Name: Pomalidomür tabanlı homo-PROTACs tarafından E3 Ubiquitin ligase Cereblon kimyasal Inaktivasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Keşfedin, pomalidomür tabanlı homo-PROTAC'lerle E3 ubiquitin ligaz Cereblon'un kimyasal inaktivasyonunu. Bu yöntem, obezite ve enfeksiyon hastalıklarında klinik uygulamalar için yeni tedavi stratejileri sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından destekleniyordu (Emmy-Noether programı KR-3886/2-1 ve SFB-1074-J.K.; FOR2372)

1. PROTAC moleküllerinin hazırlanması
DIKKAT: kullanmadan önce lütfen tüm ilgili malzeme güvenlik veri sayfalarına (MSDS) danışın. Bu sentezler kullanılan kimyasalların birkaç toksik ve kanserojen vardır. Lütfen tüm uygun güvenlik uygulamalarını ve kişisel koruyucu ekipmanları kullanın.
<ol><li>Tert-butil N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) karbamat (bileşik 1) hazırlanması
	<ol>
<li>1, 1 '-carbonyldiimidazol Ekle (1,95 g, 12 mmol) ve bir katalitik miktarı 4-(dimethylamino) pyridine (5 mg) bir karışımı için Boc-gln-OH (2,46 g, 10 mmol) THF (50 mL) içinde 100 mL yuvarlak alt Flask bir karıştırın bar ve bir reflü kondansatör ile donatılmıştır. Net bir çözüm oluşuncaya kadar karıştırırken 10 h için reflü ısı.</li>
		<li>Döner buharlaştırıcı ile azaltılmış basınç altında solvent çıkarın, EtOAc ekleyin (200 mL) ve ayırma hunisine aktarın. Organik katmanı H2O (50 ml) ve salamura (50 ml) ile yıkayın ve na2so4üzerine kurutun.</li>
		<li>Solüsyonu Silis jeli (5 cm çap ve 5 cm yükseklikte) kısa bir yastık ile filtreleyin ve EtOAc 'ın başka bir hacmi (200 mL) ile atlatın.</li>
		<li>Solvent Buharlık ve vakum içinde elde edilmiş renksiz katı kurutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Tert-butil N-(1-metil-2, 6-dioxo-3-piperidyl) karbamat (bileşik 2) hazırlanması
	<ol>
<li>Bileşik 1 (2,28 g, 10 mmol) ile kombine edilen potasyum karbonat (2,76 g, 20 mmol) ve Dmf (25 ml) bir 100 ml Yuvarlak alt Flask ile birleştirin. Bir şırınga kullanarak iodomethane (1,42 g, 0,62 mL, 10 mmol) Drop-Wise ekleyin ve bir delinmiş kauçuk septum ile Flask donatmak. 2 h için bir ultrasonication banyo içine reaksiyon gemisi yerleştirin.</li>
		<li>EtOAc ile reaksiyon karışımı seyreltir (100 mL) ve ayırma hunisine aktarın. Organik katmanı 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 ml) ve salamura (25 ml) ile yıkayın ve na2so4üzerine kurutun.</li>
		<li>Çözücüyü filtreleyin ve Buharlık yapın. Petrol eter/EtOAc (2:1) kullanılarak silika jel (6 cm sütun çapı ve 20 cm yükseklikte) üzerinde sütun Kromatografi ile ürün arındırın.</li>
	</ol></li>
	<li>2-(2, 6-dioxopiperidin-3-il) 6-fluoroisoindolin-1, 3-Dione (bileşik 3) hazırlanması
	<ol>
<li>3-fluorofilik anhidrit (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimid 1 (1,14 g, 5 mmol) ve buzul asetik asitte (20 ml), bir karıştırın Bar ile bir 6,0 ml Yuvarlak alt Flask içinde sodyum asetat (0,50 g, 50 mmol) çözeltisi birleştirin ve bir reflü kondansatör ile donatılmıştır. 6 h için 120 °C ' de karışımı ısıtın.</li>
		<li>Soğutma sonra, H2o (100 ml) üzerine mor karışımı dökün ve 10 dakika boyunca karıştırın. filtrasyon ile oluşturulan katı toplamak, h2O (3 × 5 ml) ve petrol eter (3 × 5 ml) ile yıkayın ve vacuo kuru.</li>
	</ol></li>
	<li>4-Fluoro-2-(1-metil-2, 6-dioxopiperidin-3-il) isoindoline-1, 3-Dione (bileşik 4) hazırlanması
	<ol>
<li>3-fluorofilik anhidrit (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimid 2 (1,21 g, 5 mmol) ve buzul asetik asit (20 ml), bir karıştırın Bar ile bir reflü kondenser ile donatılmış bir 6,0 ml Yuvarlak alt Flask içinde sodyum asetat (0,50 g, 100 mmol) bir çözelti birleştirin. 6 h için 120 °C ' de karışımı ısıtın.</li>
		<li>Soğutma sonra, H2o (100 ml) üzerine mor karışımı dökün ve 10 dakika boyunca karıştırın. filtrasyon ile oluşturulan katı toplamak, h2O (3 × 5 ml) ve petrol eter (3 × 5 ml) ile yıkayın ve vacuo kuru.</li>
	</ol></li>
	<li>Tert-butil Nhazırlanması-[2-[2-[2-[[2-(2, 6-dioxo-3-piperidyl)-1, 3-dioxo-isoindolin-4-il] amino] etoxy] etoxy] etil] carbamate (bileşik 7)
	<ol>
<li>50 mL yuvarlak alt Flask ile tert-butil N-[2-[2-(2-aminoetoksi) etoxy] etil] karbamat (5, 0,41 g, 1,65 mmol), bileşik 3 (0,41 g, 1,50 mmol), Kuru Dmf (10 ml) ve dipea (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Bir karıştırın bar ve bir reflü kondansatör ile donatın. 90 °C ' de argon atmosferi altında ısı 10 h.</li>
		<li>Oda sıcaklığında soğutduktan sonra, H2O (100 ml) üzerine koyu yeşil karışımı dökün ve ayırıcı hunisinde EtOAc (3x 50 ml) ile ekstresi. Kombine organik katmanları H2O (50 ml) ve salamura (50 ml) ile yıkayın, na2so4üzerinde kuru, filtre, ve vacuo konsantre.</li>
		<li>Petrol eter/EtOAc (1:1-1:2) gradyan kullanarak silika jel (3 cm sütun çapı ve 60 cm yükseklikte) üzerinde sütun Kromatografi ile ham ürün arındırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Homodimer hazırlanması (bileşik 8)
	<ol>
<li>Α, ω-diamin bağlayıcı 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), dipea (1,05 ml, 6,00 mmol) ve kuru DMSO 'da 3 (0,83 g, 3,00 mmol) çözeltisi (20 ml), bir karıştırın Bar ile bir 50 ml Yuvarlak alt Flask ve bir reflü kondansatör ile donatılmış birleştirin. 90 °C ' de argon atmosferi altında ısı 18 saat.</li>
		<li>Oda sıcaklığında soğutduktan sonra, H2O (100 ml) üzerine koyu yeşil karışımı dökün ve ayırıcı hunisinde EtOAc (3x 50 ml) ile ekstresi. Kombine organik katmanları H2O (50 ml) ve salamura (50 ml) ile yıkayın, na2so4üzerinde kuru, filtre ve pentalaktilmolochnye konsantre.
</li>
		<li>Petrol eter/EtOAc (1:2) için EtOAc gradyan kullanarak silika jel (3 cm sütun çapı ve 50 cm yüksekliği) üzerinde sütun Kromatografi ile ham ürün arındırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Heterodimerdir hazırlanması (bileşik 9)
	<ol>
<li>Kuru CH2CL2 (10 ml) içinde bileşik 7 (0,83 g, 1,65 mmol) çözülür. Trifluoasetik asit (10 mL) ekleyin ve sarı karışımı 40 °C ' de 2 h için kapalı bir 50 mL yuvarlak alt Flask ile karıştırın.</li>
		<li>CH2CL2 (4X 5 ml) ile volatiller ve koevaporate çıkarın. 10 h için pentalaktilmolochnye kalıntı kuru.</li>
		<li>Malzemesi kuru DMF (20 mL) olarak yeniden çözünür. Bileşik 4 (0,44 g, 1,50 mmol) ve dıpea (0,78 g, 1,05 mL, 6,00 mmol) ekleyin ve Flask 'ı bir reflü kondansatörle donatın. 90 °C ' de argon atmosferi altında ısı 10 h.</li>
		<li>Oda sıcaklığında soğutduktan sonra, H2O (100 ml) üzerine koyu yeşil karışımı dökün ve ayırıcı hunisinde EtOAc (3x 50 ml) ile ekstresi. Kombine organik katmanları doymuş NaHCO3 (50 ml), h2o (50 ml), 10% khso4 (50 ml), h2o (50 ml) ve salamura (50 ml) ile yıkayın, na üzerinde kuru2so4, Filter ve vacuo konsantre.</li>
		<li>Petrol eter/EtOAc (1:2) için EtOAc gradyan kullanarak silika jel (3 cm sütun çapı ve 50 cm yüksekliği) üzerinde sütun Kromatografi ile ham ürün arındırın.</li>
		<li>Molekül yapısını (Şekil 5A bileşik 8, 5B bileşik 9) 1H NMR ve 13C NMR Spectra DMSO-d6 ' da nükleer manyetik rezonansa (NMR) göre doğrulayın Spektrometre. Her iki bileşiğin saflığının sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) yoluyla% 97 ' den yüksek olduğunu kontrol edin, 220 – 500 Nm 'de bir diyot dizi algılaması (DAD) uygulanır.</li>
	</ol></li>
</ol>2. PROTAC moleküllerinin fonksiyonel doğrulama
<ol><li>Protacs tarafından crbn bozulması Batı leke Analizi Not: bileşik efektleri8ve bileşik9crbn protein düzeyinde Batı leke analizi ile test edildi. Buna ek olarak, IKZF1 ve IKZF3 seviyeleri üzerinde etkisi de teyit edilebilir (Şekil 6).<ol><li>
Numune hazırlama
		<ol>
<li>10 mM konsantrasyonda DMSO 'da 8 ve 9, Lenalidomür (len), Pomalidomür (POM), MG132 ve mln-4924 bileşikleri çözülür ve daha fazla kullanım kadar-80 °c ' de depolar.</li>
			<li>Tohum 1 x 106 MM1S hücreleri ile 6-kuyu plaka 2,5 ml medya ve tedavi hücreleri Ile 100 Nm veya 1 μM bileşik 8 veya 9 için 24 h.</li>
			<li>Tedavi sonra hasat hücreleri ve Santrifüjü 700 x g, 5 dk, 4 °c. Kalan medyayı çıkarmak için soğuk 1x PBS ile yıkama hücresi Pelet, 700 x g, 5 dk, 4 °c santrifüjle ve supernatant atın. Bu adımı bir kez yineleyin.</li>
			<li>Lizis tampon içinde Lyse hücreleri (25 mm Tris HCl pH 7,4, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm EDTA, 5% gliserol, 1x proteaz & fosfataz inhibitörü kokteyli) buz üzerinde 10 dakika için, santrifüjlü 10 dk, 4 °c için 320 x g . Hasat süpernatant ve bir bisinkoninik asit protein tahlil (BCA tahlil) tarafından üreticinin protokole göre protein konsantrasyonu belirlemek.</li>
			<li>1x LDS yükleme tampon (5% 2-mercaptoethanol) ve kaynatma 10 dk, 75 °C ile (15 – 30 μg/örnek) denature proteinleri.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
SDS-SAYFA
		<ol>
<li>% 10 ayıran jel ile jel sandviç Fix [4 mL 3x jel tampon (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) sodyum dodecil sülfat (SDS), pH 8,45), 4 mL akrilamid 30%, 2,52 mL gliserol% 50, 1,395 mL H2O, 75 μL 11% amonyum Persülfat (APS), ve 9,75 ΜL temed] ve% 4 istifleme jeli [1,992 mL 3x jel tampon, 0,792 mL% 30 akrilamid, 3,168 mL H2O, 36 μL 11% APS ve 6 ΜL temed] bir elektrot montaj ünitesinde. Taraklar, katot tampon ile floş kuyuları çıkarın (100 mM Tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1% (w/v) SDS), ve yük örnekleri.</li>
			<li>Dolgu anot tampon (100 mM Tris/HCl, pH 8,9) tank içine. Adım 2.1.1.4 yükleme protein örneği ve SDS-PAGE 70 V, 20 dakika, ardından 115 V, 150 dk sabit voltajda çalıştırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
CRBN, IKZF1 ve IKZF3 immunoblotting ve algılama
		<ol>
<li>PVDF membranı (0,45 μm) 1 dakika boyunca% 100 metanol içinde aktive et, 1x transfer tamponunda Equilibrate membran ve ayırma jeli [10X transfer tampon (192 mM gcine, 25 mM Tris-Base/HCl, 900 mL H2O),% 20 metanol, 0,1% SDS, pH 8,3].</li>
			<li>Üreticinin protokolüne göre kasma kaseti birleştirin. 90 dk için 180 mA at transfer jeli.</li>
			<li>Yıkama membran 3x 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% ara 20) için 5 – 10 dakika her oda sıcaklığında. Blok membran 5% yağ olmayan kurutulmuş süt (NFDM), TBS-T için 1 saat oda sıcaklığında. Her biri oda sıcaklığında 5 – 10 dk için 1X TBS-T membran 3x yıkayın.</li>
			<li>CRBN için primer antikor ile membran (1:500,% 5 BSA, TBS-T), 4 °C ' de nazik sallayarak, bir gecede.</li>
			<li>Her biri oda sıcaklığında 5 – 10 dk için 1X TBS-T membran 3x yıkayın. Titreşim önleyici membran (1:10.000% 5 NFDM, TBS-T) veya tavşan karşıtı (1:5.000% 5 NFDM, TBS-T) Sekonder antikor (Oda sıcaklığında 1 saat).</li>
			<li>Oda sıcaklığında her biri 5 – 10 dk için 1X TBS-T içinde 2x yıkama membranı. 1x TBS ile bu adımı iki kez yineleyin.</li>
			<li>Üreticinin protokollerine göre HRP substrat solüsyonu ile 2 dakika boyunca membranı inkük ve bir kemiluminesans algılama cihazında kemiluminesans tespit etme.</li>
			<li>Her oda sıcaklığında 5 – 10 dk için 1X TBS 'de 1 adet yıkama membranı. Antikorların salınımı için, ticari olarak kullanılabilir sıyırma tamponunda şerit membran 15 dak. 1/3 ' te 1X TBS 'de her oda sıcaklığında 5 – 10 dakika yıkayın.</li>
			<li>Membran% 5 yağlı kurutulmuş sütte reblock, oda sıcaklığında 1 saat için TBS-T. Oda sıcaklığında her biri 5 – 10 dk, IKZF1, IKZF3 veya tübülin ile adım 2.1.3.4 göre yeniden prob için 1x TBS-T membran 3x yıkayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>MG132, MLN4942 veya pomalidomür ile rekabet denemeleri Not: crbn 'nin Ubiquitin-proteozom yolu üzerinden bozulup düşmediğini onaylamak için, proteasom inhibitörü MG132 ve bir neddylation aktivasyonu enzim (Nae) inhibitörü MLN4942 (Şekil 7) ile rekabet denemeleri gerçekleştirdik.<ol>
<li>Tohum 1 x 106 MM1S hücreler başına iyi bir 6-iyi plaka. 10 μM MG132 μM MLN4942 veya lenalidomür (100x) ile ön tedavi ve 37 °C, 5% CO2' de 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Ekle 100 nM bileşik 8 için 3 h 37 °c, 5% Co2.</li>
		<li>2.1.1 adıma göre Batı leke için hasat hücreleri.</li>
	</ol></li>
	<li>Multipl myelom hücre hatlarında hücre canlılığı Not: Bu tahlil hücre canlılığı üzerindeki etkisini test etmek için kullanılır ve ek olarak, bileşik 8 ile hücrelerin ön tarafından Multipl myelom hücrelerde imids etkisini kışkırtma (Şekil 8, Şekil 9a, B).<ol>
<li>Tohum 5 x 104 MM1S hücreler başına iyi bir 96-Well plaka için biyolojik Çoğalt canlılığı tahlil. Batı leke analizi için, tohum 1 x 106 MM1S hücreler başına iyi bir 6-biyolojik triplicates iyi plaka.</li>
		<li>Hücreleri DMSO veya 100 nM, 1 μM veya 10 μM bileşik 8, bileşik 9 veya pomalidomür ile tedavi edin ve 24 saat, 48 h veya 96 h için 37 °C, 5% Co2' de inkük edin. Kurtarma deneyleri için, 1 μM pomalidomür ve 96 h için inkük eklenmeden önce veya sonra 3 h için 100 nM bileşik 8 ile hücreleri tedavi edin.</li>
		<li>Ölçü 96-kuyu plaka Luminesans bir ışıldayan hücre canlılığı tahlil ile, bir plaka okuyucu veya hasat hücreleri üzerinde üreticinin protokole göre 6-kuyu plaka Batı leke analizi için.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li>
<li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li>
<li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li>
<li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4%28CRBN%29%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li>
<li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742(2014).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li>
<li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide%2C+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphona%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li>
<li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li>
<li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4%2C+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li>
<li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del%285q%29+MDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li>
<li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protacs%3A+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li>
<li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li>
<li>Schneekloth, J. S. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+control+of+protein+levels%3A+selective+in+vivo+targeted+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li>
<li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROTACs%3A+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247(2018).</li>
<li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li>
<li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+protein+degradation+by+PROTACs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li>
<li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li>
<li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-PROTACs%3A+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830(2017).</li>
<li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+%28PROTACs%29+of+TANK-Binding+Kinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li>
<li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li>
<li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Medchemcomm%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li>
<li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li>
<li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+%28BET%29+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+Targeting+Chimeras+%28PROTACs%29+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+%28ALK%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li>
<li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li>
<li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li>
<li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li>
<li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li>
<li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cereblon in health and disease.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li>
<li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar faiz potansiyel bir mali çatışma bildirmeyin.

CRBN için burada açıklanan gibi homo-PROTACs tasarımı CRBN için pomalidomür spesifik benzeşimi dayanır, hangi başarıyla sayısız heterobifunktional PROTACs kullanılmıştır ve PROTAC gelişimi sonuçlandı 8 bir yüksek olarak Seçici CRBN düşürücü. Molekülün özgüllüğü zaten proteomik analizlerle onaylandı24. Genetik aracılı nakavt için, yan etkilerin dışlama ve doğrulanması zorlu ve zaman alıcı bir işlemdir. Buna ek olarak, kimyasal kaynaklı bir geri dönüşümsüz, hızlı ve doğrudan geçerli...

İmmünomodülatör ilaçlar (IMiDs) thalidomür ve onun analogları, lenalidomür ve pomalidomür, multipl Myeloma tedavisi için onaylanmış, E3 Ubiquitin ligaz cereblon (CRBN) bind, cullin4A-RING E3 Ubiquitin ligaz için bir substrat adaptörü (CRL4crbn)1,2,3. İmids bağlayıcı CRL4crbn lenfoid transkripsiyon faktörleri ikaros (IKZF1) ve Aiolos (IKZF3), kendi mayası ve bozulma yol açan benzeşimi geliştirir (Şekil 1)4,5, 6 , 7 , 8. bu yana IKZF1 ve IKZF3 multipl miyelom hücreleri için gerekli olan, büyüme inhibisyonu onların inaktivasyon sonuçları. SALL4 son zamanlarda, thalidomür9,10neden 1950 ' lerde teratogenisite ve sözde Contergan felaketinden sorumlu büyük olasılıkla crbn ek bir İmid kaynaklı Neo-substrat olarak bulundu. Buna karşılık, kasein kinaz 1α (CK1α), kromozom 5q silme11ile myelodisplastik sendromunda terapötik etkiye BULAŞMıŞ crbn lenalidomür spesifik bir substrat.
Küçük moleküllerin bozulma için spesifik bir protein hedeflemesini yeteneği modern ilaç gelişimi için heyecan verici bir ima. Thalidomür ve onun analogları mekanizması insanlarda ilk kullanımından sonra keşfedilen iken, bu nedenle PRoteolysis targeting Chimeras (protacs) olarak adlandırılan özellikle bir faiz (POI) bir protein hedef için tasarlanmıştır (Şekil 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs, crbn veya von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20gibi bir E3 Ubiquitin ligaz bir ligand için bir bağlayıcı ile bağlı POI için belirli bir ligand oluşur heterobifetertional moleküller 21,22. Protacs bir geçici Üçlü Kompleks oluşumunu teşvik, E3 Ubiquitin ligaz için POI yönlendirmek, onun mayası ve proteasomal bozulması sonuçlanan. PROTACs konvansiyonel inhibitörler üzerinde önemli avantajları bir POı için bağlayıcı yerine onun inhibisyonu daha yeterli olduğunu ve bu nedenle PROTACs potansiyel olarak kabul edildi gibi proteinlerin çok daha geniş bir spektrum hedef olabilir böyle undruggable olarak transkripsiyon faktörleri15. Buna ek olarak, chimerik molekülleri katalytically hareket ve bu nedenle yüksek bir potens var. İÇN 'ye Ubiquitin transferinden sonra, Üçlü Kompleks ayrışıp ve yeni kompleksleri oluşumu için kullanılabilir. Böylece, çok düşük PROTAC konsantrasyonları hedef protein23bozulması için yeterlidir.
Burada bir pomalidomür-pomalidomür konjuge homo-Protac sentezini açıklamak (bileşik 8) kendini bozulması için crbn acemi24. E3 Ubiquitin ligaz CRBN aynı zamanda hem işveren hem de hedef olarak hizmet vermektedir (Şekil 3). Verilerimizi doğrulamak için, aynı zamanda negatif bağlama kontrolü sentezlenmiş (bileşik 9). Verilerimiz yeni sentezlenmiş homo PROTAC 'ın CRBN bozulması için spesifik olduğunu ve diğer proteinlerde sadece minimal etkilere sahip olduğunu teyit ediyor.

<table><tbody><tr><td>1,1'-Karbonildiimidazol</td><td>TCI kimyasalları</td><td>C0119</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;-(Etilendioksi)-bis (etilamin)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>385506</td><td>Bileşik 6</td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-Floroftalik anhidrit,% 98</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A12275</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimetilaminopiridin,% 99</td> <td>Acros</td><td>148270250</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Akrilamidstamml&ouml; sung/ Bisakrilamid (%30/%0,8)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Aiolos (D1C1E) mAB</td><td>Hücre sinyalizasyonu</td><td>15103S</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan Sigma'da üretilen anti-CRBN antikoru</td><td></td><td>HPA045910</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG HRP'ye bağlı antikor</td><td>Sigma</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat</td><td>Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Gln-OH</td><td>TCI kimyasalları</td><td>B1649</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Lüminesan Hücre Canlılık Testi</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>DMF, susuz, %99,8</td> <td>Acros</td><td>348435000</td><td>Moleküler Elek Üzerinde Ekstra Kuru</td></tr><tr><td>DMSO, susuz, %99,7</td> <td>Acros</td><td>348445000</td><td>Moleküler Elek Üzerinde Ekstra Kuru</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R Keçi</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare (HRP konjuge)</td><td>Santa Cruz biyoteknoloji</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteaz & Fosfataz İnhibitörü Tek Kullanımlık Kokteyl (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td><td>Hücre sinyalizasyonu</td><td>14859S</td><td></td></tr><tr><td>ImmobilonP Transfer Membranı (0,45&mikro; m)</td> <td>Merck</td><td>IPVH000010</td><td></td></tr><tr><td>İyodometan, %99</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I8507</td><td>Yüksek Toksik</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Mg132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot elektroforetik transfer hücresi</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Dikey Elektroforez Hücresi</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MLN4942</td><td>biomol (cayman)</td><td>Cay15217-1</td><td></td></tr><tr><td>Farede üretilen Monoklonal Anti-&alfa;-Tubulin antikoru (B512)</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>N-Etildiizopropilamin, %99</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız kurutulmuş süt tozu</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0830,0500</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell Beyaz Polistiren Plaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Numune Tamponu (4X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pomalidomid</td><td>Selleckchem</td><td>S1567</td><td></td></tr><tr><td>RestoreTM Western Blot Sıyırma Tamponu</td><td>Thermo Scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>sodyum dodesil sülfat</td><td>Carl Roth</td><td>183.1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>tert-Bütil N- [2- [2- (2-aminoetoksi) etoksi] etil] karbamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89761</td><td>Bileşik 5</td></tr><tr><td>Tricin</td><td>Carl Roth</td><td>6977.4</td><td></td></tr><tr><td>Trizma bazı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL sprey</td><td>Advansta</td><td>K-12049-D50</td><td></td></tr></tbody></table>

pomalidomür tabanlı homo-protacs tarafından e3 ubiquitin ligase cereblon kimyasal inaktivasyonu

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

İmmünomodülatör ilaçlar (imids) thalidomür ve onun analogları, lenalidomür ve pomalidomür, multipl Myeloma tedavisi için tüm FDA onaylı ilaçlar, ikaros (IKZF1) ve Aiolos lenfoid transkripsiyon faktörlerinin mayası ve bozulma neden (IKZF3) proteasomal bozulma için cereblon (CRBN) E3 Ubiquitin ligaz üzerinden. İmids yakın zamanda Chimeras (protacs) hedefleyen bifonksiyonel proteoliz nesil için kullanılan edilmiştir crbn E3 ligaz tarafından mayası ve proteasomal bozulması için diğer proteinlerin hedef. Biz tasarlanan ve sentezlenmiş pomalidomür tabanlı homobifunctional protacs ve kendi kendini yönettiği mayası ve crbn bozulması teşvik yeteneğini analiz. Burada, CRBN hem E3 Ubiquitin ligaz hem de hedef aynı anda hizmet vermektedir. Homo-PROTAC bileşik 8 IKZF1 ve IKZF3 üzerinde sadece minimal kalan etkileri ile yüksek bir potens ile crbn düşer. Bileşik 8 tarafından crbn inaktivasyonu hücre canlılığı ve farklı Multipl myelom hücre hatları proliferasyon üzerinde hiçbir etkisi yoktu. Bu homo-Protac multipl miyelom hücrelerinde imids etkilerini CPAP. Bu nedenle, bizim homodimeric pomalidomür bazlı bileşikler CRBN 's endojen substratlar ve fizyolojik fonksiyonları belirlemek ve IMiDs moleküler mekanizmasını araştırmak için yardımcı olabilir.

Burada CRBN bozulması için bir homodimerik pomalidomür tabanlı PROTAC tasarım, sentez ve biyolojik değerlendirme açıklanmıştır. Bizim PROTAC iki CRBN molekülleri ile aynı anda etkileşime girer ve pomalidomür kaynaklı Neo-substrat IKZF1 veya IKZF3 üzerinde sadece minimal kalan etkileri ile CRBN kendi kendine ubiquitination ve proteasomal bozulması indükler Üçlü kompleksleri formları.
Daha önce yayınlanan bir dizi pomalidomür taba...

Bu çalışma, bir pomalidomür bazlı sentez ve karakterizasyon açıklar, yeni bir yaklaşım olarak bir roman yaklaşımı ve E3 Ubiquitin ligaz cereblon (CRBN), thalidomür analogların hedefi bozulması teşvik etmek.

Pomalidomür tabanlı homo-PROTACs tarafından E3 Ubiquitin ligase Cereblon kimyasal Inaktivasyonu

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Homodimeric PROTACs Cereblon ilk kimyasal inhibitörleri ve daha fazla talidomid analogların moleküler mekanizması açıklığa kavuşturmak için yardımcı olabilir, hem de Cereblon fizyolojik işlevini araştırmak için. Bu yeni PROTAC platformu teknolojisi, özellikle takip edilemeyen olarak kabul edilen ilgi proteinlerini hedeflemek için son derece yararlı olabilir. CRBN inhibisyonu tek başına anti-tümör aktivitesi yoktur.Ancak, CRBN bozunanobezite, bulaşıcı hastalıklar ve diğer hastalıklarda klinik etkileri olabilir. Sentez zorlu ve bir PROTAC bileşiği tasarlarken etkili protein bozunur oluşturmak için optimum bağlayıcılar ve eki bulmak zor. Başlamak için, 100 mililitre lik yuvarlak dipli bir şişeye 2,46 gram Boc korumalı L-glutamin ve 50 mililitre tetrahidrofuran yerleştirin ve bir dakika boyunca 800 rpm'de karıştırın.Sonra, 1 1 gram, 1'karbonildiimidazol ve 4-piridin bir katalitik miktarda ekleyin. Glutimid bileşiğin net renksiz çözeltisi elde etmek için reflü de 10 saat karıştırmaya devam edin. Çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve çözücüyciyi döner buharlaştırıcı ile çıkarın.Etil asetat 200 mililitre kalıntı redissolve ve ayırıcı huni içine dökün. Organik katmanı 50 mililitre deiyonize su ve salamura ile yıkayın ve organik katmanı sodyum sülfat üzerine kurulayın. Yerçekimi desiccant kaldırmak için silika jel ile çözüm filtre, ve sonra etil asetat 200 mililitre ile silika jel durulayın.Renksiz bir katı olarak Bileşik 1 elde etmek için vakum altında filtrasyon solvent çıkarın. Kullanmadan önce ürünü bir gecede vakum altında kurulayın. Sonra, bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir 100 mililitre yuvarlak alt şişe de buzul asetik asit 20 mililitre sodyum asetat 0.50 gram çözün.3-floroftalans anhidrit 1.25 gram ve glutarimid 1.14 gram ekleyin ve Bileşik 3 mor bir çözüm elde etmek için altı saat reflü karıştırın. Karışımı oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve sonra deiyonize su 100 mililitre içine dökün ve Bileşik 3 çökelti için 10 dakika karıştırın. Filtrasyon ile katı toplamak, su ve petrol eter ile yıkayın ve iki gün boyunca vakum altında kurulayın.Sonra, 50 mililitrelik Schlenk şişesine 0,83 gram Bileşik Üç ve 20 mililitre kuru dimetil sülfoksit yerleştirin ve iki dakika karıştırın. Alfa omega diamin bağlayıcı Bileşik 0.22 gram ekleyin 6, ve N mililitre, N-diisopropiletiltilemin ve argon altında karışımı karıştırın 90 santigrat derece için 18 saat boyunca homodimer elde etmek 8 koyu yeşil karışımı. Karışımı oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve 100 mililitre deiyonize suya dökün.Etil asetat üç 50 mililitre porsiyon içine ürün ayıklayın, organik katmanları birleştirmek ve 50 mililitre su ve salamura her onları yıkayın. Yıkanmış organik katmanı sodyum sülfat üzerine kurutun, kurutucuyu filtreleyin ve vakum un altındaki çözücüü çıkarın. Kalıntıyı en az miktarda kromatografi çözücüde çözün ve saflaştırma için silika jel kolona uygulayın.Floresan ürün fraksiyonları toplamak, bunları birleştirmek ve sarı bir katı olarak Homodimer 8 elde etmek için çözücü kaldırın. Başlamak için, 100 mililitre yuvarlak alt şişede dimetilformamid 25 mililitre Glutarimid 1 2.28 gram çözünür. Bu çözeltide 2,76 gram öğütülmüş potasyum karbonatı askıya alın.Daha sonra, 20-gauge iğne ile donatılmış bir şırınga içine iyodometan 0,62 mililitre çizin. 10 saniye boyunca iyodometan damla-bilge ekleyin. Stopper bir lastik septum ile şişe, ve bir havalandırma iğnesi ekleyin.Glutarimide Bileşik 2 elde etmek için oda sıcaklığında iki saat boyunca karışımı sonicate. Karışımı 50 mililitre etil asetat ile seyreltin ve ayırıcı bir huniye dökün. Şişeyi 50 mililitre daha etil asetatla huniye durulayın.Ürünü çalıştırın ve renksiz bir katı olarak Glutimid 2 elde etmek için silika jel sütun kromatografisi ile arındırın. N-metilasyonun başarılı olduğunu doğrulamak için Glutimid Bileşikleri 1 ve 2'nin bekletme sürelerini karşılaştırın. Doğrulamaya başlamak için, birden fazla miyelom hücrelerini ilgi çekici bileşiklerle tedavi edin.İlgili proteinleri izole edin ve protein yıkımının Batı Leke analizi için numuneler hazırlayın. Daha sonra, SDS-PAGE için bir jel sandviç hazırlayın ve anod tampon tankını pH 8.9 tris-HCl çözeltisi ile doldurun. Jel içine protein örnekleri yükve 20 dakika boyunca 70 Volt çalıştırın, 150 dakika boyunca 115 volt takip.Daha sonra, immünoblotting için 1x transfer tampon ulayın ve dikkatle dengelemek için transfer tampon için kasetten jel taşıyın. Jeli denge için kasetten çıkarırken çok dikkatli olmalısın, çünkü çok hızlı bir şekilde patlayabilir ve buruşabilir. 0.45 mikrometrelik poliviniliden diflorit membranını saf metanolde en az 20 saniye boyunca aktif hale getirin ve 1x transfer tamponuna batırın.Jel ve membran 10 dakika boyunca dengesağlar. Daha sonra, Batı Blotting kasetmonte ve membran proteinleri aktarmak için 90 dakika boyunca 180 miliamperes uygulayın. Daha sonra, immünoboyama ile proteinleri görselleştirin.Hücre canlılığı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, ilk olarak, tohum 50, 000 multipl miyelom hücreleri biyolojik triplicate bir 96 iyi plaka iyi başına. DMSO veya Bileşik 8, Bileşik 9 veya pomalidomid 0.1, bir veya 10 mikromolar içeren medya her iyi 100 mikrolitre ekleyin. Hücre canlılık kurtarma deneyi gerçekleştirmek için, bunun yerine üç saat boyunca, pomalidomid bir mikromolar çözeltisi ekledikten sonra, üç saat boyunca Bileşik 8 100 nanomolar çözüm ile hücreleri tedavi.Hücreleri %5 karbondioksit atmosferinde 37 derecede 24, 48 veya 96 saat kuluçkaya yatırın ve canlılığı Parlak bir tözle ölçün. Homodimerik PROTAC 8'in yapısı proton ve karbon NMR ile doğrulandı. Heterodimerik PROTAC 9 negatif kontrol olarak sentezlendi, glutarimide kısmı içinde N-metilasyon Cereblon kaybı ile sonuçlanır gibi, veya CRBN, bağlama yeteneği.Homo PROTAC 8 lenfoid transkripsiyon faktörleri IKZF1 ve IKZF3 üzerinde minimal etkileri ile tam proteozomal CRBN yıkımı yakın indüklenen. Buna karşılık, hetero PROTAC 9 pomalidomides benzer davranış gösterdi. Bileşik 8 indüklenen CRBN bozunması proteozomun doğrudan inhibitörü tarafından engellenebilir veya dolaylı olarak netilasyon inhibisyonu tarafından engellenebilir.Bileşik 8 ile önceden tedavi edilen hücreler pomalidomidin IKZF1 ve IKZF3 üzerindeki etkilerine önemli ölçüde direndi. Bileşik 8 indüklenen CRBN bozulması, 96 saat sonra bileek 9 ve pomalidomidden IKZF3 bozulmasına göre multipl miyelom hücre canlılığı üzerinde çok daha az etkiye sahipti. Bileşik 8 ile ön tedavi edilen multipl miyelom hücreleri pomalidomide maruz kaldığında tedavi edilmeyen hücrelere göre önemli ölçüde daha fazla canlılığa sahipti, bu da Bileşik 8'in immünmodülatör IMiD ilaç direncini taklit etmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir.Biz Bileşik 8 Cereblon tam proteazomal bozulma neden olduğunu bulundu, IKZF1 ve IKZF3 hücre canlılığı ve çoğalması üzerinde hiçbir yan etkisi yoktur. Proje teknolojisinin diğer hedeflere genişletilmesi, kanser ve diğer hastalıklarla ilgili proteinlerin etkisiz hale ilmesi ve izlenmesi potansiyeline sahiptir. Bu tekniği diğer ilaçlar ve proteinler için uyarlarken, en uygun bağlantıları ve ekleri seçmek için ilacın moleküler yapılarını ve protein hedefini dikkatle araştırmalıdır.MiDs Cereblon bir nokta mutasyonu nedeniyle farelerde çalışmaz, ancak daha fazla hayvan çalışmaları için kullanılabilecek bir transgenik knock-in fare modeli vardır. Pomalidomid analog talidomid olduğundan, yüksek oranda teratojeniktir, bu ilaçlarla çalışan hamile kadınları önermiyoruz.

chemical-inactivation-e3-ubiquitin-ligase-cereblon-pomalidomide-based

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Mitoz geçiren kanser hücrelerinde fenantridin PJ-34 sitotoksik aktivite canlı konfokal görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak belgelenmiştir. PJ-34 eradike insan meme kanseri MDA-MB-231 mitoz İlave sentrozom barındıran hücreler. Normal iki odak mitoz farklı olarak, ekstra-sentrozom PJ-34 varlığında iki kutup mili kümelenmiş değildi.

Anormal Mitoz ile İlişkili Hücre Ölümü Canlı Kanser Hücreleri Konfokal Görüntüleme Uyacakları

Çevresel kimyasallar ve ilaçlar enzimatik bioactivated kovalent DNA oluşturma ara ürün için adducts, olmak, potens değerlendirilmesi, kanser ve tedavisi geliştirilmesinde önemli bir alandır. Yöntemleri teknikleri onların algılama ve miktar yanı sıra DNA adducts forma bileşik harekete geçirmek için açıklanmıştır.

Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını 32P-postlabeling tarafından Adducts

Bu kağıt akış sitometresi-tabanlı bir tahlil kimyasal inhibitörleri ekran kitaplıklarına inhibitörleri ve T hücre reseptör sinyal etkileyen hedefleri tanımlaması için kullanır. Yöntem tanımlamak burada da yüksek üretilen iş gösterimleri için genişletilebilir.

T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Bu protokol, bir hedef proteine kaynaşmış antikor içermeyen endojen protein algılama etiketini eksprese etmek için CRISPR / Cas9 kullanılarak tasarlanan canlı hücrelerdeki protein bozunma kinetiğinin kantitatif ışıldayan tespitini açıklar. Kantitatif bozunma parametrelerini, hızı, Dmax, DC 50 veDmax 50'yi hesaplamak ve elde etmek için ayrıntılı talimatlar dahil edilmiştir.

HiBiT CRISPR Hücre Hatları Kullanılarak Hedeflenen Protein Bozunma Bileşiklerinin Yüksek Verimli Hücresel Profillemesi

Burada, daha önce sentezlenmiş spirosiklik oksimleri test etmek için 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5- difeniltetrazolyum bromür (MTT) kullanan bir biyotahlil tarif ediyoruz.

İşlevselleştirilmiş spirrosiklik heterosiklus sentezi ve sitotoksisite testi

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Bu makale, CRISPR/Cas9 sistemi ve üç fenotip tabanlı tarama stratejisi kullanılarak sentromerle ilişkili protein-E (CENP-E) nakavt hücrelerinin yapımını bildirmektedir. İlaç geliştirme ve biyolojik araştırmalar için yararlı olan CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yeni bir yaklaşım oluşturmak için CENP-E nakavt hücre hattını kullandık.

CRISPR/Cas9 Sistemini Kullanarak Sentromerle İlişkili Protein-E CENP-E-/- Nakavt Hücre Hatlarının Üretilmesi

Burada, ubikitin ligazları Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) ve Cereblon (CRBN) içeren kimeraları (PROTACS) hedefleyen proteoliz tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için protokolleri açıklıyoruz.  Burada gösterilen biyofiziksel yöntemler arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur.

Kimeraları Hedefleyen Proteoliz Tarafından İndüklenen Üçlü Kompleks Oluşumunun Değerlendirilmesi için Biyofiziksel Testlerin Geliştirilmesi ve Uygulanması (PROTACS)

Bu iki boyutlu (2D) öncülerden desenli ve yeniden yapılandırılabilir parçacıkların sentez deneysel olarak açıklanacaktır. Bu metodoloji polyhedra ve mikro ölçekte santimetre arasında değişen uzunluk ölçeklerinde kavrama cihazları dahil olmak üzere, çeşitli şekillerde de parçacıklar oluşturmak için de kullanılabilir.

Origami Inspired Desenli ve Reconfigurable Parçacıkların Self-assembly

Keşfedin, pomalidomür tabanlı homo-PROTAC'lerle E3 ubiquitin ligaz Cereblon'un kimyasal inaktivasyonunu. Bu yöntem, obezite ve enfeksiyon hastalıklarında klinik uygulamalar için yeni tedavi stratejileri sunar.

Pomalidomür tabanlı homo-PROTACs tarafından E3 Ubiquitin ligase Cereblon kimyasal Inaktivasyonu

Daha fazla video keşfet