Bir do-it-yourself Bioprinter ile tasarlanan Biyosilmların üç boyutlu deseni

Bakterilerle 3D biyobaskı yeni geliştirilen bir tekniktir. Bu protokol, bakterilerle basılmış 3D mühendislik biyofilmlerini oluşturmanın kolay bir yolunu sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı ucuz bir ev yapımı 3D yazıcı kullanarak 3D baskılı biyofilm üretmek için yeteneğidir.

Bizim 3D yazıcı nın olası bir uygulama yeni antibakteriyel tedaviler geliştirmek için kullanılabilecek tekrarlanabilir model biyofilmler oluşturmaktır. 3D baskı yaklaşımımız aljinat bazlı bioink ile uyumlu her türlü bakteriye uygulanabilir. Bioink ve baskı yüzeyleri hazırlanması oldukça standart prosedürler, 3D baskı işlemi, özellikle Z-ekseninin kalibrasyonu bazı uygulama gerektiren önemli bir adımdır.

Ayarlanan erişim yüksekliğinin kalibrasyonu 3D yazıcımızın çözünürlüğünü etkileyecek tir ve kişisel deneyime güçlü bir şekilde bağlıdır. Bu yordam el ile ayarlamalar gerektirir ve yazılı bir biçimde açıklanabilir zordur. 200 mikrolitrelik pipet ucunu silikon boru uzunluğuna bağlayın ve pipet ucunu orijinal ekstrüzyonun yerine 3D yazıcının ekstrüder kafasına monte edin.

Sonra, luria-Bertani suyu çözünmüş% 1 agar 400 mililitre beş azı dişil klorür çözeltisi dört mililitre ekleyin ve uygun antibiyotik ve indükleyiciler ile tamamlayın. Daha sonra, 15 milimetre Petri çanak her 150 milimetre içine LB agar çözeltisi 20 mililitre dağıtmak. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kapağı açık, çanak kuru.

%3 sodyum aljinat çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi sterilize etmek için kaynama noktasına üç kez ısıtın. Daha sonra steril çözeltiyi kullanılana kadar dört santigrat derecede saklayın. Bioink bakteriyel bileşeni hazırlamak için, antibiyotik içeren LB orta 50 mililitre kurucu GFP ekspresyonu için plazmidler taşıyan E.coli bakteri büyümek.

Bir gecede 250 RPM ve 37 santigrat derecede kültürü salla. Kültürün bir gecede büyüme sonra, 3, 220 kez yerçekimi beş dakika için bakteri pelet ve sonra supernatant kaldırın. LB orta 10 mililitre bakteri pelet resuspend, ve% 3 sodyum aljinat 10 mililitre ekleyin.

3B yazıcıyı bir bilgisayara bağlayın ve 3B yazdırma yazılımını açın. Yazdırma kafasını ana konumuna taşımak için X, Y ve Z eksenleri için Ana Ekran düğmesini tıklatın. Her baskı için, baskı yatağında belirli bir konuma hazırlanmış bir baskı alt katmanı yerleştirin.

Baskı kafasını manuel kontrol altında 22 milimetrenin üzerinde bir yüksekliğe yükseltin, böylece hareket sırasında Petri kabının kenarıile çarpışmaz. Baskı kafasını plakanın üst üzerine yerleştirin ve pipet ucu baskı yüzeyine değene kadar aşağı doğru hareket ettirin. Bu Z ekseni konumunu yazdırma yüzeyinin yüksekliği olan Z1 olarak atayın.

Ardından, yazdırma kafasını kaldırın ve el ile plaka alanının dışına taşıyın. Yazdırma kafası ile plaka yüzeyi arasındaki çalışma mesafesi Z2 olarak tanımlanıyorsa, yazdırma sırasında Yazdırma programına yazdırma yüzeyinin yüksekliğini ve çalışma mesafesini Z değeri olarak girin. İstenilen şekli yazdırmak için komutlar içeren önceden programlanmış bir G kodu dosyası yükleyin.

Her komut satırında, yazdırma kafasının konumu X, Y ve Z eksenlerinde değiştirilebilir. Yazdırma yüzeyinin yüksekliği ve çalışma mesafesi olarak tüm yazdırma adımlarında Z değerini girerseniz emin olun. Şırıngalar içine sıvı bioink yükleyin ve 3D biyoyazıcı şırınga pompası onları monte.

Ardından ekstrüzyon hızını saatte 0,3 mililitreye ayarlayın. Yazdır düğmesini tıklatarak bioink'i yazdırma alt katmanına yazdırın. Baskı başlayana kadar ve baskı kafası baskı yüzeyi ile temas etmeden önce şırınga pompasını başlatmak için bekleyin.

Yazdırma sırasında, yazdırma kafası hareketini tamamen yazılım la kontrol edin. Baskı kafası baskının son noktasına varır varmaz şırınga pompasını durdurun, aksi takdirde fazla bioink baskı alt katmanına düşecek ve baskı çözünürlüğünü azaltacaktır. 3B yapıların inşası için, yazdırma kafasının tüm hareketleri G-code düzenleyicisinde kontrol edilir.

İkinci katmanın yazdırma yüksekliğini artırmak için, ilk katmanın yazdırma yüksekliğini yazın ve koddaki Z değerini 0,2 milimetre artırın. Daha sonra, daha yüksek bir katmana taşınırken Z değerini 0,1 milimetre artırın. Curli lifleri gibi biyofilm bileşenlerinin üretimine izin vermek için yazdırılan numuneleri üç ila altı gün oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.

Daha sonra plakayı floresan tarayıcıya yerleştirin ve plakaları görüntüleyin. Aljinat matrisini eritmek için, pH 7'de 0,5 molar sodyum sitrat çözeltisinin 20 mililitresini baskılı substrata ekleyin. 30 rpm sallayarak iki saat boyunca oda sıcaklığında plaka kuluçka.

Daha sonra, sitrat tedavisinden önce ve sonra plakaların görüntüleri ile karşılaştırmak için sıvı yı atın ve plakaları tekrar görüntüleyin. 3D biyoyazıcı, hidrojelleri çeşitli iki boyutlu ve üç boyutlu şekillerde kapsülleme bakterileri oluşturabilir. Bu baskılı şekiller daha sonra biyofilm oluşumu başarılı olup olmadığını veya aljinat matris tamamen bir sodyum sitrat çözeltisi kullanılarak çözülmüş olup olmadığını değerlendirmek için kullanılabilir.

Indüklanabilir Curli üretim plazmidolmadan bioink durumunda, basılı desen tamamen sodyum sitrat tedavisinden sonra çözülmüş, hiçbir biyofilm Curli ağ oluşmuştu anlamına. İndüklenebilir Curli üretim plazmidi içeren bakteriler sodyum sitrat tedavisinden sonra çözünmedi, baskılı bakterilerin bakteri baskılı desen stabilize etmek için yeterince geniş bir Curli ağ oluşturmak mümkün olduğunu gösteren. Çok katmanlı yapılar oluşturmak için, g kodu düzenleyicisi denetleyerek ek katmanlar yazdırılabilir.

Bir örnekteki yazdırılan katmanların sayısının artırılması, yazdırılan yapıların genişliğinin ve yüksekliğinin artımlı olarak artmasına neden oldu. Curli proteinlerini inducibly üretmek için tasarlanmış E.coli çok katmanlı yapılar halinde basıldığında, sodyum sitrat tedavisi örnekleri eritmedi, e.coli üreten olmayan içeren çok katmanlı yapılar çözüldü. 3D baskı prosedürünün en kritik bölümleri Z ekseninin kalibrasyonu ve baskının başlatılması ve şırınga pompasının başlatılmasının koordinasyonu.

Bu işlem için geliştirilen bioink oldukça yumuşak, düşük tokluk ile. Mekanik stabiliteyi sağlamak ve iyileştirmek için bioink'te daha fazla değişiklik yapılabilir. Bu 3D baskı tekniği, biyomimetik malzemelerin üretilmesini mümkün kılan mükemmel mekanik özelliklere sahip biyofilmlerin üretilmesini sağlar.

Bu bakterileri kullanırken eldiven gibi uygun korumayı kullanın.