Name: Silah kalıntılarının varsayımsal tespiti için yeni bir bakteriyel biyosensörün hazırlanması ve uygulanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Keşfedin silah kalıntısı tespiti için bakteriyel biyosensör sentezleme yöntemini. Bu protokol sentetik biyoloji teknikleri kullanarak düşük maliyetli adli analiz alternatifi sunar ve araştırmacılara yeni uygulamalar geliştirme imkanı verir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Longwood Üniversitesi 'nde BıOL 324 (genetik) ve CHEM 403 (gelişmiş kimyasal laboratuar problemi çözme) öğrencileri, antimon ve kurşun biyosensörlerin ilk hazırlığı ve testinde yer alan öğrencileri kabul etmek ister. MicRoboCop için fikir GCAT SynBIO atölye (Yaz 2014), hangi NSF ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü tarafından finanse edilir ve Maryland Üniversitesi Baltimore County tarafından barındırılan tasarlandı. Yazarlar ayrıca Longwood Üniversitesi Cook-Cole College of Arts and Sciences ve GCAT SynBio mezunlar hibe alınan fon kabul.

Not: RFP 'yi ifade eden E. coli sentezi sunulmuştur.
1. E. coli 'den PLASMID DNA 'sı hazırlanması
<ol><li>Bir RFP geni ve ampisilin direnç geni ile bir Plasmid içeren ve e. coli 'yi, 37 °c ' de 24 saat boyunca 100 μg/ml ampisilin Içeren Luria broth (lb) agar tabakaları ile çözülür. Örneğin, sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden J10060 Plasmid kullanın (bkz. malzeme tablosu). J10060 Plasmid, pbad Organizatör bölgesinin ve ampikilin direnç geni kontrolü altında RFP (kırmızı floresan protein) için bir gen içerir. Alternatif olarak, E. coli Dönüştür (adım 3,2 BAKıN) lb agar plakaları üzerinde büyüme önce Plasmid ile.</li>
	<li>J10060 Plasmid içeren bir E. coli kültürünün 1 ml 'den DNA 'yı izole etmek için standart bir Sage protokolünü izleyin ( malzeme tablosunabakın). Aşağıdaki protokol amacı pbad Organizatör kaldırmak ve cihaz için istenen organizatör ile değiştirin etmektir.</li>
	<li>Plasmid Miniprep takipte, sindirim için hazır olana kadar dondurucuda DNA saklayın.</li>
</ol>2. kısıtlama enzim sindirim
<ol><li>EcoRI ve NheI sindirim için bir mikrosantrifüj tüpte aşağıdaki reaksiyonu ayarlayın: 10 μL J10060 plazmid DNA (1. adımda izole), 8 μL su ve 1 μL her bir EcoRI ve NheI enzimleri 1 μL tampon ile önceden karıştırılır (bkz. malzeme tablosu).</li>
	<li>Organizör DNA 'sı için, ecori ve nhei sindirim için bir mikrosantrifüj tüpünde aşağıdaki reaksiyonu ayarlayın: 10 μL tavlanmış Organizatör DNA dizileri (8 μL su ve 1 μL her bir ecori ve nhei enzimleri 1 μL tampon ile önceden karıştırılır.<ol>
<li>SB-, PB-, veya TNT-RFP için (bkz. malzeme tablosu), arabellekte oligonükleotidler çözülür (30 mm HEPES, pH 7,5; 100 mm potasyum asetat), eşit molar konsantrasyonlarda inküye, ısı Için 94 °c 2 dakika, ve yavaş rahat oda sıcaklığında serin).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Numuneleri, 10 μL 'ye ayarlanmış pipet ile yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın.</li>
	<li>37 °C ' de 30 dak.</li>
	<li>Isı 80 °C ' de enzimleri 5 dakika boyunca inaktive ederler.</li>
	<li>Bir sonraki adıma hazır olana kadar dondurucuda sindirilmiş DNA 'Yı saklayın.</li>
</ol>3. ligasyon ve dönüşüm
<ol><li>
Ligasyon
	<ol>
<li>2. adımda ecori ve nhei ile iki kez sindirilmiş olan Plasmid ve organizatör DNA 'yı kullanarak, buz üzerinde bir mikrosantrifüjlü tüpte Tablo 1 ' de gösterilen reaksiyon karışımı ayarlayın; T4 DNA ligaz son ekleyin. Not: Tablo 1 belirtilen DNA boyutları için eklemek için 1:3 vektörü bir molar oranı kullanarak bir ligasyon gösterir.</li>
		<li>Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ve mikrosantrifüjden kısaca reaksiyonu karıştırın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe.</li>
		<li>65 ° c 'de ısı devre dışı 10 dk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dönüştürme
	<ol>
<li>Son buz kristalleri ortadan kalkıncaya kadar bir tüpü 20 μL DH5-Alpha yetkili E. coli hücresi ile çözün.</li>
		<li>Hücre karışımına 5 μL plazmid DNA 'Sı ekleyin. Dikkatle hücreleri ve DNA karıştırmak için tüp 4-5 kez fiske.</li>
		<li>2 dakika boyunca buzun üzerine karışımı yerleştirin.</li>
		<li>Tam olarak 30 s için tam 42 °C Isı şok. Karıştırma.</li>
		<li>2 dakika buz üzerine yerleştirin. Karıştırma.</li>
		<li>Pipet 380 μL oda sıcaklığında SOC karışımı içine. Hemen ampisilin (100 μg/mL) içeren LB agar plakasına yayılmış ve gece 37 °C ' de inküytir.</li>
		<li>Büyüme için 24 saat içinde plakaları kontrol edin.</li>
		<li>Conta filmi ile plakaları mühürleyin ve bir sonraki adıma hazır olana kadar buzdolabında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. koloni PCR
<ol><li>Tablo 2' de gösterilen reaksiyon karışımlarının (4 reaksiyon tüpü kurmak) BIR PCR tüpüne ekleyin.</li>
	<li>Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile reaksiyonları karıştırın.</li>
	<li>Sarı bir pipet ucu kullanarak, dönüştürülmüş e. coli'nin bir kolonisini (veya çok küçük bir bölgeyi) kazımak. Bu E. coli 'nin bir kaydırmayı, kesilmiş olan yenı bir lb/ampicillin/agar plakasına aktarın ve Pipet ucunu PCR tüpüne takın. E. coli 'yi PCR karışımı ile karıştırmak için Pipet ucunu sallayın. Ek koloniler için üç kez daha tekrarlayın. PCR tüplerini bir PCR makinesine aktarın ve Tablo 3' te gösterilen programı kullanarak termobisiklet başlayın.</li>
	<li>Hangi kolonilerin Plasmid içine en iyi ligasyon olduğunu ve yeni bir plaka üzerinde bu kolonileri büyümek belirlemek için Tae% 2 agaroz jel kullanarak jel elektroforezi çalıştırın.</li>
	<li>Test için hazır olana kadar tabakları buzdolabında saklayın. Kimyasal testler için eklenen 100 μg/mL ampisilin ile Luria suyu içinde sıvı kültürü hazırlayın.</li>
</ol>5. DNA sıralaması
<ol><li>Her örnek için, 5 μL plazmid, 4 μL sıralı astar ve 3 μL deiyonize su ekleyin.</li>
	<li>Bu karışımı bir tüp içine yerleştirin ve DNA sıralaması için gönderin (bkz. malzeme tablosu).</li>
	<li>DNA dizisi verilerini analiz ederek, mutasyon olmadığından ve genlerin doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için DNA dizisi analiz yazılımını kullanarak beklenen ve gözlenen DNA dizisini karşılaştırın. Not: bir kimyasal sensör olarak E. coli kullanımı aşağıda sunulmuştur.</li>
</ol>6. E. coli kültürlerinin hazırlanması
<ol><li>Sıvı kültürler için 100 μg/mL ampisilin ile LB hazırlayın.</li>
	<li>Sensör bakterilerinin sıvı kültürlerini, pozitif kontrol * bakterileri ve negatif kontrolü * * bakterileri hazırlayın. Not: * pozitif kontrol bakterileri: bir kurucu Organizatör kontrol altında RFP geni ile bir Plasmid içeren E. coli ; Plasmid E1010 sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden (bkz. malzeme tablosu) Bu çalışma kullanılmıştır. * * Negatif kontrol bakterileri: pBad promotör (sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden Plasmid J10060) gibi farklı bir promotör kontrolü altında RFP geni ile bir Plasmid içeren E. coli (bkz. tablo Malzeme)) veya RFP geni olmayan bir Plasmid.</li>
	<li>Kültürlerin 37 °C ' de bir sallayarak kuluçk içine yerleştirin ve 220 RPM en az 8 saat, en fazla 18 h. bulutlu suyu bakteriyel büyüme gösterir.</li>
</ol>7. titreyme E. coli cihazın fonksiyonunu kontrol etmek
Not: sensörler fonksiyonu kontrol etmek için titoy edildikten sonra, bu adımın tekrarlanabilmesi gerekmez. Kurşun, antimon ve 2, 4-DNT veya 1, 3-dinitrobenzen (1, 3-DNB) ilavesi şeklinde olumlu bir kontrol, tam titrasyon gerek kalmadan her kullanım için cihazların fonksiyonunu kontrol edebilirsiniz.
<ol><li>Su içinde 10 ppm konsantrasyonuyla ilgilendiğiniz analitin (s) hisse senedi çözümünü hazırlayın. Çözünürlük bir sorundur, bir 50/50 su/metanol karışımı kullanın.</li>
	<li>Bir kılavuz olarak Tablo 4 kullanarak, steril Kültür tüpleri uygun sayıda etiket ve yer 2 kültür suyu ml (protokol adım 6) her tüp içine. Not: genel bir analitik aralığı belirlemek için, sensör bakterileri ile en az üç farklı seviyede bir analit, negatif kontrol ile bir seviye ve pozitif kontrol ile bir seviye yapın. Ayrıca hiçbir eklenen metal (negatif kontrol başka bir tür) olan bakterilerin her biri bir tüp olmalıdır. Analitik aralığı ve algılama sınırlarını daha doğru şekilde belirlemek için daha geniş bir analitik konsantrasyonları yelpazesi kullanın.</li>
	<li>Tablo 4' te belirtildiği gibi 2 ml suyu içeren tüplere analit stok çözümü ekleyin, böylece gevşek (tüpün içine hava akışına izin vermek) ve kültür tüpünü yerleştirmek için kültür tüpüne ek kapakları yerleştirin.</li>
	<li>En az 24 saat boyunca 220 rpm ve 37 °C ' de sallama kuluçkasında yer alan, Kültür tüpleri üzerinde gevşek kapaklar bırakarak.</li>
	<li>Tüplerini kuluçta çıkarın, kapakları sıkı bir şekilde tüplere çekin ve flüoresan analizine hazır olana kadar tüpleri buzdolabında saklayın.</li>
</ol>8. GSR için E. coli 'yi kimyasal sensör olarak kullanma
<ol><li>Kurşun kaldırmak için tasarlanmış bir etanol tabanlı silme kullanarak ( malzeme tablosunabakın), parmakların arasında da dahil olmak üzere, ellerin tüm yüzeyleri silin. Her el için ayrı bir temizleme kullanın. Mendilleri, analizine kadar uygun şekilde etiketli mühürlenebilir bir poşet içinde saklayın.</li>
	<li>Test edilecek yüzeyler için: büyük yüzeyler için alkol bazlı bir silme veya küçük yüzeyler için etanol ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanın. Not: sensörlerin GSR 'e yanıtını göstermek Için, harcanmış bir. 40 kalibreli kartuş Kasası, etanol nemlendirilmiş pamuklu bir çubukla temizlenmiş.</li>
	<li>Temiz eldiven giyen ve alkol ile temizlenmiş makas kullanarak, silme merkezinin yaklaşık 1 cm2 bölümünü kesti.</li>
	<li>El silme veya pamuk çubukunun kesme parçasını, 2 mL sensör bakterisi içeren bir kültür tüpüne doğrudan yerleştirin, bu da suyunda batmasını sağlar.</li>
	<li>7,4 – 7,5 adımda yukarıda açıklandığı gibi devam edin.</li>
</ol>9. Portatif Spektrometre kullanılarak floresans Analizi (bkz. malzeme tablosu)
<ol><li>Tüpleri sallamak için bir Vortex karıştırıcı kullanın.</li>
	<li>Spektrometre, 500 Nm 'lik bir uyarma dalga boyu ile RFP varyantınız için uygun dalga boyunda floresan emisyonunu toplamak için hazırlayın.</li>
	<li>Boş bir spektrum kaydetmek için Luria suyu kullanın.</li>
	<li>Dikkatle her süpernatant düşük hacimli küvet için transfer ve emisyon yoğunluğu toplamak.</li>
</ol>10.96-Well plaka okuyucu kullanarak floresan Analizi (bkz. malzeme tablosu)
<ol><li>Tüpleri sallamak için bir Vortex karıştırıcı kullanın.</li>
	<li>Transfer 200 mL suyu iyi tabak içinde bir kuyu için. Hangi numunelerin plakanın her bir kuyusu içine girmiş olduğunu kaydedin.</li>
	<li>RFP varyantı için uygun dalga boyunda emisyon yoğunluğunu toplamak için fluorimetreyi ayarlayın.</li>
</ol>11. veri analizi
<ol><li>Tüm negatif kontrollerden elde edilen sinyalin kullanılması (RFP negatif bakteri veya analiz eklenmeden sensör bakterileri), arka plan için Ortalama bir floresan sinyali hesaplayın.</li>
	<li>Sensör bakterileri için elde edilen her floresan sinyalinden, arka planda düzeltilmiş floresan yoğunluğu elde etmek için Ortalama arka plan sinyalini çıkarın.</li>
	<li>Arka planda düzeltilmiş floresan yoğunluğunu ortalama arka plan sinyaliyle bölerek sinyal-gürültü (S/N) oranını tahmin edin. S/N oranı 3 ' ten büyükse, test pozitif olur.</li>
</ol>

<ol><li>Eschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22The+Story+of+the+Real+Canary+in+the+Coal+Mine.%22%5BTitle%5D)+AND+%22The+Smithsonian+Magazine%22%5BJournal%5D)">"The Story of the Real Canary in the Coal Mine.".</a> The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).</li>
<li>The Synthetic Biology Project. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.synbioproject.org/">http://www.synbioproject.org/</a> (2019).</li>
<li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li>
<li>He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+genetically+engineered+microbial+whole-cell+biosensors+for+combined+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).</li>
<li>Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Gunshot+Residue+and+Associated+Materials-A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).</li>
<li>Bell, S., Seitzinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+binary+presumptive+assays+to+probabilistic+assessments%3A+Differentiation+of+shooters+from+non-shooters+using+IMS%2C+OGSR%2C+neural+networks%2C+and+likelihood+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%22%5BJournal%5D)">From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios.</a> Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).</li>
<li>O'Mahony, A. M., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+Detection+of+Gunshot+Residue+for+Forensic+Analysis%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Electroanalysis%22%5BJournal%5D)">Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review.</a> Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).</li>
<li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Biosensor+Technology+for+Potential+Applications+-+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9(2016).</li>
<li>Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralogous+Regulators+ArsR1+and+ArsR2+of+Pseudomonas+putida+KT2440+as+a+Basis+for+Arsenic+Biosensor+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).</li>
<li>Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Biological+Organisms+as+Chemical+Sensors%3A+The+MicRoboCop+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project.</a> Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).</li>
<li>Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+analysis+of+the+pbr+lead+resistance+determinant+of+Ralstonia+metallidurans+CH34%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34.</a> Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).</li>
<li>Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+coordination+of+Pb%28II%29+is+involved+in+the+PbrR-dependent+activation+of+the+lead-resistance+promoter%2C+PpbrA%2C+from+Cupriavidus+metallidurans+CH34%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34.</a> Bmc Microbiology. 12, (2012).</li>
<li>Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+2%2C4-dinitrotoluene+and+2%2C4%2C6-trinitrotoluene+by+an+Escherichia+coli+bioreporter%3A+performance+enhancement+by+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).</li>
<li>Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Guns+in+America%3A+The+Debate+Over+Lead+Based+Bullets.%22%5BTitle%5D)+AND+%22Newsweek%22%5BJournal%5D)">"Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.".</a> Newsweek. , (2017).</li>
<li>Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAAS+Determination+of+Antimony%2C+Barium%2C+and+Lead+Levels+in+Gunshot+Residue+Swabs%3A+An+Application+in+Forensic+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Atomic+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry.</a> Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).</li>
<li>Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+and+Behavior+of+Gunshot+Residue-A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review.</a> Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).</li>
<li>Yagur-Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+bioreporters+for+the+detection+of+2%2C4-dinitrotoluene+and+2%2C4%2C6-trinitrotoluene%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rekabet mali çıkarları veya ifşa ilgi diğer çatışmalar var.

Değişiklikler ve sorun giderme
Tablo 4 ' te açıklanan deney, tasarlanmış sensörlere uygun şekilde değiştirilebilir. Bir kimyasal sensörün en önemli yönü, duyarlılık ve özgüllüğü değerlendirmektir. Sensörün kullanışlı analitik aralığını belirlemek için çok çeşitli analitik konsantrasyonlarının analiz edildiğinden emin olmak yararlıdır. Aynı zamanda hücreler için en yüksek düzeyde analit belirlemekte değer. Bu çalışmada kullanılan analitler toksik metaller (PB v...

Bir biyosensör, bir kimyasal maddenin veya analitin tespiti için kullanılabilecek bir yanıt üreten biyolojik bileşenleri (proteinler, nüklemik asitler veya bütün organizmalar gibi) kullanan herhangi bir analitik cihazdır. Örnek olarak, kömür madencilik endüstrisi, zehirli maden gazlarının varlığını algılamak için 20. yüzyılın çoğunu bir biyosensör kullandı: kömür madeninde kanarya1. Biyoloji organizmanın (Kanarya 's) bir kimyasal analizine (karbon monoksit) yanıt (ölüm veya sıkıntı) işçiler korumak için madenciler tarafından gözlendi. Daha modern ve sofistike bir örnekte, bakterilerin bir floresan proteinin ifadesi gibi belirli bir yanıtı sergileme yoluyla belirli bir kimyasal analitin varlığına yanıt vermek için sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak değiştirilebilir.
Sentetik biyoloji, doğal olarak mevcut olmayan biyolojik cihazların ve sistemlerin inşası veya belirli bir amaç için mevcut biyolojik sistemlerin yeniden tasarımı anlamına gelen geniş bir terimdir2. Sentetik biyoloji, standart bir metodoloji ve cihazlar ve sistemlersentezlemek için kullanılabilecek standartlaştırılmış parçaların (Standart Sentetik Biyoloji Genetik elemanları) varlığı ile genetik mühendisliğinden ayrılır. Bir cihazıngenomuna, bir bakteri gibi bir organizmaya, fonksiyonun bir göstergesi olarak hizmet edecek belirli bir özelliği ifade etmek için bir parça tanıtılmaktadır. Örneğin, birçok sentetik cihazlarda, bir floresan proteinin ifadesi bir muhabir protein olarak tek bir hücreli organizmaya tanıtıldı. Birden çok aygıt bir sistemebirleştirilebilir. Bakteriler gibi mikroorganizmaların genomlar bu şekilde manipüle etmek kolaydır. Literatürde son on yıl içinde çok çeşitli kimyasal analitlere özgü biyosensörlerin çok sayıda örneği bildirilmiştir3,4.
Bu çalışmayla microbocop sistemi, adli ve çevresel kimyanın yeni uygulamaları ile sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak tasarlanan bir biyosensör örneği olarak sunulmuştur. MicRoboCop üç ayrı cihazların bir sistemdir, kombine, Escherichia coli kırmızı floresan protein (RFP) bir kişinin elleriyle veya bir yüzey toplanan silah kalıntı (GSR) varlığında ifade izin verecektir. Üç cihazın her biri, GSR5' in bir bileşeni olarak bilinen belirli bir kimyasal analit yanıt verir. Sistemin yanıt verdiği üç analitik, I. 2, 4, 6-Trinitrotoluen (TNT) ve ilgili bileşikler, II. (kurşun iyonlarının şeklinde) ve III. antimon (Ayrıca iyonlarının şeklinde).
GSR birçok farklı kimyasal madde içerir, ancak üç genellikle GSR olarak bir kalıntı tanımlamak için kullanılan Baryum, kurşun, ve antimon5. GSR tanımlaması için standart kanıt testi, enerji Dispersif X-ışını floresans (EDX)5ile Tarama elektron MIKROSKOBU (SEM) kullanmaktır. SEM-EDX, analistlerin benzersiz morfolojisi ve GSR 'nin Elemental bileşenlerini tanımlamasına olanak tanır. Şu anda, mevcut birkaç yaygın kullanılan ikili varsayımsal testler vardır. Son zamanlarda yayımlanan bir varsayım testi birçok Labs6mevcut olmayabilir özel ekipman iyon-mobilite spektroskopisi (IMS) kullanır. Genellikle mesafe belirlenmesi için veya mermi delikleri ve yaralar5GSR kimlik için kullanılan olsa da, kullanılabilecek bir kaç renk "Spot" testler vardır. Ayrıca, bu potansiyel alan taşınabilir olma avantajı vardır voltammetrik analiz, istihdam GSR için elektrokimyasal testler için literatürde bazı sınırlı dikkat olmuştur, ya da anodik sıyırma voltammetry, hangi bir son derece Metalik elemanlar için hassas Yöntem7. Diğer adli uygulamalar için bazı biyosensörler8yayınlandı olsa da, GSR tespit amacıyla özel olarak tasarlanmış biyosensörler literatürde çok az söz vardır.
MicRoboCop sistemindeki her cihaz için biyolojik unsurlar ve Plasmid inşaatı Şekil 1' de gösterilmiştir. Şekil 1B 'deki kavisli ok, analitin varlığını etkinleştiren Organizatör bölgesini temsil eder, oval, muhabir proteininin çevirisine izin veren ribozomal bağlayıcı sitedir, RFP etiketli gri kutu kırmızı ifade eden geni Floresan protein ve kırmızı sekizgen transkripsiyon sonlandırma sitesidir. Her üç cihaz, GSR algılamak için bir sistem olarak birlikte kullanılacaktır. Belirli bir promotör (SbRFP, PbRFP ve TNT-RFP) olan her cihaz, test edilen örnek ile inkübe edilecektir ve RFP floresans ölçülecektir. RFP sadece uygun kimyasal analitik mevcutsa ve organizatör bölgeyi aktive ederse ifade edilecektir. GSR 'de bulunan bazı kimyasal maddelere yanıt veren üç cihaz tasarlanmıştır ve bu çalışmanın içinde sunulmaktadır.
Üç mikrobocop cihazlarda kullanılan organizatör bir arsenik ve antimon duyarlı promotör, sbrfp9,10, bir kurşun duyarlı promotör, pbrfp11,12 ve bir TNT duyarlı promotör, TNT-RFP 13. çünkü literatürde bir arama Barium yanıt için tasarlanmış hiçbir Organizatör ortaya, TNT Organizatör bunun yerine seçildi bu Organizatör yapısal olarak ilgili bileşiklerin bir dizi duyarlı olduğundan (özellikle, 2, 4-dinitrotoluene ve dinitrobenzen), GSR 'de geride kalan organik bileşiklerin bir parçası olduğu bilinmektedir. Bu Organizatör, gömülü arazi madenlerinde13dakıka miktarları TNT ve 2, 4-Dinitrotoluen (2, 4-DNT) özellikle algılamak için başarıyla kullanılmıştır. Üç cihazı bir sistem olarak birlikte kullanarak, GSR için olumlu bir test, üç cihazda da floresan üretecek. Sadece bir veya iki cihazda floresans sinyali, analitin (s) başka bir çevresel kaynağını veya TNT promotör durumunda, GSR 'de kalan organik bir bileşik olmayan bir bileşik tarafından aktivasyonunu gösterecektir. Her üç cihazı birlikte kullanarak, çevresel kaynaklar nedeniyle yanlış olumlu sonuçlar olasılığı minimize edilir. Popülerlik kazanıyor kurşun-ücretsiz mühimmat, hala ABD 'de mühimmat satışları sadece yaklaşık% 5 temsil eder; Bu nedenle, kurşun yokluğunda nedeniyle yanlış olumsuz sonuçlar bir olasılık olabilir ama GSR14için bir marker olarak kurşun kullanan bir sensör hala yarar vardır. Bu özel adli uygulamaya ek olarak, her cihaz çevresel kontaminantların tespit edilmesi amacıyla ayrı olarak kullanılabilir.
Sunulan protokoller, cihazların fonksiyonunu kontrol etmek ve elde edilen floresan sinyalleri analiz etmek için cihazları (sensör bakterileri) ve analitik teknikleri oluşturmak için kullanılan sentetik biyoloji tekniklerini içerir. Protokol Ayrıca, bir şüphelinin elinden GSR toplamak veya bir yüzeyden GSR toplamak için sürüntü el silme şeklinde adli kanıtlar koleksiyonunu içerir. Kurşun sensör cihazının sonuçları, harcanan kartuş muhafazasını kullanarak GSR için olumlu bir testin gösterilmesi ile birlikte örnek sonuçlar olarak sunulur.

<table><tbody><tr><td>1,3-dinitrobenzen, %97</td> <td>Aldrich</td><td>D194255-25G</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dinitrotoluen, %97</td> <td>Aldrich</td><td>101397-5G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>Antimon, Referans Standart Çözelti (1000ppm &plusmn; % 1 / Sertifikalı)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SA450-100</td><td>Standardı seyreltik HNO3</td></tr><tr><td>Kesim Akıllı Tampon</td><td>New England BioLabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>Çift Yönlü Tampon</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>11-01-03-00</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF Kısıtlama Enzimi</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, HPLC sınıfı, denatüre</td><td>Acros Organics</td><td>AC611050040</td><td>Solventlerin HPLC sınıfı olmasına gerek yoktur, ACS veya reaktif sınıfı çalışacaktır.</td></tr><tr><td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Dizileme Kitleri</td><td>Eurofins Genomics</td><td>SimpleSeq Kiti Koloni için Standart</td><td></td></tr><tr><td>İleri astar PCR</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>5'- GCCGCTTGAATTCGTCATAT-3'</td></tr><tr><td>DNA dizilimi için ileri astar</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>5'- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'</td></tr><tr><td>IBI Bilim Yüksek Hızlı Plazmid Mini kiti</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47101</td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Kurşun, Referans Standart Çözelti (1000ppm ve artı; %1/Sertifikalı)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SL21-100</td><td>Standardı seyreltik HNO3</td></tr><tr><td>LeadOff Tek Kullanımlık Temizleme ve Decon Mendil</td><td>Hygenall</td><td>45NRCN</td><td>Teneke kutularda veya ayrı ayrı sarılmış olarak satılır, alkol bazlı herhangi bir mendil işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>Metanol, HPLC sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>Solventlerin HPLC sınıfı olması gerekmez, ACS veya reaktif sınıfı işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Yetkin E. coli hücreleri</td><td>New England BioLabs</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF Kısıtlama Enzimi</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>New England BioLabs</td><td>B1500S</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq Standart Tamponlu 2X Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0482S</td><td></td></tr><tr><td>Sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden plazmitler</td><td>Standart Biyolojik Parçaların</td><td></td><td>Kayıt Defteri http://parts.igem.org/Main_Page</td></tr><tr><td>Promotör Dizileri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>Sb promotörü: 5'-GCATGAATTCA 
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC 
GCTTCGAAGAGACACTACCT 
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3' 
3'-CGTACTTAAGCTCACTATA 
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC 
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG 
TTAGCGATCGCGTA-5'
 
Pb destekleyici: 5'-GCATGAATTCG 
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG 
 TGTATAATCGGCAACGCG 
AGCTAGCGCAT-3' 
3'-CGTACTTAAGCAGAA 
CTGAGATATCATTGATCTCCCACA 
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC 
GTA-5'
 
TNT organizatörü: 5' GCATTCTAGAT 
CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA 
ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT 
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT 
CGACGAAACAACGTCACTTATACA 
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT 
GAATTCGCAT3' 
3' CGTAAGATCTAGTTAA 
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA 
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT 
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC 
TTTGTTGCAGTGAATGTTTTTA 
GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA 
GCGTA5'</td></tr><tr><td>Koloni için ters primer PCR</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>5'- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3'</td></tr><tr><td>DNA dizilimi için ters astar</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>5'- GGAAACAGCTATGACCATG-3'</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr></tbody></table>

silah kalıntılarının varsayımsal tespiti için yeni bir bakteriyel biyosensörün hazırlanması ve uygulanması

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

Microbocop adli Kimya benzersiz bir uygulama için tasarlanmış bir biyosensör olduğunu. MicRoboCop, birlikte kullanıldığında, üç anahtar analitinin (antimon, Lead ve organik bileşenleri) varlığında floresan sinyali üreterek silah kalıntılarının (GSR) varlığını belirtebilmekte olan üç cihazdan oluşan bir sistemdir. Protokol, Escherichia coli (E. coli) kullanarak biyosensörlerin sentezini ve sensörlerin seçicilik ve hassasiyetini değerlendirmek için kullanılan analitik kimya yöntemlerini açıklar. Sistemin işleyişi, harcanan bir kartuş muhafazanın içinden toplanan GSR kullanılarak gösterilmiştir. Hazırlanmış bir kez, biyosensörler gerekli kadar depolanabilir ve bu anahtar analitler için bir test olarak kullanılabilir. Üç analitlerden olumlu bir yanıt, GSR için bir tahmin pozitif test sağlar, her bir cihaz diğer örneklerde analitler (örneğin, içme suyunda kurşun kontaminasyonu için bir dedektör) tespit etmek için uygulamalar vardır. Sistemin ana sınırlaması pozitif bir sinyal için gereken zamandır; gelecekteki çalışmalar, yanıt süresini optimize etmek için farklı organizmaların incelenmesi gerektirebilir.

Bu çalışta kullanılan RFP varyantı için floresan spektrumları Şekil 2' de gösterilir. Bu veriler, iki analitik, 2, 4-DNT ve 1, 3-DNB yanıt olarak kurşun ve TNT-RFP cihaza yanıt olarak PbRFP cihazdan. Bu rakam bir negatif kontrol spektrumunu gösterir (hiçbir analit eklendi), ve analitik iki farklı düzeylerde spektrum ekledi. Kullanılan RFP varyantı için maksimum floresan sinyali 575 Nm (uyarma dalga boyu 500 Nm) olarak gözlenmiştir. Şekil 3 ' teki veriler,...

Bir protokol, silah kalıntıları analizi için bir dizi bakteriyel biyosensör sentezlemek ve floresan spektroskopisi kullanılarak amaçlanan kullanım için cihazların çalışmasını sınamak için sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak sunulmuştur.

Silah kalıntılarının varsayımsal tespiti için yeni bir bakteriyel biyosensörün hazırlanması ve uygulanması

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Bu protokol, barut kalıntısının kimyasal bileşenlerini tespit etmek için tasarlanmış benzersiz bir biyosensör hazırlanması nı ve analizini açıklar. Adli uygulamalar için biyosensörlerin kullanımı benzersizdir. Genellikle adli laboratuvarlarda kullanılan son derece özel enstrümantasyon alternatif kullanımı basit, düşük maliyetli temsil eder.Açıklanan sentetik biyoloji yöntemleri standart sentetik biyoloji parçaları kullanan herhangi bir sistem için kullanılabilir. Açıklanan kimyasal analiz, kırmızı floresan proteini ifade eden tüm biyosensörler için geçerlidir. Prosedürü gösteren Andrea Soles ve Elle Richardson, Longwood Üniversitesi'nde lisans öğrencileri olacaktır.Bu prosedüre başlamak için, bir mikrosantrifüj tüpüne daha önce izole edilmiş J10060 plazmid DNA'sının on mikrolitresini ekleyin. Sekiz mikrolitre su ve EcoRI ve NHEL enzimlerinin her birinin bir mikrolitresini bir mikrolitre tampon mikrolitreile önceden karıştırın. Organizatör DNA için, taze bir mikrosantrifüj tüpüne on mikrolitre annealed organizatör DNA dizisi ekleyin.Sekiz mikrolitre su ve EcoRI ve NHEL enzimlerinin her birinin bir mikrolitresini bir mikrolitre tampon mikrolitreile önceden karıştırın. On mikrolitreye

preparation-application-new-bacterial-biosensor-for-presumptive

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Biz hızlı bakteri bulunması ve belirlenmesi için bir elektrokimyasal sensör test yöntem açıklanmaktadır. Tahlil, ribozomal RNA (rRNA) türe özgü dizileri için DNA oligonükleotid probları yakalama fonksiyonuna sahip bir sensör dizisi içerir. Yakalama prob ve yaban turpu peroksidaz bağlı DNA oligonükleotid dedektör prob ile hedef rRNA Sandwich melezleme ölçülebilir bir amperometrik akım üretir.

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Kaynak: Barber, A. E., ve diğerleri. Ateşli silah kalıntısının varsayımsal tespiti için yeni bir bakteriyel biyosensörün hazırlanması ve uygulanması. J. Vis. Uzm. (2019).Bu video, bakteriyel bir biyosensör kullanılarak spesifik analitlerin tespitini göstermektedir. Analite duyarlı bir promotör altında kırmızı floresan protein (RFP) genine sahip bir plazmit taşıyan bir bakteri kültürü alınır. Test yüzeyi iyice silindikten sonra, mendilin küçük bir bölümü kültüre daldırılır ve inkübe edilir.

Bakteriyel Biyosensör Kullanarak Hedef Analitin Tespiti

Bir ortamda askıya alınmış bakteriyel biyosensör kültürü ile başlayın.Bu mühendislik yapımı bakteriler, belirli bir fekal metabolite bağlandığında, floresan bir raporlayıcı geniyle ilişkili bir promotor aktifini aktive eden bir transkripsiyon faktörü üretir.Bu kültüre, konak-mikrobiyom etkileşimlerinde yer alan laktat gibi metabolitleri içeren filtrelenmiş bir insan dışkısı örneği eklenir.Bu karışımı taze bir ortamla seyrelterek optimal reaksiyon hacmini koruyun.İnsan bağırsak ortamını taklit...

Bakteriyel Biyosensör Kullanılarak İnsan Dışkı Metabolitlerinin Tespiti

Kaynak: Zhang, M. ve ark., Tek bir bakteride deuteryum dahil edilmesinin uyarılmış raman saçma görüntülemesi ile hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi. J. Vis. Exp. (2022)Bu video, sömürücü etiketli metabolik aktiviteyi takip ederek antibiyotiklere karşı hassasiyeti değerlendirmek için uyarılmış Raman saçılma mikroskobunun uygulanmasını göstermektedir. Karbon–döteryum sinyallerini izleyerek yöntem, dirençli ve hassas bakteri popülasyonlarının hızlı tespitini sağlar.

Uyarılı Raman Saçılma Mikroskobu Kullanılarak Bakteriyel Antibiyotik Duyarlılığının Tespiti

Litik faj biyosensörler ve antikor boncuk metisiline dirençli (MRSA) ve duyarlı stafilokok bakterileri ayırt edebiliyoruz. Faj bir kuvars kristal mikro sensörünün bir yüzey üzerine Langmuir-Blodgett yöntemi ile hareketsiz ve geniş stafilokok prob olarak çalışıyordu. Antikor boncuk MRSA tanır.

Antibiyotik Dirençli Stafilokok bakteri tespiti için biyosensör

Burada, DIG etiketli 16S rRNA hedefli DNA probları kullanılarak parafine gömülü dokulardaki bakterileri lokalize etmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu protokol, periodontitis, kanserler ve inflamatuar bağışıklık hastalıkları gibi çeşitli hastalıklarda bakterilerin rolünü incelemek için uygulanabilir.

16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti

Bu çalışmada, protein-protein etkileşimleri hibrid β-lactamase teknolojisini temel alan bir conductimetric Biyoalgılayıcı kullanarak eğitim için yeni bir yöntem rapor. Bu yöntem proton β-lactams hidroliz üzerine sürümü kullanır.

Biyomoleküler etkileşimleri algılamak için bir Conductimetric Biyoalgılayıcı β-lactamase tabanlı tahlil kullanımı

Vibrio parahaemolyticus algılamak için polylactic asit-sağlamlık, altın nano tanecikleri değiştirilme tarihi, Serigrafi karbon elektrot oluşan bir elektrokimyasal DNA biyoalgılayıcı geliştirilmesi için bir protokol sunulmuştur.

Gıda kaynaklı patojen tespit etmek için bir elektrokimyasal DNA biyoalgılayıcı gelişimi

Burada, algılama ve düşük bol moleküllerin miktar için bir protokol kapasitans Biyoalgılayıcı ile birlikte basma moleküler kullanarak karmaşık çözümlerinde mevcut.

Vericiyi biyolojik moleküler sürecinden kullanarak tespiti kapasitif Biyoalgılayıcı dayalı

Acinetobacter baumannii'nin hızlı ve hassas tespitini kolaylaştırmak için, A. baumannii enfeksiyonlarını tanımlamak için LbaCas12a endonükleaz ile birlikte Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu (RPA) kullanan bir protokol sunuyoruz.

Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu/Cas12a tabanlı bir sistem kullanılarak Acinetobacter baumannii enfeksiyonlarının hızlı ve spesifik tespiti

Keşfedin silah kalıntısı tespiti için bakteriyel biyosensör sentezleme yöntemini. Bu protokol sentetik biyoloji teknikleri kullanarak düşük maliyetli adli analiz alternatifi sunar ve araştırmacılara yeni uygulamalar geliştirme imkanı verir.

Silah kalıntılarının varsayımsal tespiti için yeni bir bakteriyel biyosensörün hazırlanması ve uygulanması

Daha fazla video keşfet