Integrin gerginlik ve hücresel kuvvet bütünleştirici gerilim sensör ile Mikronaltı çözünürlükte görüntüleme

Bu DNA tabanlı integratif gerilim sensörü, ya da ITS, yerel floresan kuvvet sinyali dönüştürme floresan mikroskop ile hücresel kuvvetdoğrudan görüntüleme sağlar. ITS yüksek uzamsal çözünürlüğe ve yüksek duyarlılığa sahiptir. Etkinleştirme eşiği, farklı düzeylerde integrin gerilim seçici görüntü sağlayan, mümkün değildir.

Tiyal ssDNA quencher RGD peptid eşleştirmek için özelleştirilmiş tek iplikçikli DNA, ya da ssDNA aldıktan sonra, ilk taze hazırlanmış TCEP çözeltisi yaklaşık 450 mikrolitre su 400 mikrolitre 0.5-molar EDTA 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakikalık kuluçka için PBS'de 20 mikrolitre bir milimolar tiyol DNA söndürücüye TCEP-EDTA çözeltisinin 10 mikrolitresini ekleyin. RGD aminini sulfo-SMCC ile eşleştirmek için, oda sıcaklığında 20 dakikalık kuluçka için taze hazırlanmış 11 milimolar RGD amin çözeltisine 100 mikrolitre taze hazırlanmış 23 milimolar sulfo-SMCC'ye 40 mikrolitre ekleyin.

RGD amin SMCC'yi tiyote ssDNA quencher ile birleştirmek için, tiolated ssDNA quencher çözeltisinin tüm hacmini oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için RGD amin SMCC çözeltisinin tüm hacmiyle karıştırın. Kuluçka sonunda, çözeltiyi bir gecede dört derecelik santigrat depolamaya aktarın. Ertesi sabah, tiyol konjuge DNA çözeltisi ve eksi 20 derece santigrat, soğutulmuş, 1-10-25 oranında% 100 etanol ile üç molar sodyum klorür karıştırın ve yaklaşık 30 dakika boyunca eksi 20 derece santigrat reaksiyon yerleştirin.

DNA çöktüğünde, SANtrifüj ile DNA'yı toplayın ve bir spektrometredeki DNA konsantrasyonunu ölçümleri için PBS'deki peleti yeniden askıya alın. İntegratif gerilim sensörü veya ITS sentezi için, üst ve alt iplikçik DNA çözümlerini 1,1 ila bir molar oranında karıştırın ve uzun süreli depolama için karışımın aliquots yerleştirmeden önce dört derece santigrat reaksiyon bir gecede kuluçka. ITS immobilizasyon için, kat 29 milimetre çapında, cam dip petri çanak ile 200 mikrolitre 0.1-mililitre başına mililitre biyotinylated sığır serum albumin, veya BSA-biotin, için 30 dakika dört derece santigrat.

BSA-biotin cam yüzeye fiziksel olarak adsorbe olduğunda, yıkama başına 200 mikrolitre taze PBS ile üç kez bulaşık yıkayın, ardından 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca mililitre başına 50 mikrolitre avidin proteini 200 mikrolitre ile kuluçka. Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi PBS ile çanak üç kez yıkayın ve dört santigrat derece başka bir 30 dakikalık kuluçka için 0.1-mikromolar ITS 200 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, pbs ile çanak üç kez yıkayın, hücre kaplama kadar çanak son yıkama bırakarak.

Bir balık keratosit kültürünü başlatmak için, bir balık tan ölçek bir parça koparmak için düz uçlu bir cızırtı kullanın, ve yavaşça bir değiştirilmemiş cam alt Petri çanak kuyu üzerine ölçek basın, ölçeğin iç tarafı cam temas ile. Tam Iscove's Modifiye Dulbecco's Orta bir milimetre ile ölçek kaplamadan önce balık skalası yemeğin cam yüzeyine uymak için yaklaşık 30 saniye bekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında altı ila 48 saat boyunca karanlık ve nemli bir kutu içinde ölçek kuluçka.

Keratositleri ITS yüzeyine kaplamak için, keratosit kültür çanasından orta yı oda sıcaklığında üç dakikalık bir kuluçka için 1X hücre ayırma çözeltisi ile değiştirin. Kuluçka sonunda, ayırma çözeltisini taze tam ortamla değiştirin ve hücreleri nazik pipetleme ile ayırın. Daha sonra hücreleri kaplama için uygun konsantrasyona ayarlayın ve görüntülemeden önce oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ITS kaplı tabağa yerleştirin.

Canlı hücrelerde yarı-gerçek zamanlı integrin gerilim görüntüleme için, bir floresan mikroskobun aşamasına hücreleri aktarın ve 40 veya 100 kez objektif seçin. Görüntüleme yazılımında, ITS görüntülerinin videosunu elde etmek için pozlama süresini bir saniyeye ve 20 saniyelik kare aralığına ayarlayın. Ardından, en son kare aralığında yeni üretilen ITS sinyalini hesaplamak için ITS videosunun önceki bir karesini geçerli bir çerçeveden çıkarmak için uygun bir görüntü analizi yazılımı programı kullanın.

Yeni üretilen ITS sinyali, en son kare aralığında oluşan integrin gerilimini temsil eder ve bu da hücresel kuvveti yarı-gerçek zamanlı olarak raporeder. Burada integrin gerilim haritalaması keratosit göçü sırasında iki kuvvet parçasında integrin geriliminin indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir. Kuvvet haritasının çözünürlüğü 0.4 mikrometre olarak kalibre edilebilir.

Yüksek integrin gerilimi hareketli balık keratositlerde arka kenarboşluğunda yoğunlaşmıştır. Motile olmayan hücrelerde, hızlı göç eden keratositte gözlenenden oldukça farklı olan spesifik bir integrin gerilim deseni oluşur. Fokal yapışıklıklar ve balık keratositlerinin integrin gerilimi ilgi hücrelerinde integrin gerilimi ve hücre yapısı arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için birlikte görüntülenebilir.

ITS ile hücre yapışma kuvveti, hücre yapısal görüntülemesine benzer bir çözünürlük ve duyarlılıkla görünür hale gelir. Bu teknik, hücrelerde bir kuvvet yapısı etkileşimi çalışması için yol açıyor.