Name: Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Öğrenin, COS-1 hücreleri ve kollajen hidrojel kullanarak sinir sistemi gelişiminde aksonal büyüme ve yönlendirmeyi analiz etme yöntemini. Bu teknik, nörogelişim araştırmalarında hızlı ve basit sonuç analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, teknik yardım için editoryal tavsiye ve M. Segura-Feliu için Tom Yohannan teşekkür ederiz. Bu çalışma CERCA programı tarafından ve üniversiteler ve Inovasyon, üniversiteler ve Generalitat de Catalunya (SGR2017-648) Işletme departmanı Araştırma Komisyonu tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışma, Ispanyol araştırma, yenilik ve üniversite (MEICO) BFU2015-67777-R ve RTI2018-099773-B-100, Ispanyol prion ağı (Prionet Ispanya AGL2017-90665-REDT) ve Enstitüsü Carlos III, CIBERNED (tarafından finanse edildi PRY-2018-2).

Tüm hayvan deneyleri, Barcelona Üniversitesi 'nin hayvan deneyleri Etik Komitesi (CEEA) kuralları ve protokolleri altında yapıldı ve bu çalışmada kemirgenler kullanımı için protokol incelenip, CEEA tarafından onaylanmıştır. Barselona Üniversitesi (CEEA onayı #276/16 ve 141/15).
1. rat tail kollajen arıtma
<ol><li>Yetişkin Sprague-Dawley sıçan kuyrukları toplayın (8-9 hafta eski) etik yönergelere aşağıdaki hayvan ödün sonra ve% 95 etanol durulama. 2-4 kuyrukları buz üzerinde (4 °C) yerleştirin ve süreç boyunca buzla kaplı tutun.</li>
	<li>Kuyruk tendonları elde etmek için, bir hemostat kullanarak kuyruk en kaudal vertebra kuyruğunu düzeltmek ve ikinci bir hemostat yaklaşık 5-7 mm konumlandırılmış ilk ile kuyruk sıkıştırmak. Her iki hemostats ile keskin bir şekilde büküm kuyruk break. Bunu yapmak için, kırılana kadar vertebra birkaç kez katlayın/açın.</li>
	<li>Omurgaları yavaşça, hemostat ile çekin ve tendonları kılıfından ayırın. Şu anda, küçük makas ile tendon kes. Bu tendon parçaları steril 100 mm Petri çanak buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Tendonlar tamamen Ayıklanacak kadar kuyruk geri kalanı için bağlama ve sürgülü tekrarlayın.</li>
	<li>Tüm elde edilen kuyruklar için 1.2-1.4 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Mikroskobun altında tendonları gözlemlemek. Küçük makas ile kesim ve tendon saflık geliştirmek ve tendonları 3 kez ultra saf su ile durulayın düz ince forseps ile tutarak kan damarlarını atın.</li>
	<li>Islak tendon 3-4 g toplayın. 150 mL 'de% 3 buzul asetik asit olarak 4 °C ' de, 24-36 h için 200-250 mL 'Lik cam konik Flask içinde tendonları yumuşak karıştırma altında çözülür.</li>
	<li>20.000 x g 'de Santrifüjü 1 saat için. Paralel olarak, yaklaşık 10-15 cm uzunluğundaki bir parçayı keserek Dializ boru membranı hazırlayın ve 15 dakika boyunca 1 mm etylenediaminetetraasetic asit (EDTA) içeren ultra saf suda kaynatın. Bundan sonra Dializ membranı yavaşça Ultra Saf suyla iyice durulayın.</li>
	<li>Santrifüjden sonra Dializ boru membranında süpernatant 'ı decantation ile toplayın. Pelet asidik çözünmez malzeme içerir (non-collagenous proteinler) ve süpernatant çözünür kollajen proteinleri içerir.</li>
	<li>2 l steril 0.1 x asgari Essential orta kartal (MEM), pH 4,0 bir 2-5 L cam Beaker karşı süpernatant Dialyze. 3 gün boyunca Dialyze. Değiştirmek 0.1 x MEM çözüm en az iki kez bir gün kullanmadan önce her değişiklik pH kontrol. PH temel döndü ise, pH 4,0 kadar 0,1 M asetik asit birkaç damla ile değiştirin.</li>
	<li>Dializ sonrası, Medil kollajen çözeltisine antibiyotik ekleyin (1,5 ml penisilin/streptomisin (pen-strep)). 4 °c ' de kollajen stok çözeltisi ve deposunda 5 ml plakaya olun. Not: Bu noktadan itibaren, tüm işleme prosedürleri laminar akış kaputunda Steril koşullar altında yapılmalıdır.</li>
	<li>
Sonraki adımları izleyerek hazırlanan kollajen stok çözeltisi jelleşme testine devam edin.
	<ol>
<li>Stok kollajen genellikle çok konsantre olduğundan, 3 çalışma seyreltme hazırlamak (75%, 50%, ve 25% kollajen çözüm) 0.1 x MEM stok seyreltme tarafından, pH 4,0. Her çalışma seyreltme için önerilen son hacim 5 mL 'dir. Her koşulda, bir protein kolorimetrik tahlil kullanarak protein konsantrasyonu kontrol edin.</li>
		<li>Birkaç boş 1,5 mL konik Santrifüjlü tüpler (her çalışma seyreltme için bir tane), 10X MEM tüpler, 7,5% sodyum bikarbonat çözeltisi ve buz üzerinde kollajen farklı çalışma seyreltmeleri yerleştirin. Bunlar soğutuluncaya kadar bekleyin.</li>
		<li>Soğuk (4 °C) santrifüj tüpüne 40-50 μL, 10X MEM ekleyin. Ardından, 7-8 μL sodyum bikarbonat çözeltisi ile hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Bu tüp için farklı kollajen dilüsyonlardan biri 310-330 μL ekleyin ve herhangi bir kabarcık oluşumu kaçınarak pipet ile hafifçe karıştırın. Kolajen-MEM-sodyum bikarbonat karışımı buz üzerinde tutun (4 °C) en az 5 dakika.</li>
		<li>Pipet 10-25 μL karışımı bir 35 mm Petri tabak içine.</li>
		<li>Hidrojelin (± 15-20 dk) jelleşme gözleninceye kadar 37 °C ' de bulunan CO2 inkükodiye Petri tabağı yerleştirin.</li>
		<li>Farklı Petri yemekleriyle kalan kollajen dilüsyonları için 1.12.3-1.12.6 adımlarını tekrarlayın.</li>
		<li>En iyi sonuçları oluşturur kollajen çalışma seyreltme seçin. Not: En iyi jelledli hidrojel, homojen bir saydam doku, gri renk olmalıdır ve bel veya katı olmamalıdır. Deneyimimizde, 3:1 bir seyreltme (kollajen: 0.1 x MEM) en iyi deneysel sonuçları üretir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hücre hazırlanması (COS1) genetik-3-b kollajen hydrogels bir aday molekül Salgılayın değiştirilmiş
<ol><li>Plate 2 x 106 COS1 hücreleri bir 35 mm Petri yemekleri ve tam kültür ortamı ile inkük 100 ml oluşan D-mem içeren 10% (Vol/Vol) ısı-inaktive fetal Sığır serum,% 0,5 (WT/Vol) glutamin ve 1% (WT/Vol) pen/strep bir hücre kültüründe % 70-80 ' lik bir gecede ulaşabilmek için kuluçbacıcı. Her transfeksiyon prosedürü için bir petri tabağı hazırlayın.</li>
	<li>
Ertesi gün DNA ile COS1 hücreleri transfect aday molekül kodlama (netrin-1 veya Sema3E) üreticinin talimatlarını takiben Liposome tabanlı transfeksiyon yöntemi kullanarak.
	<ol>
<li>Bunu yapmak için, 250 μL 'yi serum içermeyen orta ve DNA (koşul başına 1-2 μg) ile bir 1,5 mL Santrifüjü tüpüne (DNA tüpü) karıştırın. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca kulkaç yapın. ikinci bir tüp hazırlayın (Lipozomal tüp), serum içermeyen orta 240 μL ve Lipozomal transfeksiyon reakajının 10 μL 'yi ekleyerek. RT 'de 5 dakika boyunca inküye yapın.</li>
		<li>İnkübasyon sonrası, DNA-Tube içeriğini Lipozomal tüpe ekleyin ve hafifçe karıştırın. Şimdi RT 'de 15 dakika boyunca inküye yapın. orta, serum içermeyen orta 1,5 mL ile kültürlü hücrelerde değiştirin ve Petri çanağına DNA-liposomes karışımı yavaşça dropwise ekleyin. CO2 hücre kültürü kuluçk 3 h için inkübe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfeksiyon inkübasyon 3 h sonra, tam kültür ortamı ile orta değiştirin ve kuluçk bir gecede inkübe.</li>
	<li>Ertesi gün, 0,1 M Dulbecco fosfat tamponlu tuz (D-PBS) ile hücreleri durulayın, Trypsin-EDTA ile kültürlere tedavi (800 μL her çanak için 5-15 dk CO2 inkübekçi) ve tam kültür orta 15 ml ile müstakil hücreler toplamak.</li>
	<li>Hücreleri 4 °C ' de 130 x g 'de 5 dakika santrifüjler. Santrifüjden sonra, medyayı çıkarın ve buzda COS1 hücreleri içeren peletleri koruyun.</li>
	<li>1.12.3-1.12.6 kollajen çalışma karışımı hazırlamak için adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Ekleme 100-150 μL nakledilmiş hücrelerin Pelet kollajen karışımı ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme ile mix ve bir petri tabak (35 mm çapı) üzerinde bu karışımı 45-50 μL yaymak, yaklaşık 1-1,5 cm uzunluğundaki kollajen hücrelerden oluşan tek bir bant oluşturmak için. Çanak kuluçta 37 °C (% 5 CO2) olarak jelleşme (± 15-20 dak) gözlenene kadar yerleştirin.</li>
	<li>İkinci bir kültür çanak içinde kontrol hücreleri (sahte transfeksiyon) içeren ikinci bir şerit hazırlayın ve kuluçkan (± 15-20 dk) içinde plaka ve jelleşme tamamlandığında eklemek 3-4 mL ısıtılmış (37 °C) COS1 tam kültür orta jel içeren her çanak kollajen hücreleri şeritler ve CO2 hücre kültürü kuluçko onları tutmak. Bundan sonra, ince bir neşter veya bir doku helikopteri kullanarak küçük kare parçaları (400 için 500 μm) oluşturmak için kollajen hücreleri şeritler kesti.</li>
	<li>Aynı transfeksiyon koşulundan tüm bölümleri 3-3,5 mL nöronal kültür medyası (NCM) içeren bir petri çanağına aktarın ve bir Diseksiyon mikroskobu parçaların kalitesini kontrol edin. Yine, CO2 hücre kültürü kuluçko onları tutmak. Not: Nöronal kültür ortamı% 1-5 (Vol/Vol) ısı-inaktive at serumu, 2 mM glutamin,% 0,5 (WT/Vol) glikoz,% 1 (WT/Vol) pen-strep solüsyonu ve% 0,044 (WT/Vol) NaHCO3Içeren Nörobazal orta oluşur. PH 7.2-7.3 arasında olduğundan emin olun.</li>
</ol>3. kültür için embriyonik Explant üretimi
<ol><li>Rutin sterilizasyon yönergelerini takiben otoklavlama ile cerrahi aletleri (makas, neşter bıçağı kolu, düz ve kavisli forseps) sterilize edin. Paralel olarak hazırlamak 500 mL Hank 'in dengeli tuz çözeltisi-glikoz tampon ve 4-5 Petri yemekleri (100 mm çapı) içeren 10 mL HBSS-G. Bu plakaları buzun üzerine yerleştirin (4 °C).</li>
	<li>Onaylanmış etik prosedürlerin ardından hamile kadın sıçan (embriyonik gün 16,5) Steril alan dışında feda. Karın boşluğundan makas ile embriyo boynuzları kesmek ve soğuk HBSS-G içeren büyük bir petri çanak içine yerleştirin.</li>
	<li>Çanak laminar akış kaputu yerleştirin ve düz forseps ile embriyo ayıklamak. Soğuk HBSS-G içeren yeni bir çanak içine yerleştirin. Daha sonra, küçük forseps kullanarak embriyonun derisini çıkarın ve eğri ve düz forseps kullanarak beyin dikkatle ortadan kaldırır. Soğuk HBSS-G içeren bir çanak içine yerleştirin.</li>
	<li>Bir diseksiyon mikroskop altında, orta hat boyunca yarım beyin kes hem de neşter veya ince makas ile hemheres ayırmak ve diencephalon kaldırmak, ince forseps ile beyin parçaları menenjlerin ve kan damarlarını.</li>
	<li>Embriyoların geri kalanı ile 3.3-3.4 arasındaki adımları yineleyin. Doku kalitesini korumak için 2 h 'den fazla diseksiyonu geciktirmeyin.</li>
	<li>100% etanol ile doku helikopterin tüm parçalarını temizleyin (özellikle Politetrafloroetilen (PTFE) kesme plakası ve jilet). UV aydınlatma altında laminar Flux kaput içinde doku Chopper tutun 15 dakika.</li>
	<li>Her doku parçasını (örn. Hippocampus korteks) doku helikopterinin kesme plakasına aktarın. Hippocampus için, jilet için dik yerleştirin ve kalınlık 450-500 μm doku bölümleri elde.</li>
	<li>Tam NCM 3-4 mL ile birkaç 35 mm Petri yemekleri hazırlayın ve doku helikopteri plakadan Petri yemeklerinden doku parçalarını aktarın. İlgi bölgeleri dissected olarak birçok yemek gerekebilir.</li>
	<li>İnce tungsten iğneler kullanarak tam NCM doku diseksiyonu tamamlayın. Diseksiyon mikroskobu altında elde edilen dilimleri kalitesini kontrol edin. Katmanların Darkfield optiklarında açıkça tanımlandığından emin olun ve faiz bölgesini (örn. Hippocampus CA bölgesi) tungsten iğneleri ile incelemek. Hasarlı dilimleri atın. Co2 kuluçko içinde tam NCM orta hipokampal Method tutun.</li>
</ol>4. kollajen hydrogels 3-D Co-kültürler hazırlanması
<ol><li>Laminar akış kaputu birkaç steril 4-Well kültür plakaları yerleştirin ve daha önce adımlar 1.12.2-1.12.6 belirtildiği gibi bir kollajen çalışma karışımı hazırlayın.</li>
	<li>Dairesel kollajen tabanı üretmek için bir kuyu altına hidrojel karışımı 15-20 μL yerleştirin. Kuyuların geri kalanı için bu adımı tekrarlayın. Hidrojel tabanından aşırı sıvı buharlaşma önlemek için aynı anda beş plaka hazırlamak yok.</li>
	<li>Tam jelleşme (± 15-20 dk) gözlemleninceye kadar ve sadece jelleşme tamamlandığında plakalarını kuluçta tutun. Jelledli kollajen kalitesini kontrol edin.</li>
	<li>Bir pipet ile COS1 hücre toplama küçük bir parça aktarın. Hidrojel tabanı üzerine yerleştirin ve bir explant boyutunda toplu hücre parçası yakın bir pipet ile aynı baz üzerinde bir doku parçası yerleştirin.</li>
	<li>1.12.2-1.12.6 adımlarında olduğu gibi buz üzerinde yeni bir çalışma kollajen karışımı hazırlayın.</li>
	<li>Bu yeni karışım 15-20 μl hafifçe pipet ve eksplant ve hücre toplamasını kapsar. Sandviç gibi hidrojel kültürü gözlenir. Şu anda, ince bir tungsten iğne ile eksplant yeniden oryantate (COS1 hücre toplu dokunmayın!), bu yüzden ± 500-600 μm olarak hücre toplama yüzleri.</li>
	<li>Jelleşme gözlemleninceye kadar plakayı kuluçta geri dönün (± 10-15 dk), ve 0,5 mL tam NCM 2% B27 takviyesi ile tamamlayıcı ve kültürlere 36 için 48 h kuluçta tutun (37 °C, 5% CO2).</li>
</ol>5. Explant-hücre toplama Co-kültürler ve Immünositokimyasal prosedür fikreme
<ol><li>36-48 sonra inkübasyon, orta çıkarın ve 0,1 M fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7,3 ile durulayın. Bundan sonra, 0,1 M fosfat tampon (Pb), pH 7,3, 4 °c ' de% 4 civarında formaldehite ile 1 h için kültürler düzeltin.</li>
	<li>Fiksatif çıkarın ve yavaşça kültürler 3-4 kez durulayın (10-15 dk her) içinde 0,1 M PB, pH 7,3.</li>
	<li>Hidrojel sandviç de spatula veya forseps ile kuyu dibinde ayırın. % 0,5 olmayan iyonik deterjan ile 0,1 M PBS içeren 6-well kültür plakasına ince bir boya fırçası ile kollajen bloğu aktarın.</li>
	<li>Engelleme çözeltisi (% 10 serum, 0,5% ısı olmayan yüzey ve 0,2% jelatin içinde 0,1 M PBS) ve yumuşak ajitasyon ile RT 'de 2-3 h için serbest yüzen hidrogonları kuluçk.</li>
	<li>0,1 M PBS ile% 0,5 iyonik olmayan yüzey bilgi içeren 3 kez (10-15 dk) durulayın.</li>
	<li>% 5 serum içeren PBS 'de seyreltilmiş primer antikor ile inkük,% 0,5 iyonik olmayan yüzey kaynağı, 0,2% jelatin ve% 0,02 sodyum azid. 36-48 için primer antikor ile 4 °C ' de bir çalkalayıcı üzerinde inkük. Not: Genellikle Sınıf III β-tubulin (α-TUJ-1) (seyreltilmiş 1:2000) karşı bir antikor, 3-b hidrojel kültürlerde aksonal büyüme tanımlamak için kullanılır.</li>
	<li>İnkübasyon sonrasında, 5,5 adımda durulayın.</li>
	<li>RT 'de 4 h (ya da 4 °C ' de 6-7 h) için ikincil antikor ile inküye,% 5 serum, 0,5% Non-İyonik yüzey ve% 0,2 jelatin içinde seyreltilebilir. Bu deneyde bir at Anti-fare biyotinlenmiş antikor (seyreltilmiş 1:200) kullanılır.</li>
	<li>5,5 gibi kültürler durulayın.</li>
	<li>Kültürleri 2 gün boyunca 4 °C ' de avidin-biotin kompleksi (ABC) çözeltisi 1:100% 5 serum, 0,5% Non-İyonik yüzey ve% 0,2 jelatin içeren PBS 'de seyreltilmiş. Alternatif olarak, aynı tamponda horserpu peroksidaz (HRP)-etiketlenmiş streptavidin (seyreltilmiş 1:300-400) kullanın.</li>
	<li>5,5 'de açıklandığı gibi kültürlere durulayın.</li>
	<li>0,1 M Tris-HCl tampon ile birkaç kez kültürlere durulayın, pH 7,6 için 1 h.</li>
	<li>0,1 M Tris-HCl, pH 7,6 ' de 3, 3 '-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB) çözeltisi% 0,03 ile kültürlere inküye yapın.</li>
	<li>Ekle 5-8 μL 1% H2O2 ve Wait 10-15 dk. 4-10X objektif kullanarak bir mikroskop altında DAB gelişimini izlemek.</li>
	<li>0,1 M Tris-HCl tampon, pH 7,6 ile DAB çözümünü kaldırarak reaksiyonu durdurun.</li>
	<li>PBS 'deki kültürlere 30 dakika boyunca durulayın (birkaç değişiklik).</li>
	<li>Sulu bazlı montaj medyasını kullanarak hidrojeleri cam slaytlara takın.</li>
	<li>Sholl Analizi eklentisi veya ımagej yazılımı30Için NeuriteJ plug-in ile hidrojel içindeki akonların uzunluğunu ve dağıtımını analiz edin.</li>
</ol>

<ol><li>Ramón y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRam%C3%B3n+y+Cajal%2C+S+%22Les+nouvelles+id%C3%A9es+sur+la+structure+du+syst%C3%A8me+nerveux+chez+l%27homme+et+chez+les+vert%C3%A9br%C3%A9s%22">Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés</a>. , (1894).</li>
<li>Ramón y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRam%C3%B3n+y+Cajal%2C+S+%22Nuevo+concepto+de+la+histolog%C3%ADa+de+los+centros+nerviosos%22">Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos</a>. , (1893).</li>
<li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+neuronal+cell+migrations%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834(2010).</li>
<li>Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of axon guidance.</a> Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+molecules+of+neuronal+wiring%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727(2011).</li>
<li>Rosentreter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+retinal+ganglion+cell+axons+to+striped+linear+gradients+of+repellent+guidance+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules.</a> Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).</li>
<li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li>
<li>von Philipsborn, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+navigation+in+substrate-bound+ephrin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients.</a> Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).</li>
<li>Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+mechanisms%3A+semaphorins+as+simultaneous+repellents+and+anti-repellents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents.</a> Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).</li>
<li>Jessell, T. M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development.+The+decade+of+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Development. The decade of the developing brain.</a> Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).</li>
<li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+netrins+define+a+family+of+axon+outgrowth-promoting+proteins+homologous+to+C.+elegans+UNC-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6.</a> Cell. 78 (3), 409-424 (1994).</li>
<li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens%3A+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).</li>
<li>Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+transmission+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force transmission in migrating cells.</a> Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).</li>
<li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).</li>
<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
<li>Castellani, V. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCastellani%2C+VB+%22Protocols+for+Neuronal+Cell+Culture%22">Protocols for Neuronal Cell Culture</a>. , Humana Press Inc. (2001).</li>
<li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+rattail+collagen+used+as+substrate+for+tissue+cultures+on+coverslips+in+Maximow+slides+and+roller+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes.</a> Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).</li>
<li>Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+examining+organotypic+CNS+cultures+with+Nomarski+optics%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics.</a> In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Earliest+sensory+nerve+fibres+are+guided+to+peripheral+targets+by+attractants+other+than+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor.</a> Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).</li>
<li>Chedotal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorins+III+and+IV+repel+hippocampal+axons+via+two+distinct+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors.</a> Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).</li>
<li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li>
<li>Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrin+signaling+in+morphogenesis%2C+neural+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).</li>
<li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+purification+of+a+mammalian+slit+protein+as+a+positive+regulator+of+sensory+axon+elongation+and+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching.</a> Cell. 96 (6), 771-784 (1999).</li>
<li>Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+basement-membrane+matrix+modulates+fibroblast+activities+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro.</a> Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).</li>
<li>Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibrin+or+collagen+gel+assay+for+tissue+cell+chemotaxis%3A+assessment+of+fibroblast+chemotaxis+to+GRGDSP%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP.</a> Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).</li>
<li>Kapur, T. A., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+concentration+gradients+of+nerve+growth+factor+guide+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).</li>
<li>Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite-J%3A+an+image-J+plug-in+for+axonal+growth+analysis+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).</li>
<li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biology+of+decellularized+lung+matrix%3A+Implications+of+species+mismatch+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 102, 220-230 (2016).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Analysis+of+the+Digestion+of+Bovine+Type+I+Collagen+Telopeptides+with+Porcine+Pepsin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin.</a> Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).</li>
<li>Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3-hydroxyproline+%283Hyp%29-rich+motif+marks+the+triple-helical+C+terminus+of+tendon+type+I+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).</li>
<li>Garnotel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+monocytes+interact+with+type+I+collagen+through+alpha+x+beta+2+integrin+%28CD11c-CD18%2C+gp150-95%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95).</a> Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).</li>
<li>Montolio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semaphorin+3A+inhibitor+blocks+axonal+chemorepulsion+and+enhances+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration.</a> Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).</li>
<li>Garcia-Gareta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+gels+and+the+%27Bornstein+legacy%27%3A+from+a+substrate+for+tissue+culture+to+cell+culture+systems+and+biomaterials+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration.</a> Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Gelişen akonların büyümesi ağırlıklı olarak invaziv olup ECM bozulması ve yeniden modelleme içerir. Burada sunulan prosedürü kullanarak, araştırmacılar, doğal tip ı kollajen tarafından oluşturulan homojen bir 3-b matris elde edebilirsiniz hangi akons (veya hücreler) genetik olarak değiştirilmiş hücreler tarafından salgılanan bir kimyasal degrade yanıt verebilir onlar in vivo gibi. Çekici veya inhibitör ipuçları (protein, lipidler, vb) degradeler için farklı aksal tepkiler kolayca belirli kontrol (sahte nakli hücreler) il...

Akal büyüme konileri ile biten nöronal akons, uygun hedeflere ulaşmak için belirli yollar üzerinde embriyonun ekstrellüler matris (ECM) aracılığıyla uzun mesafeler göç. Büyüme koni Axon distal parçasıdır ve hücrenin fiziksel ve moleküler çevre duygusu uzmanlaşmıştır1,2. Moleküler açıdan göre, büyüme konileri en az dört farklı Moleküler mekanizma tarafından yönlendirilir: temas cazibe, chemoattraction, kontak itme, ve chemorepulsion farklı aksonal rehberlik ipuçları tarafından tetiklenen3,4 , 5 , 6. kontakt-aracılı süreçler, mikro desenli substratlar üzerinde iki boyutlu (2D) kültürlerde kısmen izlenebilir (örn. çizgiler7,8 veya molekülleri içeren9 nokta ile). Ancak, akons çevre4,5,10içinde mavi mesaj hücrelerinden birkaç çekici ve itici molekülleri algılayarak kendi hedeflerine diffusive olmayan bir şekilde gidebilirsiniz. Burada, bir salgılanmış molekülün gelişen akons üzerinde chemorepulsive veya chemocazip etkileri indükler olup olmadığını kontrol etmek için 3-D kültürün kolay bir yöntem açıklanmaktadır.
Axon rehberlik ipuçlarının etkilerinin belirlenmesine yönelik en erken çalışmalar, üç boyutlu (3-b) matrislerde eksplant kültürlerini kullanarak gradyanlar içinde vivo koşullar11,12simüle oluşturur. Bu yaklaşım, in vivo deneyler ile birlikte, rehberlik ipuçlarını dört büyük ailelerin tanımlanması için izin: netrins, yırtkıları, semaforinler, ve ephrins4,5,6. Bu moleküler ipuçları ve diğer faktörler13 büyüyen akons tarafından entegre edilir, yapışma kompleksler dinamikleri tetikleyen ve sitentresi aracılığıyla mekanik Kuvvetleri dönüştürücüler14,15,16. Aksonal navigasyon için 3-b kültürlerde moleküler degradeler oluşturmak için, öncü araştırmacılar da organotypic dilim preparatları için kullanılan plazma pıhtı substratlar17, kullanılan18. Ancak, 1958 yılında, 3-b kollajen Hidrojeller oluşturmak için yeni bir protokol maximow 's cihazları19, bir kültür platformu, mikroskobik gözlem20için uygun çeşitli çalışmalarda kullanılan bir eğitim için bildirilmiştir. Başka bir öncü çalışma, fibroblastların yara iyileşmesi süreçlerinde myofibroblastlar halinde farklılaşması için insan fibroblastları gömmek için bir araç olarak kollajen jel bildirdi21. Paralel olarak, Lumsden ve Davies duygusal sinir liflerinin rehberlik üzerinde sinir büyüme faktörü (NGF) Putatif etkisini analiz etmek için sığır dermis kollajen uygulanan22. Farklı şirketler ve laboratuvarlar tarafından yeni kültür platformlarının (örn. çok kuyu plakaları) geliştirilmesi ile kollajen kültürler bu yeni cihazlara adapte edildi6,23,24,25 ,26. Paralel olarak, Engelbreth-Holm-Swarm tümör hücre hattından elde edilen ECM malzemesi ekstresi, bu çalışmaları27' ye genişletmek için ticari olarak kullanılabilir hale gelmiştir.
Son zamanlarda, 3-b hidrojelleri (örn. kollajen, fibrin vb.) kullanarak Axon rehberliğinde moleküler degradeler oluşturmak için çeşitli protokoller geliştirilmiştir. 28. alternatif olarak, aday molekül bir gözenekli matris (örneğin, NGF29) farklı konsantrasyonda immobilize olabilir veya bir radyal oluşturmak için molekül salgının 3-b hidrojel hücre alların küçük bir bölgede kültür tarafından oluşturulan Gradyan4,23,24,25,26. Son olasılık bu protokolde açıklanacak.
Burada sunulan prosedür, embriyonik fare beynin 3-b hidrojel kültürlerinde akal büyüme analizine dayalı, kolay, hızlı ve son derece tekrarlanabilir bir yöntemdir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, protokol eğitimli olmayan araştırmacılar için de uygundur ve kısa bir eğitimden (1-2 hafta) sonra tamamen geliştirilebilir. Bu protokolde, biz ilk olarak daha fazla üretmek için yetişkin sıçan kuyrukları kollajen yalıtmak 3-b hangi genetiği değiştirilmiş hücre agregaları embriyonik nöronal doku önünde kültürlü olan matris. Bu hücre toplamları, büyüyen akons için bir yanıt gösteren bir aday molekül radyal kimyasal degradeler formu. Son olarak, moleküllerin büyüyen akons üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi, bir faz kontrast mikroskobu veya alternatif olarak immünosittokimyasal yöntemler kullanılarak kolayca yapılabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>3,3 & prime; -Diaminobenzidin tetrahidroklorür 10 mg tablet (DAB)</td> <td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Yetişkin Sprague-Dawley sıçanları (8 ila 9 haftalık)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lyon, Fransa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avidin-biotin-peroksidaz kompleksi (ABC)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>B27 serumsuz takviye 50x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Bikinkoninik asit (BCA) protein tahlil kiti</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>cDNA plazmit vektörleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COS1 hücre hatları</td><td>ATTC</td><td>CRL-1570</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glikoz (suda% 45 çözelti) tam Nörobazal ortam</td><td>Sigma</td><td>G8769</td> <td>için</td></tr><tr>COS1 kültür ortamı <td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td> <td>Dulbecco' için D-MEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı 1x</td></tr><tr><td>) s fosfat tamponlu salin 10x (Ca2 + ve Mg2 + +) (D-PBS olmadan)</td><td>kültürler için Invitrogen</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Etanol ve nbsp;</td><td>merck</td><td>108543</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit dihidrat disodyum tuzu (EDTA)</td> <td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Floresan montaj ortamı (örneğin, Fluoromount-G veya benzeri)</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri (EMS)</td> <td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin tozu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit (Panreac, kat. no. 211008)</td><td>Panreac</td><td>211008</td><td></td></tr><tr><td>Hank' S Dengeli Tuz Çözeltisi&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>24020083</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10108-165</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile inaktive edilmiş at serumu&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit (H2O2, suda% 32 ila 33)</td> <td>Sigma</td><td>316989</td><td></td></tr><tr><td>Tam Neurobazal ve COS1 ortamı için L-glutamin 200 mM çözeltisi (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Fareler hamile dişi (embriyonik gün 12.5 ila 16.5; E12.5-16.5)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lyon, Fransa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modifiye Minimum Esansiyel Orta Kartal (MEM)</td> Sınıf III &beta'ya karşı <td>invitrojen</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal antikor;-tubulin (klon TUJ-1)</td><td>Biolegend</td><td>801201</td><td></td></tr><tr><td>N-2 takviyesi 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Merck</td><td>1.040.051.000</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin çözeltisi 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-22</td><td></td></tr><tr><td>İmmünositokimya için fosfat tamponlu salin 10x (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>İkincil antikor: biyotinile at anti-fare&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>Serumsuz ortam (Opti-MEM)</td><td>İnvitrojen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid&nbsp;</td><td>Panreac</td><td>162712</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat çözeltisi% 7.5 & nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Steril kültür sınıfı H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>TritonTM X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma tabanı&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (EDTA (1x) ile tripsin (ağırlıkça% 0.05 (hacim)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>diseksiyon için 1 büyük ve 1 küçük kavisli makas&nbsp;</td><td>İnce aletler Aletler veya benzeri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL konik santrifüj tüpleri&nbsp;</td><td>Eppendorf veya benzeri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik santrifüj tüpleri&nbsp;</td><td>Corning veya benzeri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 hemostat&nbsp; &nbsp;</td><td>İnce aletler Aletler veya benzerleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 küçük düz diseksiyon makası</td><td>İnce aletler Aletler veya benzeri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüjleme için 200 mL santrifüj tüpleri</td><td>Nalgene veya benzeri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mL steril cam konik şişeler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 L cam beher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 ve 6 kuyulu kültür plakaları&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>176740 ve 140675</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik pipet pompaları ve tek kullanımlık 10 mL ve 25 mL filtre içerikli steril plastik pipetler.</td><td>Gilson, Brand, Eppendorf veya benzeri&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otomatik pipetler, steril filtre uçları ve mevcut steril uçlar&nbsp;</td><td>Gilson, Eppendorf veya benzeri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Açılı sabit rotorlu tezgah üstü mikrosantrifüj&nbsp;</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter veya benzeri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Döner kova rotorlu tezgah üstü soğutmalı santrifüj (1.5, 15 ve 50 mL tüp adaptörleri ile)</td> <td>Eppendorf, Beckman Coulter veya benzeri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 ° C'de hücre kültürü inkübatörü; C, %5 CO2 ve %95 hava</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü selüloz membran</td><td>Sigma</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü kapakları&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Z37101-7</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık cam pipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karanlık alan optikli diseksiyon mikroskobu&nbsp;</td><td>Olympus SZ51 veya benzeri&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek hızlı soğutmalı Beckman Coulter santrifüj veya açılı sabit rotorlu</td><td></td><td></td><td></td>benzer</tr><tr><td>Laminer akış başlığı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Büyük 100 mm, 60 mm ve küçük 35 mm & Oslash; hücre kültürü kapları&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>&nbsp; 150679, 150288 ve 150318, sırasıyla</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik karıştırıcı ve manyetik döndürme çubukları</td><td>IKA veya benzeri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>McIlwain doku doğrayıcı</td><td>Mickle Laboratuvar Mühendisliği</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bir çift ince düz forseps ve bir çift kavisli forseps&nbsp;</td><td>İnce aletler Aletler veya benzerleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku doğrayıcı</td><td></td><td></td><td></td>için tıraş</tr><tr><td>bıçakları Neşterler (15 ve 11 numaralı)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajen ve doku parçalarını aktarmak için iki çift ince spatula</td><td>İnce aletler Aletler veya benzerleri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

Bu protokol, aksal büyümeyi izlemek ve analiz etmek için üç boyutlu (3-D) hidrojel oluşturmak için doğal tip ı kollajen kullanır. Protokol, küçük parça embriyonik veya erken postnatal kemirgen beyinleri içinde bir 3-D hidrojel tarafından oluşturulan sıçan kuyruk tendon-türetilmiş tip ı kollajen özel gözenekliliği ile kurulan üzerinde ortalanır. Doku parçaları hidrojel içinde kültürlü ve spesifik beyin parçaları veya genetiği değiştirilmiş hücre agregaları üretmek ve gözenekli matris içinde bir degrade oluşturmak için uygun molekülleri salgılama karşı karşıya. Bu protokolün adımları basit ve yeniden oluşturulabilir ancak geliştirme sırasında dikkatle değerlendirilecek kritik adımları içerir. Dahası, büyüyen akuçların davranışı, immünositoz metotları ile tespit edildikten sonra faz kontrast mikroskop veya mono/multifoton floresan mikroskobu kullanılarak doğrudan izlenebilir ve analiz edilebilir.

Burada, embriyonik fare sinir sisteminin 3-b hidrojel kollajen kültürlerinde akal büyüme çalışması için yaygın olarak erişilebilen bir metodoloji sunuyoruz. Bu amaçla, biz yetişkin sıçan kuyrukları gelen kollajen, biz genetiği değiştirilmiş hücre agregasyon netrin-1 veya embriyonik nöronal doku (örneğin, Hippocampus CA bölgesi) ile karşı karşıya Sema3E ifade eden 3-b matrisler oluşturmak için izole. Bu hücre agregaları, kollajen matrisinin içinde aday molekülün radyal olarak dağıtılmış bir gradyan oluşturdu. Son olarak, ...

Burada, 3D matrislerde büyüyen akons davranışlarını analiz etmek, doğal gelişimini taklit etmek için bir yöntem sağlıyoruz.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Bu yöntem nöro sistem gelişimi sırasında aksonal rehberlik ve nöronal göç bazı moleküllerin rolünü analiz etmek için yararlıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı, sonuçların analizinin hızlı ve basit olması ve araştırmacılar için çok fazla eğitim anlamına gelecek karmaşık yazılımlar gerektirmemesidir. Prosedürü gösteren mirian Segura-Feliu, bizim laboratuvar ve ben bir teknisyen olacaktır.Plaka 200 başlamak için, 000 COS-1 hücreleri 35 milimetre Petri yemekleri içine ve bir hücre kültürü kuluçka tam kültür ortamı ile kuluçka amacıyla 70-80% birleştiği gece okumak için. Ertesi gün, lipozom bazlı transfeksiyon yöntemi ile aday molekülkodlama DNA ile transfect COS-1 hücreleri için. İlk karışımı 250 serum serbest orta ve 1-2 mikrogram DNA 1.5 mililitre centrifuge tüp ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka.Bir liposomal tüp hazırlamak için, serum serbest orta 240 mikrolitre ve lipozomal transfeksiyon reaktif 10 mikrolitre ekleyin ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Kuluçkadan sonra, DNA tüpünün içeriğini lipsomal tüpe ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçka.Kültürlü hücrelerdeki ortamı serumsuz ortam 1,5 mililitre ile değiştirin. YAVAŞ yavaş DNA lipozomkarışımı ekleyin ve hücrelere akıllıca bırakın. Karbondioksit hücre kültüründe üç saat kuluçka ya.Kuluçka tamamlandıktan sonra, tam kültür ortamı ile orta değiştirin ve kuluçka gecede kuluçka. Ertesi gün, 0.1 molar Dulbecco's PBS ile hücreleri durular. Her çanak başına 800 mikrolitre tripsin EDTA ekleyin ve karbondioksit inkübatör beş ila 15 dakika kuluçka.15 mililitrelik bir santrifüj tüpü içine tam kültür orta iki mililitre ile müstakil hücreleri toplamak ve aynı ortamda 10 mililitre ekleyin. Hücreleri dört derecede 130 kez g'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve buz üzerinde COS-1 hücreleri içeren pelet korumak.Kollajen çalışma karışımı hazırladıktan sonra, transfected hücrelerin pelet kollajen karışımı 100 ila 150 mikrolitre ekleyin ve yukarı ve aşağı borulama yavaşça karıştırın. 35 milimetrelik Petri kabına 45 ila 50 mikrolitre kollajen hücreli pelet karışımı nı yayın ve yaklaşık 1 ila 1,5 santimetre uzunluğunda tek tip bir kollajen hücresi bandı oluşturun. Jelleşme gözlemlenene kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit de kuvözde çanak yerleştirin.İkinci bir kültür çanak kontrol hücreleri içeren ikinci bir şerit hazırlayın ve kuvöz yerleştirin. Jelasyon tamamlandığında, 37 santigrat derece üç ila dört mililitre ekleyin jelleştirilmiş kollajen hücre şeritleri içeren her çanak COS-1 komple kültür ortamı ısıtılır ve kuvöz yerleştirin. Küçük kare parçalar, uzunluğu 400 ila 500 mikrometre oluşturmak için kollajen hücre şeritleri kesmek için ince bir neşter veya doku helikopteri kullanın.Aynı transfeksiyon durumundan tüm bölümleri üç ila 3,5 mililitre nöronal kültür ortamı içeren bir Petri kabına aktarın. Bir diseksiyon mikroskobu altında parçaların kalitesini kontrol edin ve kuvözde bulaşıkları yerleştirin. Embriyonik gün 16.5 bir kurban hamile kadın sıçan karın boşluğundan embriyo boynuzları kesmek için makas kullanın ve soğuk HBSSg tampon içeren büyük bir Petri kabına yerleştirin.Lamina akış kaputuna çanak yerleştirin ve embriyoları ayıklamak ve soğuk HBBSg içeren yeni bir çanak içine yerleştirmek için düz forceps kullanın. Küçük forceps ile, deri kaldırmak ve sonra kavisli ve düz forceps ile, dikkatle beyin incelemek ve soğuk HBSSg içeren bir çanak içine yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskop altında, bir neşter veya ince makas kullanarak, her iki yarımküreyi ayırmak için orta hat boyunca beyin ikiye kesti.Sonra, diensefalon kaldırmak ve ince forceps ile, beyin parçalarından menenjler ve kan damarları kaldırın. Doku helikopterinin tüm parçalarını, özellikle PTFE kesme plakasını ve jileti temizlemek için %100 etanol kullanın ve doku helikopterini UV aydınlatması altında laminar akı kaputunda 15 dakika tutun. Her doku parçasını doku helikopterinin kesme plakasına aktarın.Doku doğrandıktan sonra, parçaları 35 milimetrelik Petri tabaklarından 3-4 mililitre tam NCM ile aktarın. Ince tungsten iğneler kullanarak, tam NCM doku diseksiyonu bitirmek. Diseksiyon mikroskobu altında elde edilen dilimlerin kalitesini kontrol edin, katmanların karanlık alan optiklerinde açıkça tanımlanabilir olduğundan emin olun ve tungsten iğneleri ile ilgi alanını inceleyin.Karbondioksit inkübatör tam NCM ortamda kaliteli parçalar tutun. Görsel gösteri, sürecin anlaşılmasını kolaylaştıran ortak kültürlerin hazırlanmasıyla ilgili adımlarda önemlidir. Laminar akış kaputunda birkaç steril dört iyi kültür plakaları yerleştirin ve daha önce olduğu gibi bir kollajen çalışma karışımı hazırlamak.Dairesel bir kollajen baz üretmek için her kuyunun altına hidrojel karışımı 15 ila 20 mikrolitre ekleyin. Tam jelleşme gözlenene kadar bulaşıkları kuvöze yerleştirin. Ve jellenmiş kollajen kalitesini kontrol edin.Bir pipet le, küçük bir COS-1 hücre agregasını hidrojel tabanına aktarın, ardından aynı taban üzerine bir doku parçası yerleştirmek için bir pipet kullanın, bir ekstrüzyon büyüklüğünde bir uzaklıkta oluşan hücre parçasına yakın. Buz üzerinde yeni bir çalışma kollajen karışımı hazırladıktan sonra, hafifçe pipet 15-20 bu yeni karışımın mikrolitre ekstreğe ve hücre agrega kapsayacak şekilde, hidrojel kültürü gibi bir sandviç yapma. 500 ila 600 mikrometre hücre toplam yüzleri böylece explant reorientate için ince bir tungsten iğne kullanın.Jelasyon gözlenene kadar kuvöz etabına plakayı geri döndürün ve sonra %2 B27 takviyesi ile tamamlanan 0,5 mililitre tam NCM ekleyin ve kültürleri kuvözde 36 ila 48 saat tutun. Hipokampal aksonlar Netrin-1 ile karşılaştıklarında tercihen Netrin-1'in kaynağına doğru büyüdüler ve Netrin-1'in bu aksonlar için kemo çekici bir molekül olarak hareket ettiğini belirttiler. Kontrol durumunda, ya da sahte transfeksiyon, tüm aksonlar radyal büyüdü, herhangi bir yön tercihi olmadan.Hipokampal aksonlar Sema3E salgılayan hücrelerle karşılaştıklarında, çoğu hücre agregasının zıttı olarak büyüdü, bu da Sema3E'nin bu aksonlar için kemo itici bir molekül olarak hareket ettiğini gösteriyordu. Aksonal yanıt ve niceleme yönteminin bu şematik gösterimi, kontrol koşullarında aksonların radyal büyüme ile gösterilen proksimal ve distal kadranlarda eşit olarak dağıtıldığını göstermektedir. Bu bir proksimal distal veya PH oranı gösterdi.Ekstremitelerde distal ile karşılaştırıldığında proksimal kadranda akson sayısı arttığında, kemo çekimi gösteren PD oranı birden fazlaydı. Distal kadranda akson sayısı proksimal olana göre daha yüksek olduğunda, kemo itme oranı birden daha azdı. Bu yöntemi takiben, araştırmacılar nöronal gelişim sırasında bazı moleküllerin rolü hakkında gerekli bilgileri elde edebilirsiniz, hangi bize daha fazla fonksiyonları keşfetmek için bir başlangıç noktası kurmak için izin verir.Bu teknik nöronal gelişimde yararlı olmakla birlikte, farmakolojik tarama, anjiyogenez ve doku mühendisliğinde de strateji olarak uygulanabilir.

generation-3-d-collagen-based-hydrogels-to-analyze-axonal-growth

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bir yöntem olup kollajen tip I ve primer insan fibroblast oluşan bir 3-boyutlu matrisi hazırlanması için tarif edilmektedir. Bu doku stroma temel özelliklerini taklit eder ve mikroskopi birçok formları için müsait olduğundan bu organotipik jel invaziv hücre göçü değerlendirmek için yararlı bir substrat olarak hizmet vermektedir.

Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Biz civciv E4 statoacoustic ganglion ve E6 omurilik eksplantlar incelemek ve kültürüne nasıl gösterilmektedir. Eksplantlarındaki 24 saat için 3D kollajen jel serum serbest koşullar altında kültüre. Neurite yanıt büyüme faktörü desteği orta ve protein kaplı boncuklar ile test edilir.

Diseksiyon ve Chick Statoacoustic Ganglion ve Kollajen Jeller Omurilik eksplantlar Kültür Neurite akıbet Tahliller

Ortabeyin dopamin sistemi ve striatum gelen Eksplantlarından için bir kollajen matris deneyde...

Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür

Bu video, hidrojel mikro sütunlar içinde üç boyutlu astrosit iskeleleri oluşturmak için bir yöntem gösterir. Mikro kolonların içi kollajen ile kaplanmıştır. Kollajene yapışan ve daha fazla inkübasyon ile üç boyutlu bir iskeleye kendi kendine monte edilen astrositler tanıtılır.

Hidrojel Mikro Sütunlar İçinde Astrosit İskeleleri Oluşturmak için In Vitro Bir Yöntem

Bu çalışmada, kollajen, düz kas hücreleri ve endotel hücrelerinin doğrudan kültürlenmesi yoluyla canlı vasküler dokuların hızlı bir şekilde üretilmesi için bir teknik sunuyoruz. Ek olarak, tasarlanmış vasküler dokuların mekanik karakterizasyonu için yeni bir protokol tanımlanmıştır.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Beynin karmaşık eylemlerine ilişkin içgörü, gelişmiş araştırma araçları gerektirir. Burada, beyin benzeri mimariye benzeyen yeni bir ipek kollajen bazlı 3D mühendislik nöral doku modelini gösteriyoruz. Model, nöronal ağ montajı, aksonal rehberlik, hücre-hücre etkileşimleri ve elektriksel aktiviteyi incelemek için kullanılabilir.

Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli

Kolajen ECM temel bir bileşenidir ve göç farklılaşma ve çoğalması kadar çeşitli hücresel süreçler için gerekli ipuçları sağlar. 3D kolajen hidrojellerin içinde hücreleri gömmek için bir protokol ve PDMS mikrokanallar kullanılarak randomize veya hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için daha gelişmiş bir teknik burada sağlanmıştır.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Biz kendi kendine montajı, üç boyutlu demetleri boyuna hizalanmış astrositik somata ve süreçlerin bir roman biomaterial encasement içindeki gelişimi vitrin. Bunlar "yaşam iskele santimetre uzunluğunda, genişletme hizmet edebilir henüz test-yatak nörogelişimsel mekanizmaları incelemek veya yönetmenlik nöronal göç ve/veya aksonal neuroregeneration kolaylaştırmak için mikron çaplı çapı sergileyen", mühendislik kılavuz.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Burada, biz fare 3D kültür için bir protokol beyin kaynaklı glia hücreleri, astrocytes, microglia ve oligodendrocytes de dahil olmak üzere mevcut. Biz birincil hücre kültürü, methacrylated hyaluronik asit (HAMA) hidrojel sentezi, HAMAphoto polimerizasyon ve hücre saklamasını ve confocal ve tarama elektron mikroskobik görüntüleme için işleme örnek göstermektedir.

Geliştirilmiş 3D hidrojel Neuroinflammation Vitro modelleme için birincil gliyal hücreler kültürleri

Bu yazıda, periferik doku mühendisliğinde kullanılmak üzere grafen içeren biyohibrid hidrojel biyomürekkebin hazırlanması gösterilmektedir. Bu 3D biyohibrid materyal kullanılarak, kök hücrelerin nöral farklılaşma protokolü gerçekleştirilir. Bu, benzer biyomateryallerin kliniğe getirilmesinde önemli bir adım olabilir.

Periferik Nöromühendislik için Grafen Bazlı 3D Biyohibrid Hidrojel Biyomürekkebin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Bu protokol, lifleri bir 3D kollajen hidrojel (kalınlığı &lt;250 μm) hizalamak için uzatma gerinim (germe) oluşturmak için sıvı akış yönü boyunca değişen geometriye sahip bir mikroakışkan kanalın kullanımını göstermektedir. Ortaya çıkan hizalama birkaç milimetre boyunca uzanır ve uzatma gerinim hızından etkilenir.

Uzun Menzilli Fiber Hizalamalı Mikromühendislik 3D Kollajen Hidrojelleri

Öğrenin, COS-1 hücreleri ve kollajen hidrojel kullanarak sinir sistemi gelişiminde aksonal büyüme ve yönlendirmeyi analiz etme yöntemini. Bu teknik, nörogelişim araştırmalarında hızlı ve basit sonuç analizi sağlar.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

Daha fazla video keşfet