli-Q & reg; IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>444-0004</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Optima LE-80K Ultrasantrifüj</td><td></td></tr><tr><td>Otoklav</td><td>Tuttnauer</td><td>2540 EL</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)</td><td>BioRad</td><td>C1000 Dokunmatik Termal Döngüleyici</td><td></td></tr><tr><td>Kantitatif PCR (qPCR)</td><td>Roche</td><td>LightCycler&reg; 480 Sistem</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST16</td><td></td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>HAYVAN MODELİ</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG2-Cre fareler</td><td>Jackson</td><td>NG2-CrexB6129, Stok #008533</td><td></td></tr><tr><td>BEYNE YENİDEN PROGRAMLAMA FAKTÖRLERİNİN ENJEKSİYONU İÇİN REAKTİFLER</ güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuzlu</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td>% 70</td></tr> <tr><td>Etanol</td><td>Solveco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzolfuran</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td> Ilık su ile% 1'lik çözeltiye seyreltin. </td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Viroderm</td><td>7511&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Apoteket AB</td><td>P0500000</td><td> i.p. 60 mg / ml dozunda terminal prosedür için. </td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Merck</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Blu</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Retrobeads</td><td>Lumafluor</td><td>R170</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td></td></tr>< <tr><td>BEYNE YENİDEN PROGRAMLAMA FAKTÖRLERİNİN ENJEKSİYONU İÇİN GÜÇLÜ > EKİPMAN < / güçlü></td><td></td><td></td><td> RSG Solingen'den. </td></tr><tr><td>Biochem'den</td> <td>makas</td><td>VWR</td><td>233-1552</td>.</tr><tr><td>Cımbız</td><td>VWR</td><td>232-0007</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>VWR</td><td>232-0120</td><td></td></tr><tr><td>Neşter tutucu</td><td>VWR</td><td>RSGA106.621</td><td>20 numara.</td></tr><tr><td>Neşter</td><td>VWR</td><td>RSGA106.200</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaksik çerçeve</td><td>Stoelting Europe</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Fare kulak çubukları</td><td>Stoelting Europe</td><td>51648</td><td>5 ul</td></tr><tr><td>Çıkarılabilir iğneli Şırınga</td><td>Hamilton Company</td><td>65</td><td> 0,75 iç çap ve 1.5 dış çap. </td></tr><tr><td>Cam kılcal damarlar</td><td>Çalma</td><td>50811</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal çektirme</td><td>Sutter şirketi</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Diş matkabı</td><td>Agnthos AB</td><td>1464</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş makinesi</td><td>Agnthos AB</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran Hazne ve pompa</td><td>Agnthos AB</td><td>8323101</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Merck</td><td>Z118400-30EA</td><td>25G</td></tr><tr><td>İğneler</td><td>Merck</td><td>Z192414&nbsp; Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaksik çerçeve için fare ve yenidoğan sıçan adaptörü</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma yastığı</td><td>Braintree scientific, inc</td><td>53800M</td><td> Covidien 2187'den. </td></tr><tr><td>Pamuklu gazlı bez</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-902</td><td></td></tr><tr><td>Kauçuk tüp</td><td>Elfa Distrelec</td><td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td><td></td></tr><tr><td>Pamuklu çubuklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-366-473</td><td></td></tr><tr><td>TAM HÜCRE İÇİN YAMA YAMASI KELEPÇE KAYITLARI İÇİN REAKTİFLER</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2-6 H 2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2 -6 H 2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td>, <td> bakınız Ultrasaf Su sistemi </td></tr><tr><td>Ultra saf Su</td><td></td><td></td><td>1 veya 2M hazırlayın.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>KD-glukonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500 ve nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH-EGTA (Etilen glikol-bis-N-tetrastik asit)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889 &nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KOH-Hepes asit (N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Mg2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Biyosit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Pikrotoksin</td><td>Merck</td><td>P1675 ve nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Merck</td><td>C239&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> TÜM HÜCRE YAMA KELEPÇESI KAYITLARI İÇİN EKİPMANLAR</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam pipet</td><td>Sutter Şirketi</td><td>B150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal çektirme</td><td>Sutter şirketi</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>WaterBath</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>Clampfit yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td><İMMÜNOHISTOKİMASYON İÇİN GÜÇLÜ >REAKTİFLER< / güçlü></td><td></td><td></td><td> % 4 konsantrasyonda kullanın. DİKKAT:&nbsp; PFA güçlü bir fiksatiftir. Yutulmasından ve cilt ile temasından kaçının. </td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td> %0,1 konsantrasyonda kullanın. </td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>10254640</td><td> Eşek.1: 400 konsantrasyonda kullanın. </td></tr><tr><td>Serum</td><td>Merck Millipore</td><td>S30-100ML</td><td> Tozu Milli-Q suda 1 mg / mL'ye kadar sulandırın. Aliquot ve -20 ° C'de mağaza; C,&nbsp; ışığa duyarlı. 1: 500 konsantrasyonda kullanın. </td></tr><tr><td>4&asal;,6-Diamidino-2&prime;-fenilindol dihidroklorür (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td> 1: 600 KPBS-T'de. </td></tr><tr><td>streptavidin- Cy3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>434315</td><td>1:5000, tavşan.</td></tr><tr><td>Anti-GAD65/67</td><td>Abcam</td><td></td><td>1:2000, fare.</td></tr><tr><td>Anti-PV</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td>1:200, keçi.</td></tr><tr><td>Sohbet Önleyici</td><td>Merk</td><td>AB143</td><td>1:5000, tavşan.</td></tr><tr><td>Anti-NPY</td><td>Immunostar</td><td>22940</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td>1:1000, tavuk.</td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Montaj çözümü</td><td>Merck</td><td>10981</td><td> DABCO&reg;, solma önleyici </td></tr><tr><td>OCT</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antifriz solüsyonu</td><td>Tissue Pro Teknolojisi</td><td>AFS05-1000N, 1000 mL/adet.</td><td></td></tr><tr><td>< GÜÇLÜ > İMMÜNOHISTOKIMYA EKİPMANLARI< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ters floresan mikroskobu</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td>TCS SP8 lazer taramalı konfokal mikroskop.</td><td></td></tr><tr><td>Prizma</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo doğrudan reprogramming resident glial hücreler interneurons viral vektörler ıntracerebral enjeksiyon ile

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Fonksiyonel ve Subtype özgü nöronların içine beyin Resident glia dönüştürme aynı zamanda situ hücre kaderi çalışmak için araçlar oluştururken, alternatif hücre replasman tedavilerin gelişimine doğru bir adım sağlar. Bugüne kadar, in vivo yeniden programlama ile nöronlar elde etmek mümkün olmuştur, ancak bu nöronların veya nasıl olgun hassas fenotipi ayrıntılı olarak analiz edilmedi. Bu protokolde, AAV tabanlı bir viral vektör sistemi kullanarak, in vivo yeniden programlanmış nöronların daha verimli bir dönüşüm ve hücreye özgü kimliğini tanımladık. Ayrıca, yeniden programlanmış hücrelerin nöronal olgunlaşma fonksiyonel değerlendirme için bir protokol sağlar. Flip-eksizyon (Flex) vektörler enjekte ederek, hücre yeniden programlama için hedef olarak hizmet beyin belirli hücre türlerine yeniden programlama ve synapsin odaklı muhabir genler içeren. Bu teknik, yeni yeniden programlanmış nöronların kolay tanımlanması için izin verir. Sonuçlar, elde edilen yeniden programlanmış nöronların işlevsel olarak zaman içinde olgun olduğunu, sinaptik kontakları almasını ve farklı türde internöronların elektrofizyolojik özelliklerini gösterdiğimi göstermektedir. Ascl1, Lmx1a ve Nurr1 transkripsiyon faktörlerini kullanarak, yeniden programlanmış hücrelerin çoğunluğu hızlı spiking, parvalbumin içeren interneurons özellikleri vardır.

AAV vektörler enjeksiyon NG2-CRE fare striatum (Şekil 1a) nöronlar IÇINE yerleşik NG2 glia hücrelerini başarıyla yeniden programlamak için kullanılır. Özellikle NG2 glia hedef için, yeniden programlama/muhabir genler ile Flex vektörler, bir antisens yönde eklenir ve iki çift antiparallel, heterotypic loxp siteleri (Şekil 1B) ile çevrelenmiş. Her üç yeniden programlama genler (Ascl1, Lmx1a ve Nurr1) bireysel vektörler üzerinde her yerde cba Organizatör kontrolü altında yerleştirilir. Emin GFP ifade bir CRE-ifade hücreden kaynaklanan nöronlar yeniden programlanan sınırlıdır yapmak için, GFP nöron özel synapsin Promoter kontrolü altında yerleştirilir, (aynı zamanda bir FLEX vektör).
Yeniden programlama ve muhabir yapıları kombinasyonu kullanımı fare striatum GFP-pozitif nöronların üretimi için izin verir (Şekil 1C, C '). Gazetecinin yeniden programlama genler varlığı olmadan inşa kullanımı GFP-pozitif nöronlar vermezse (Şekil 1D).
Biocytin dolu olan yeniden programlanmış nöronlar, mortem sonrası immüno-boyama sonrası görülebilir (Şekil 2a). Dönüşüm başarılı olursa, geniş nöronal morfoloji olmalıdır. Yeniden programlanmış nöronların elektrofizyolojik kayıtları, spontan aktivite önlemleri ile postsinaptik fonksiyonel bağlantıların varlığını göstermektedir (Şekil 2B, C). Bu iyonotropik gabaergic veya glutamaterjik engelleyici ile bloke edilebilir (picrotoksin veya cnqx), yeniden programlanmış nöronlara hem uyarıcı ve inhibitör sinaptik giriş düşündürmektedir. Zaman sonrası viral enjeksiyon ile spontan aktivite artar oluşumu (Şekil 2D), kademeli bir olgunlaşma gösteren.
Fonksiyonel nöronlar mevcut akım kaynaklı eylem potansiyelleri vardır. Eylem potansiyelleri, dönüşümden sonra zaman içinde sayı artışı (Şekil 2E). Bu daha da nöronal fonksiyon olgunlaşma gösterir. Olgunlaşmamış bir nöron, akım ya hiçbiri veya çok az eylem potansiyelleri (Şekil 2F) teşvik edecektir.
Bir nöron tetikleme kalıpları hücre türü spesifik olarak hücreler ve kanal ifadesi15morfoloji gibi faktörlere bağlıdır. İn vivo yeniden programlanmış nöronların içinde kaydedilen desenler gruplara ayırt edilebilir ve endojen nöronal alt tiplere kıyasla, örneğin hızlı spiking internöronlar (hücre tipi B, Şekil 3B) veya diğer hücre tipleri (Şekil 3A, C, D ). Gözlenen elektrofizyolojik farklar belirli alt tip işaretçileri ve GFP ile ortak ifade varlığı ile teyit edilebilir (Şekil 3E-H). Tamamen, bu veriler striatum içinde mevcut yeniden programlanmış nöronların, parvalbumin-, sohbet-ve NPY-interneurons, yanı sıra striatal orta dikenli nöron kimlik (DARPP32 +) gibi farklı türde interneurons özellikleri var olduğunu gösterir ( Şekil 3E -H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"> Şekil 1: in vivo yeniden programlama NG2 glia nöron içine. (A) STRIATAL NG2 glia 'nın vivo yeniden programlanması için AAV virüsü aracılı şematik temsili. (B) Gen ifadesinin hedeflenen hücrelerdeki CRE ifadesiyle düzenlendiği, in vivo yeniden programlama IÇIN kullanılan AAV5 Flex yapılarından oluşan şematik temsili. (C ve c ') In vivo yeniden programlanmış nöronlar, SYN-Gfp kaynaklanan + striatum içine aln enjeksiyon. (D) yeniden programlanmış nöronların olmaması, viral kokteyllere hiçbir yeniden programlama faktörü eklediyseniz ve sadece muhabir yapı içinde vivo enjekte edilir. Ölçek çubukları = 100 mm (C), 25 mm (C '), 25 mm (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"> Şekil 2: In vivo yeniden programlanmış nöronlar fonksiyonel ve zamanla olgunlaşma gösterir. (A) biocytin dolu yeniden programlanmış nöron, Olgun nöronal morfoloji gösterir, dendritik sinler dahil. İzleri gösterir (B) Inhibitör (GABAergic) picrotoksin ile engellenen aktivite, bir GABA reseptör antagonisti ve (C) cnqx Ile engellenen uyarıcı aktivite, bir AMPA reseptör antagonisti. (D) postsinaptik aktivite ile nöronların sayısı zaman içinde artar. (E) yamalı nöronlar zaten 5 hafta sonrası enjeksiyon (w.p.i.) zaten tekrarlayan ateş göstermek ve 8 ve 12 W.p.i. (F) geçerli kaynaklı eylem potansiyeli ve olgunlaşmamış bir nöron postsinaptik aktivite göstermeye devam, birkaç sinaptik gösteren olaylar ve B ve D. ölçek çubuğuna kıyasla birkaç eylem potansiyelleri = 25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"> Şekil 3: In vivo yeniden programlanmış nöronlar, striatal internöronların immünhistokimyasal ve elektrofizyolojik özelliklerini gösterir. (A-D) In vivo yeniden programlanmış nöronların ateş kalıpları farklı türden olabilir: (a) tip a endojen orta dikenli nöron benzer (DARPP32 +); (B) hızlı SPIKING (PV +) interneurons benzer; (C) düşük eşik olarak belirgin sag (NPY +) ile nöronlar spiking benzer; (D) nöronlar büyük sonra hiperpolarizasyon (chat +) ile ateş. (E-H) GFP 'nin ortak lokalizasyonu ve PV (E), sohbet (F), NPY (G) ve projeksiyon nöron Marker DARPP32 (H) gibi interneuron belirteçleri gösteren Konfokal görüntüler. Tüm ölçek çubukları = 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın</a> .

Bu protokol, beyinde AAV tabanlı bir viral sistem ve hücre tanımlaması ve daha fazla analiz için izin veren bir FLEX synapsin odaklı GFP muhabiri kullanarak doğrudan yeniden programlanmış internöronlar içinde vivo üretmeye yönelik hedefler.

In vivo doğrudan reprogramming Resident glial hücreler Interneurons viral vektörler ıntracerebral enjeksiyon ile

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Bu protokol, yerleşik glia doğrudan beyinde yeni nöronlar oluşturmak mümkün olduğunu gösterir ve bu yeniden programlanmış hücreler alt tip özgü nöronlara olgun. Ana avantajı, NG2-glia'nın özel hedeflemesini sağlayan cre-bağımlı AAV virüsü ve yeniden programlanmış nöronları analiz için etiketleyen GFP muhabiridir. Beyinde yeni nöronlar üreten beyinde hücre replasman tedavileri için gelecekteki gelişimine yol açabilir.Protokolümüzde psikiyatrik bozukluklar alabilen parvalbumin-pozitif internöronlar üretiyoruz. In vivo reprogramming diğer beyin alanları ve devreleri ne nöronal fenotip ve nörolojik durum hedef istediğiniz bağlı olarak uygulanabilir. Prosedürü gösteren Jenny Johansson olacak: bir teknisyen, Maria Pereira: eski bir doktora öğrencisi, ve Marcella Birtele: bizim laboratuvarda bir doktora öğrencisi.AAV5 viral vektör üretmek için, beş T175 şişelerinde standart kültür ortamına sahip TOHUM HEK293T hücreleri. Hücreler %50-70 birleştiğinde, transveksiyon için aşağıdaki karışımı hazırlayın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüp, vektör plazmid eşit molar miktarda ekleyin, ve pDG serisi yardımcı plazmid.144 mikrolitrelik son bir hacme Tris-EDTA tamponu ekleyin ve toplam 1296 mikrolitre lik bir hacim elde etmek için ultra saf su ekleyin ve karıştırın. Sonra, 2.5 molar kalsiyum klorür 144 mikrolitre ekleyin ve karıştırın. Bundan sonra, DNA çözeltisine 1.92 mililitre HBS ekleyin ve girdap hemen.Tam olarak 60 saniye oda sıcaklığında kuluçka. Daha sonra, taze hücre kültürü orta ve karışımı 28 mililitre için çözüm aktarın. Şişedeki orta yı transveksiyon karışımı içeren ortamla değiştirin.Üç gün bekleyin ve medyayı boşa harcayın. Her şişeye beş mililitre hasat tamponu ekleyin, sonra kalan hücreleri ve havuzu hücre çözeltisi ile durulamak için her şişeye dört mililitre DPBS ekleyin. Hasat edilen hücreleri 1,000 x g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın ve lysis tampon 15 mililitre pelet eritin. Kuru buzüzerinde 50 mililitrelik santrifüj tüp dondurma kıtave eksi 20 derece santigrat dondurucuda saklayın. Kullanmadan önce, 37 santigrat derece bir su banyosunda hasat hücre lysate çözültün.Bu işlemde, iodixanol gradyan ultrasantrifüj ultrasantrifüj ile AAV arıtma gerçekleştirmek ve oda sıcaklığında bir saat ve 45 dakika için 350, 000 x g santrifüj ile ultracentrifuge tavan tüpleri kullanın. AAV içeren fazı çıkarmak için, 10 mililitrelik bir şırınga ile 18 gauge iğneyi yaklaşık iki milimetre altında, 40-60%faz sınırının altında, yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve geri çekin. Viral vektör ün beş ila altı mililitre çıkarıldıktan sonra protein bandına ulaşmadan önce durduğunuzdan emin olun.Daha sonra seyreltilmiş iyodixanol degradesini bir aniyon değişim filtresi nden geçirerek, saniyede bir damladan daha hızlı olmayan bir oranda iterek arındırın ve yoğunlaştırın. Daha sonra, yıkamak için filtre ile yavaş yavaş IE tampon üç mililitre itin. Daha sonra, bir santrifüj filtre ünitesi içine elüsyon tampon bir ila iki mililitre karışımı elute.Aygıta dört mililitrelik son bir ses hacmine DPBS ekleyin. Filtrede 0,5 mililitreden az DPBS kalana kadar oda sıcaklığında 2, 000 x g'da santrifüj bırakılır. Daha sonra, tüpün altındaki sıvıyı çıkarın, dört mililitre DPBS ile doldurun ve tekrar santrifüj edin.Bu adımı iki kez daha tekrarlayın, filtredeki konsantre vektörün hacminin son santrifüjden sonra yaklaşık 200 mikrolitre olduğundan emin olun. Bir pipet kullanarak 200 mikrolitre konsantre vektörü çıkarın ve sterilize etmek için 0,22 mikrometre filtreden geçirin. Sonra, aliquot 200 mikrolitre kilitli kesici uç ile cam bir şişe içine.Yeniden programlama faktörleri enjekte etmek için, stereotaksik çerçeveye anestezili bir fare yerleştirin. Ameliyatın başında uygun analjezi uygulayın, sonra bregma hemen üzerinde enjeksiyon iğnesi cam kapiller ucugetirmek. Hem A-P hem de M-L düzlemlerinde kılcal ucun mükemmel bir şekilde düz olduğundan emin olun.Dijital koordinat sayacında hem M-L hem de A-P değerlerini 0.0'a sıfırla. Hayvanın başının mükemmel bir şekilde düz bir konumda olduğundan emin olmak için, A-P kolu artı 2.0 ve eksi 2.0'da ve M-L kol artı 2.0 ve eksi 2.0 olduğunda D-V koordinat değerini ölçmek için dijital koordinat sayacını kullanın. Diş çubuğunun ve kulak çubuklarının yüksekliğini buna göre ayarlayın.Daha sonra, şırıngayı hafifçe kaldırın ve enjeksiyon koordinatlarında bir diş matkabı kullanarak bir delik aç. Dairesel ve nazik bir şekilde çalışarak sahada sondaj yapmaya başlayın. Daha sonra, açık kesi üzerine pamuk gazlı bez bir parça yerleştirin ve tuzlu çözelti ile şırınga floş.Kızarma sonra, bir hava kabarcığı ve viral vektör içeren çözelti bir mikrolitre çizin. Viral çözeltinin hava kabarcığı altında kolayca görüntülenediğinden emin olun. Daha sonra şırıngayı düşürün, istenilen derinliğe doğru yavaşça ilerleyin ve yörüngenin kemik parçalarından arındırdığından emin olun.Daha sonra, dakikada 0,4 mikrolitre hızında viral çözeltinin bir mikrolitre enjekte. Enjeksiyon bittiğinde, şırınga çekilmesinden önce difüzyon için iki dakika bekleyin. Difüzyondan sonra, kılcal damarın ucu tamamen beyinden çekilene kadar şırıngayı yavaşça geri çekin, sonra kesiği dikkatlice dikin ve hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın.Bilinç geri kazanılına kadar postoperatif bir istasyonda hayvan izlemek. Hayvanlar, virüs enjeksiyonundan sonra 12 haftaya kadar tutularak yerleşik glianın olgun nöronlara yeniden programlaşmasını sağlar. Bir vibratom kullanarak elektrofizyoloji için beyin dilimleri hazırlamak için, yüksek hızda striatal seviyeye aşağı en rostral kısmından beyin bölümü.Daha sonra saniyede 0.1 milimetre hızla 275 mikrometre de striatum koronally bölüm. Her bölümden sonra, enjekte edilmeyen striatal tarafı dikkatlice çıkarın ve enjekte edilen tarafı oda sıcaklığında su banyosunda bir alt ağ ve oksijenli CREB duyu slaytı ile bir şişeye aktarın. Tüm bölümler kesilene kadar şişeyi oda sıcaklığında tutun.Daha sonra, yavaş yavaş 37 santigrat derece su banyosu sıcaklığını artırmak ve 30 dakika bekletin, sonra ısıtıcı kapatın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Bir doku kesitini elektrofizyoloji için bir kayıt odasına aktardıktan sonra, cam pipeti kayıt elektrotuna monte edin ve çözeltiye indirin. Elektrotun direncini iki kez kontrol edin.Daha sonra, yavaş yavaş pipet ile yeniden programlanmış hücre yaklaşım, ucu takmaönlemek için elektrot hafif bir pozitif basınç tutarak, ve hücre yama önce GFP pozitif olup olmadığını kontrol edin. Hücre yamalı olduğunda, eksi 60'tan eksi 70 milivolta kadar olan mevcut kıskaçtaki hücreyi koruyun ve eylem potansiyellerini tetiklemek için eksi 20 ila artı 90 pikoamperes enjekte edin. Bu bir nöronal olgunlaşma ve başarılı yeniden programlama göstergesidir.Daha sonra, voltaj kıskacına geçin ve 10 milivoltun depolarize basamaklarında içe doğru sodyum ve gecikmiş potasyum akımlarının düzeltilmesini ölçün. Burada olgun nöronal morfolojisi ve dendritik dikenler gösterir biocytin dolu yeniden programlanmış nöron kayıtlı bir yazı. Burada, yeniden programlanan nöronların elektrofizyolojik kayıtları spontan aktivite önlemleri ile postsinaptik fonksiyonel bağlantıların varlığını göstermektedir.İzler pikrotoksin ile bloke inhibitör aktivitesi ni, bir GABAA reseptör antagonisti ve CNQX ile bloke uyarıcı aktivite, bir AMPA reseptör antagonisti. Yamalı nöronlar zaten beş hafta post-enjeksiyon de postsinaptik aktivite göstermek, ve sekiz ve 12 hafta post-enjeksiyon devam. Mevcut indüklenen etki potansiyelleri ile nöronların sayısı da zamanla artar.Daha ayrıntılı bir analiz, hücrelerin çoğunluğunun parvalbumin internöronlarına benzer hızlı spiking aktivitesi gösterdiği birkaç farklı ateşleme paterni ortaya çıkardı. 12 hafta sonra yapılan immünohistokimyasal analizlerde muhabir GFP ve parvalbumin'in ortak ifadesi ortaya çıktı. Bu prosedürü takiben yama arama tekniği ile gen ekspresyonunu inceleyebilir veya monosinaptik izleme ve iDISCO ile üç boyutlu sinaptik bağlantıyı değerlendirebilirsiniz.Şimdi internöronlar ifade parvalbumin içine yerleşik glia yeniden programlamak mümkün olduğu için, bu otantik olup olmadığını ve bir tedavi aracı olarak kullanılabilir araştırmaya başladı. Hayvanları kullanırken ve AAV virüsü kullanırken belirlenen protokollere ve yönergelere uymayı unutmayın.

in-vivo-direct-reprogramming-resident-glial-cells-into-interneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada görsel korteks nöronlar ve glia floresan etiketlenmesi için AAV vektörleri intrakranial enjeksiyon sunuyoruz.

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Bu video, transfekte edilmiş bir fare striatum diliminde glial hücrelerin nöronlara olgunlaşmasını ve yeniden programlanmasını değerlendirmek için bir protokolü göstermektedir. Deney, nörona özgü floresan belirteçler ve elektrofizyolojik teknikler kullanarak dinlenme membranı potansiyelini ve akım enjeksiyonlarına yanıtı ölçer. Bu ölçümler sırasındaki voltaj yükselmeleri, başarılı nöronal olgunlaşmayı ve yeniden programlamayı gösterir.

Bir Fare Beyin Diliminde Yeniden Programlanmış Nöronların Elektrofizyolojik Kayıtları

Kaynak: Pereira, M. et. al., Viral Vektörlerin İntraserebral Enjeksiyonu ile Yerleşik Glial Hücrelerin İnternöronlara İn Vivo Doğrudan Yeniden Programlanması. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, Cre'ye bağımlı nöronal yeniden programlama ve floresan raportör genleri glial hücrelere iletmek için transgenik bir farenin serebral korteksine adeno-ilişkili bir virüsün stereotaksik enjeksiyonunu göstermektedir.

Bir fare modelinde glial hücre yeniden programlaması için viral vektörlerin stereotaksik enjeksiyonu

Doğrudan soy-yeniden programlama için beyin-yerleşik hücreleri hedef beyin onarımı için yeni perspektifler sunuyor. Burada yetişkin insan serebral korteks beyin-yerleşik perisitlerden için zenginleştirilmiş kültürleri hazırlamak ve Sox2 ve Ascl1 faktörleri transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından uyarılan nöronların bu dönüştürmek için nasıl bir protokol açıklar.

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz.  Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Nöronal öncülerin in vitro lentiviral mühendisliğine dayanarak, vahşi tip beyinleri ve "test" ve "kontrol" türevlerinin eş-transplantasyonu, bu yöntem, neokortikal in vivo gen kontrolünde doğru modelleme sağlar basit ve ekonomik bir şekilde nöron morfoloji.

In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Burada, erken doğum sonrası farelerin korteksine nakledilen kortikal internöron atalarının aktivitesini manipüle etmek için kemogenetik araçları kullanmak üzere tasarlanmış bir protokol sıyoruz.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli

İnsan derisinden türetilmiş fibroblastları indüklenmiş Nöronal Progenitör Hücrelere (iNPC' ler) yeniden programlamak için bir protokol ve daha sonra indüklenmiş Astrositlere (iAs) farklılaşmalarını açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük miktarlarda iNPC'lerin ve iA'ların hızlı ve tekrarlanabilir üretimine yol açar.

Fibroblastlardan Nöronal Progenitör Hücrelere Doğrudan Dönüşüm ve Astrositlere Farklılaşma Kullanarak Nörolojik Hastalıklar için İn vitro Modelleme

Fare beyninde lusiferaz-yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden ikili muhabir bir vektör ile transdüke edilen insan nöral progenitör hücrelerinin intraparankimal transplantasyonunu tanımladık. Transplantasyondan sonra, lusiferaz sinyali, floresan mikroskobu kullanılarak beyin bölümlerinde tanımlanan in vivo biyolüminesans ve GFP eksprese eden aşılanmış hücreler kullanılarak tekrar tekrar ölçülür.

İntraserebral Transplantasyon ve Fare Beynindeki İnsan Nöral Progenitör Hücrelerinin İnVivo Biyolüminesans İzlenmesi

Burada, doğum sonrası farelerin merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerinden türetilen astrositlerin yüksek oranda zenginleştirilmiş kültürlerini ve transkripsiyon faktörlerinin zorla ekspresyonu ile fonksiyonel nöronlara doğrudan dönüştürülmelerini sağlamak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Fare Astrositlerinin İzolasyonu ve Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması

Öğrenin, AAV viral vektörlerle fare beyinlerindeki NG2-glia hücrelerini parvalbumin-pozitif internöronlara doğrudan yeniden programlama yöntemini. Bu teknik, psikiyatrik bozukluklar için hücre replasman tedavilerine yönelik araştırmalarda kullanılabilir.

In vivo doğrudan reprogramming Resident glial hücreler Interneurons viral vektörler ıntracerebral enjeksiyon ile

Daha fazla video keşfet