Name: Kültürde memeliler hücrelerinde Disulfide bağlantıları ile stabilize Multimeric kompleksleri algılamak için non-azaltma SDS-sayfa analizi ve kimyasal Crosslinking birleştiren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Öğrenin, disülfid bağlarıyla stabilize edilmiş multimerik protein komplekslerini U-2 OS hücrelerinde hızlı ve düşük maliyetli bir şekilde analiz etmek için indirgenmeyen SDS-PAGE ve kimyasal çapraz bağlama yöntemlerini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu taslağı düzenlemeye yardımcı olmak için tüm çabalarını dutpase poliklonal antikor ve Kerri ciccaglione arıtma için Dr Jennifer Fischer tarafından ileriye koymak çabaları minnettarız. Bu araştırma kısmen New Jersey Sağlık Vakfı (Grant #PC 11-18) bir hibe tarafından desteklenmektedir.

1. ıodoacetamid kullanarak serbest sistein kalıntılarının engellenmesini
<ol><li>U-2 OS hücrelerini 6 cm2 ' ye% 50 –% 60 ' lık yüksek glikoz içeren asgari esansiyel ortamda% 10 fetal sığır serumu ve 37 °c ' de% 1 Sodyum piruvat% 5 Co2' de büyütün.</li>
	<li>Kullanmadan önce 10 mM iodoacetamid taze bir stok yapmak, daha sonra kullanılmayan reaktif atın.</li>
	<li>0,1 mM son konsantrasyon iodoacetamid doğrudan hücre kültürü medya ekleyin. Hafifçe 2 dakika için oda sıcaklığında çanak kaya.</li>
</ol>2. hücreleri hasat
<ol><li>Medyayı hücrelerden aspirate.</li>
	<li>Hücreleri üç kez 5 mL soğuk fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın. Son PBS yıkama solüsyonu aspirate sonra 1 mL soğuk PBS ekleyin.</li>
	<li>Bir hücre sıyırıcı kullanarak çanak altındaki hücreleri scrape. 1 mL 'Lik bir pipet kullanarak PBS ve hücre süspansiyonunu çizin ve tüm sıvıyı 1,5 mL mikrosantrifüjü tüpüne dağıtın.</li>
	<li>4 °C ' de üç dakika için 7.500 x g 'de hücreleri döndürün. PBS aspirate, hücre Pelet arkasında bırakarak. Hücre Pelet olarak depolanabilir-80 °c işleme kadar</li>
</ol>3. proteinin çıkarılması
<ol><li>Hazırlamak 100 μL ddH2O seyreltilmiş 1x liziz tampon (bkz. malzeme tablosu). 1 mM final konsantrasyonuna kullanmadan hemen önce phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) ekleyin.</li>
	<li>Ekleme 50 μL 1x liziz tampon doğrudan hücre peleti ve askıya alın. Bunu 5 dakika boyunca buzda kulbe.</li>
	<li>% 40 ' de sabit darbe modunu kullanarak 8 s için sonikat (sonicator için malzeme tablosuna bakın; farklı sonicators için gerektiği şekilde ayarlayın), özü buzun üzerinde tutarak.</li>
	<li>16.000 x g'de 5 dakika için özü 4 °c ' de döndürün. Süpernatant çözünür protein fraksiyonu olduğunu. Eğer istenirse, protein konsantrasyonu belirlemek için Bradford Analizi yapılabilir.</li>
</ol>4. numune hazırlama
<ol><li>10 μL çözünür protein ekstresi alın ve 10 μL 1x Laemmli SDS-numune tampon ekleyin (% 4 SDS,% 20 gliserol, 0,004% bromophenol mavi ve 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Herhangi bir azaltma reaktifleri eklemeyin.</li>
	<li>SDS PAGE Analizi o gün gerçekleştirilecektir Eğer örnekleri buzda tutun; uzun süreli depolama için-20 °C uygundur. Jeli çalıştırmadan hemen önce, numuneyi 85 °C ' de 5 dakika ısıtın.</li>
</ol>5. In vivo formaldehit çapraz-U-2 OS hücrelerinde endojen proteinlerin bağlama
<ol><li>U-2 OS hücrelerini bir 175 cm2 Flask 'e% 70 –% 80 ' e kadar büyütün (bkz. Bölüm 1).</li>
	<li>
Formaldehit çapraz reaksiyonu gerçekleştirin
	<ol>
<li>Bir duman kaputu, bir 37% formaldehit çözüm ticari kaynaklardan satın kısım. Formaldehit fiktasyonunu doğrudan orta% 1 ' lik bir son konsantrasyona ekleyin ve 15 dakika boyunca yumuşak ajitasyon ile Oda sıcaklığında inküye yapın.</li>
		<li>Reaksiyonu gidermek için, 0,125 m son konsantrasyonuna 1,25 m glisin ekleyin ve 5 dakika boyunca bir rocker üzerinde nazik ajitasyon ile Oda sıcaklığında inküye.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri üç kez 5 mL soğuk PBS ile yıkayın. Son PBS yıkama çözümünü aspirate ve 10 mL PBS ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak Flask altındaki hücreleri scrape.</li>
	<li>10 mL 'Lik bir pipet kullanarak, PBS ve hücre süspansiyonunu çizin ve tüm sıvıyı 15 mL konik Santrifüjlü tüpüne dağıtın. 500 x g 'de hücreleri 4 °c ' de 2 dakika boyunca döndürün. PBS aspirate, hücre Pelet arkasında bırakarak.</li>
</ol>6. çekirdeklerin fraksiyonlama
<ol><li>10 mL homojenizasyon tamponu hazırlayın: 0,25 M sakaroz, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES ve pH 7,4 ' de% 0,5 BSA. 1 mM son konsantrasyon ve 3mL çekirdekleri süspansiyon tamponu (0,1% Triton X-100 PBS) için kullanmadan hemen önce PMSF ekleyin.</li>
	<li>Doğrudan hücre Pelet 5 ml homojenizasyon tampon ekleyin ve tamamen askıya. 4 °C ' de 2 dakika için 500 x g 'de süspansiyon Santrifüjü sonra supernatant atın.</li>
	<li>5 ml homojenizasyon tamponunun içinde Pelet askıya alın. Sıkı sığdırıcı cam Teflon Homogenizer kullanın, 10 Strokes/500 rpm 'de hücreleri homojenize Dons.</li>
	<li>Süspansiyonu 4 °C ' de 10 dakika 1.500 x g 'de Santrifüjden çıkarın, ardından süpernatant 'ı atın. Not: 10 dakika 10.000 x g santrifügleme ile mitokondri yalıtım için süpernatant kullanın.</li>
	<li>1 ml çekirdeğin süspansiyon tamponunun içinde Pelet askıya alın ve 10 dakika boyunca buzun üzerinde inkübe.</li>
	<li>600 x g 'de Santrifüjü 10 dakika boyunca çıkarın.</li>
	<li>1 mL çekirdekleri süspansiyon tamponunun içinde Pelet askıya ve tekrar Santrifüjü. Süpernatant atın. Son Pelet izole çekirdekler olacak.</li>
</ol>7. proteinin çıkarılması
<ol><li>Bölüm 4 ' ü yineleyerek, doğrudan hücre peleti için 25 μL 1x liziz tamponu eklendikten sonra askıya alınması dışında.</li>
</ol>8. numune hazırlama
<ol><li>Çözünür protein özü her biri 10 μL alarak SDS-sayfa için iki numune hazırlamak ve 10 μL 2x Laemmli SDS-numune tampon ve 1 μL 2-mercaptoethanol (BME) ekleyin.</li>
	<li>37 °C ' de 5 dk ve 98 °C ' de 15 dakika için ikinci numune ile formaldehit çapraz bağlantısını tersine çevirmek için bir numune ısı.</li>
</ol>9. SDS-sayfa Analizi
<ol><li>1 L 1x Tris-Glycine çalışan tampon (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0,1% (w/v) SDS) hazırlayın.</li>
	<li>
SDS-PAGE çalışan aparatı ayarlayın. Not: bu protokol% 16 prekast TGX sds-page kullanır. Not, herhangi bir yüzde jel kullanılabilir.<ol>
<li>Üretici protokolüne göre, jelin depolandığı paketi açın ve kaseti çıkarın.</li>
		<li>Kuyuları ve kaseti kasetin alt kısmından kaplayan tarağı çıkarın.</li>
		<li>Jeli çalışan aparatın içine yerleştirin.</li>
		<li>Kuyular sıvıya batıncaya kadar, odası 1x çalışan tampon ile doldurun. Plastik bir pipet kullanarak, kuyuları çalışan tampon ile durulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 μL önceden eklenmiş standart işaretleyiciyle birlikte jel üzerindeki örnekleri yükleyin.</li>
	<li>Jel altında yaklaşık 1 cm boya ön kadar 200 V jeli çalıştırın.</li>
</ol>10. Batı Blot
<ol><li>1 L 1x transfer tamponu hazırlayın (25 mM Tris, 192 mM gcine,% 20 metanol) ve kullanım kadar 4 °C ' de saklayın.</li>
	<li>Jeli dikkatle çıkarın ve kaseti açın. Bir Razor kullanarak, dikkatle kesme ve istifleme jel atın. Bir köşe kullanarak jel alın ve transfer tampon ile bir tepsi içine yerleştirin, yavaşça 5 dakika boyunca kaya izin.</li>
	<li>Jel sallanan iken, Transfer tankı içine bir buz bloğu (-20 °C saklanır) yerleştirin ve 3/4 tam transfer tampon ekleyin.</li>
	<li>Poliviniliden fluorid (PVDF) membranı, 30 s için% 100 metanol içinde ıslatarak ıslansın.</li>
	<li>5 dakika geçtikten sonra, Transfer tampon ile bir tepsi içinde transfer kurmak için hazırlayın. Transfer arabelleği, Blot tamamen alt etmek için yeterli olmalıdır. Leke transferini aşağıdaki şekilde ayarlayın: altta, kaset tutucunun alt kısmı (siyah); sonra kalın bir sünger, ekstra kalın Blot kağıt, poliakrilamid jel, PVDF membran, ekstra kalın Blot kağıt, ve kalın bir sünger; sonra sonunda kaset tutucu (beyaz) üst üst.</li>
	<li>Kaseti kilitle ve ünitesi, PVDF membranı ile pozitif anot ve jelin negatif yönüne doğru transfer tankına yerleştirin. Transferiniz tamamen batana kadar transfer tamponunun bulunduğu ünitenin üstü.</li>
	<li>Üniteyi karıştırma plakasının üstüne yerleştirin. Birime bir karıştırın çubuk ekleyin ve 125 RPM 'de karıştırma başlar.</li>
	<li>60 dk için 100 V 'de çalıştırın.</li>
	<li>Transfer çalışırken, ara-20, pH 7,5 (TBST) ile Tris-tamponlu salin içinde çözünmüş% 5 toz süt çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Üniteyi sökün ve zarı çıkarın, hangi tarafın jel ile temas ettiğini belirterek; Bu tarafın kalan adımlar için tepsiye kadar kalmasını sağlayın.</li>
	<li>Membranı 2 dakika boyunca Tris-tamponlu tuz (TBS) olarak ıslatarak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 5 mL 5% süt-TBST çözeltisi içinde inküklenerek membran engelleyerek takip edilir.</li>
	<li>Sütünü taze 4 mL% 5 süt-TBST solüsyonu ile değiştirin ve birincil antikor doğru seyreltme (Bu durumda, seyreltme, dUTPase antikor için 1:2000 ' dir) ve 4 °C ' de hafif sallanan ile gece boyunca inküyeyin.</li>
	<li>Ertesi gün, 4 °c rocker dan bir oda sıcaklığı rocker, birincil antikor çözeltisi atarak leke çıkarın.</li>
	<li>TBST ile üç hızlı yıkayarak, tamamen Blot aşağı, 3 yıkayan, 5 dakika her, yavaş sallanan takip altına almak için yeterli sıvı kullanarak yapın.</li>
	<li>Son yıkama sonrasında, 5% süt-tbst çözeltisi 5 ml ekleyin ve 15 dakika sonra atmak için leke kaya.</li>
	<li>İstenen konsantrasyonda% 5 Milk-TBST ' a seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin. (Bu durumda, 1:5000 keçi Anti-tavşan% 5 süt-TBST çözeltisi 5 mL seyreltilmiş)</li>
	<li>Oda sıcaklığında inküye, 1 h için sallanan, sonra solüsyonu atın.</li>
	<li>TBST ile üç hızlı yıkamayı takip edin, 3 yıkanarak, 5 dakika her, yavaşça sallanan, sonra son yıkama atın ve 5 mL TBS ekleyin.</li>
	<li>Bir ECL chemiluminesans algılama çözeltileri bir 1:1 karışımı hazırlamak (2 ml son hacmi için her reaktif 1 ml) ve 1 dakika boyunca kulyatan leke doğrudan bu ekleyin.</li>
	<li>Membran Cımbız kullanarak çıkarın ve bir laboratuar silme ile köşe DAB, herhangi bir aşırı solüsyonu kaldırarak. Membranı Shrink SARINA yerleştirin ve protein tarafını bir x-ışını kasetine yerleştirin.</li>
	<li>Membranı x-ışını filmini açığa çıkarın. Pozlama süresi farklılık gösterecektir.</li>
</ol>

<ol><li>Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine-based+redox+switches+in+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cysteine-based redox switches in enzymes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).</li>
<li>Antelmann, H., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches and gene regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).</li>
<li>Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+in+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).</li>
<li>Groitl, B., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).</li>
<li>Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nonreducing+SDS-PAGE+for+monitoring+renaturation+of+recombinant+protein+synthesis+initiation+factor%2C+eIF-4+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha.</a> Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).</li>
<li>Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+bond+determination+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide bond determination by mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).</li>
<li>Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Protein+Disulfide+Linkages+by+MS+In-Source+Dissociation+Comparing+to+CID+and+ETD+Tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Kelly, S. M., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+circular+dichroism+in+the+investigation+of+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function.</a> Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).</li>
<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585(2010).</li>
<li>Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formaldehyde+cross-linking%3A+it+is+time+for+black+box+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).</li>
<li>Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+residues+contribute+to+the+dimerization+and+enzymatic+activity+of+human+nuclear+dUTP+nucleotidohydrolase+%28nDut%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut).</a> Protein Science. , (2018).</li>
<li>Caradonna, S., Muller-Weeks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+enzymes+involved+in+uracil-DNA+repair%3A+isoform+characteristics+of+proteins+responsible+for+nuclear+and+mitochondrial+genomic+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity.</a> Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noxious+compounds+activate+TRPA1+ion+channels+through+covalent+modification+of+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines.</a> Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
</ol>

Yazarlar, bu makalenin içeriğiyle ilgili çatışmalara sahip olmadıklarını beyan ederler.

Burada özetlenen Yöntem, disülfür bağlantıları aracılığıyla stabilize multimerik kompleksleri analizi için düz ileri bir protokol verir. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için izin veren diğer hücre kültürü hatları, dokulara ve organizmalara kolayca adapte edilebilir.
Bu prosedürün önemli bir adımı disülfit bağlantıların ekstraksiyon prosedürün bir sonucu olmadığından emin olmaktır. Herhangi bir ücretsiz sistein kalıntıları iodoacetamid13kullanılarak bloke edile...

Disulfide bağlantıları uzun birçok proteinlerin yapısını stabilize olduğu bilinmektedir. Son çalışmalar, bu Bond da geri dönüşümlü bir post-translational modifikasyon olarak sınıflandırılmıştır, bir sistein tabanlı olarak hareket "redox anahtarı" protein fonksiyonu modülasyonu için izin, konum ve etkileşim1,2, 3,4. Böylece, bu değişiklik çalışabilmesi önemlidir. Bu sistein-stabilize multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem olmayan azaltarak SDS-sayfa analizi5. SDS-page analizi, sonuçların hızlı, kolay ve minimal maliyetlerle elde edileceği ve yorumlandığı birçok laboratuvarlarda kullanılan bir tekniktir ve Mass spektrometri 6 gibi disülfit bağlantıları tanımlamak için kullanılan diğer teknikler üzerinde avantajlıdır. ,7 ve dairesel dikroizm8.
Bu yöntem bir çalışmada yardımcı olmak için uygun bir tekniği olup olmadığını belirlemede önemli bir adım iyice sistein kalıntı (ler) mevcut olması için faiz protein birincil sırasını incelemek için. Başka bir yararlı adım yayınlanan herhangi bir önceki kristal yapıları araştırma veya sistein kalıntı (ler) bulunabilir görselleştirmek için ilgi proteininin üç boyutlu yapısını keşfetmek için bir Biyoinformatik uygulama kullanın etmektir. Kalıntı (lar) dış yüzeyde varsa, yapının içinde gömülü bir sistein kalıntı yerine disülfür bağlantı oluşturmak için daha iyi bir aday olabilir. Ancak, proteinlerin substrat etkileşimleri veya protein-protein etkileşimleri üzerine yapısal değişiklikler geçirebilir ve bu kalıntıları daha sonra da çevreye maruz kalmalarına izin vermek önemlidir.
Tanımlanan multimerik kompleksleri daha sonra formaldehit kullanarak kimyasal çapraz bağlama ile doğrulanabilir. Formaldehit, yüksek hücreli geçirgenliği ve ~ 2-3 Å kısa çapraz bağlama aralığı nedeniyle bu doğrulama tekniği için ideal bir çapraz bağlayıcı, spesifik protein-protein etkileşimlerini tespiti sağlamak9,10. Burada, bu yöntem, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS11dutpase nükleer izoformu analiz ederek gösterilmiştir. Ancak, bu protokol diğer hücre hatları, dokular ve organizmalar için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>%16 prekast TGX jeller</td><td>ThermoFisher</td><td>Xp00160</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 Flask</td><td>Cell star</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>18CO</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>6 cm2 çanak</td><td>VWR</td><td>10861-588</td><td></td></tr><tr><td>A549 ATCC</td><td></td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL algılama kiti</td><td>GE</td><td></td><td></td>16817200</tr><tr><td>Leke transfer aparatı</td><td>Biorad</td><td>153BR76789</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Bradford protein reaktifi</td><td>Biorad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Mavisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Hücre sinyalizasyonu</td><td>99985</td><td></td></tr><tr><td>Hücre lizis tamponu</td><td>Hücre sinyali</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendor</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Matkap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez aparatı</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra kalın batı kurutma kağıdı</td><td>ThermoFisher</td><td>88610</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>1932693</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Cam-teflon homojenizatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>65516</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>RPI</td><td>636050</td><td></td></tr><tr><td>Isı bloğu</td><td>Denville</td><td>10285-D</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>VWR</td><td>2018010431</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>ThermoFisher</td><td>90034</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız kuru süt</td><td>Hücresi sinyalizasyonu</td><td>99995</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Posi-tıklama tüpü</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>Biorad</td><td>200120</td><td></td></tr><tr><td>Önceden boyanmış işaretleyici</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membran</td><td>Biorad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Güvenilir Bilimsel</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Saos2</td><td>ATCC</td><td>HTB-85</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>İkincil antikor</td><td>Hücre sinyalizasyonu</td><td>70748</td><td></td></tr><tr><td>Küçük hücreli sıyırıcı</td><td>Tygon</td><td>S-50HL sınıf VI</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Branson</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>Lekeleme için sünger ped</td><td>Invitrogen</td><td>E19051</td><td></td></tr><tr><td>Karıştırma plakası</td><td>Corning</td><td>PC353</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-1888</td><td></td></tr><tr><td>Tris Baz</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Tris Tamponlu Salin, Tween 20, pH 7.5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRE0031</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glisin çalışan tampon</td><td>VWR</td><td>J61006</td> ile<td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>X-ışını filmi</td><td>ThermoFisher</td><td>34090</td><td></td></tr></tbody></table>

kültürde memeliler hücrelerinde disulfide bağlantıları ile stabilize multimeric kompleksleri algılamak için non-azaltma sds-sayfa analizi ve kimyasal crosslinking birleştiren

Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture

Birçok proteinlerin yapıları, kovalent disülfür bağlantıyla stabilize edilir. Son zamanlarda bu bağ da bir post-translational modifikasyon olarak sınıflandırılmıştır. Böylece, bu değişiklik yaşam hücrelerinde çalışma muktedir önemlidir. Bu sistein-stabilize multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem olmayan SDS-sayfa analizi ve formaldehit çapraz bağlama iki adımlı bir yöntem aracılığıyla. Bu iki adımlı Yöntem, teknik kolaylığı ve düşük kullanım maliyeti nedeniyle disülfit bağlantıyla stabilize edilmiş multimerik kompleksleri açığa çıkarmak için ilk adım olarak avantajlıdır. Burada, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS özellikle dutpase nükleer izoformu analiz ederek bu yöntemi göstermek için kullanılır.

Nükleer dUTPase her monomerik protein11üçüncü amino asit konumlandırılmış iki sistein kalıntılarının etkileşimi ile istikrarlı bir dimer yapılandırma oluşturan bir moleküllü disülfür bağlantı oluşturur. Bu Şekil 1a, B'de gösterilmiştir. Bu disülfür bağlantıyı sağlamak için sınırlı olmayan ortamda göç anormallikleri nedeniyle spesifik olmayan bir etkileşim değil, t uygun bir kontrol eklenmesi esastı. Not, nükleer dutpas...

Disulfide bağlantıları uzun birçok proteinlerin yapısını stabilize olduğu bilinmektedir. Bu bağlantıyla stabilize edilmiş multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem, SDS-PAGE analizinin azaltılması yoluyla yapılır. Burada, bu yöntem, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS dutpase nükleer izoformu analiz ederek gösterilmektedir.

Kültürde memeliler hücrelerinde Disulfide bağlantıları ile stabilize Multimeric kompleksleri algılamak için non-azaltma SDS-sayfa analizi ve kimyasal Crosslinking birleştiren

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a ...

Birçok proteinin yapılarının kovalent disülfür bağlantılarında stabilize olduğu iyi belirlenmiştir. Son çalışmalarda bu bağ bir post-çeviri değişiklik olarak sınıflandırılmıştır. Bu nedenle, hızlı ve basit bir yöntem kullanarak canlı hücrelerde sistein stabilize multimer kompleksleri tanımlamak mümkün olmak önemlidir.Bu tekniğin en büyük avantajı, sonuçların hızlı, kolay ve minimum maliyetle elde edilebiliyor ve yorumlanabiliyor olmasıdır. Başlamak için, Minimum Esansiyel Orta Yüksek Glikoz altı santimetre kare santimetre çanak U-2 işletim sistemi hücreleri büyümek, ile takviye 10%FBS ve% 1 sodyum pirüuvat ile desteklenmektedir 37 santigrat derecede 5% karbondioksit. Kullanmadan hemen önce 10 milimolar iodoacetamide taze stok yapın.Hücreler %50-60 biraraya geldikten sonra, doğrudan hücre kültürü ortamına 0.1 milimoler son konsantrasyon iyodoasetamid ekleyin. Yavaşça iki dakika oda sıcaklığında çanak kaya. Daha sonra, hücrelerden medya aspire ve soğuk PBS beş mililitre ile hücreleri üç kez yıkayın.Son PBS yıkama çözeltisini aspire edin ve bir mililitre soğuk PBS ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak çanak alt hücreleri kazıyın. Bir mililitrelik pipet kullanarak PBS ve hücre süspansiyon uyup tüm sıvıyı 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne dağıtın.Hücreleri 7,500 kez g'de dört santigrat derecede üç dakika döndürün. PBS'yi hücre peletini arkada bırakarak aspire edin. Hücre pelet işleme kadar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir.Proteini çıkarmak için, 1X lysis tamponunun 100 mikrolitresini çift distile suda seyreltin. Bir milimolar son konsantrasyon kullanmadan hemen önce PMSF ekleyin. Daha sonra doğrudan hücre pelet ine 1X lysis tampon 50 mikrolitre ekleyin ve yeniden askıya.Ekstraktını beş dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. %40'ta sabit darbe modunu kullanarak sekiz saniye sonicate ekstresi buz üzerinde tutmak. Beş dakika boyunca dört santigrat derece ve 16,000 kez g ekstresi spin.İstenirse protein konsantrasyonu belirlemek için Bradford analizi gerçekleştirin. Numuneyi hazırlamak için çözünür protein ekstresinin 10 mikrolitresini alın ve 1X Laemmli SDS numune tamponunun 10 mikrolitresini ekleyin. Örnekleri buzda tut.Jeli çalıştırmadan önce numuneyi 85 derecede beş dakika ısıtın. Formaldehit çapraz bağlama başlamak için, bir 175 santimetre kare şişe de U-2 işletim sistemi hücreleri büyümek 70-80% biraraya. Bir duman başlık olarak 15 dakika boyunca nazik ajitasyon ile oda sıcaklığında% 1 ve inkübat nihai konsantrasyona orta doğrudan formaldehit fiksatif ekleyin.Reaksiyonu gidermek için 0.125 molar son konsantrasyonuna 1.25 molar glisin ekleyin ve beş dakika boyunca bir rocker üzerinde nazik ajitasyon ile oda sıcaklığında inkübat. Hücreleri beş mililitre soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Son PBS yıkama çözeltisini aspire edin ve 10 mililitre PBS ekleyin.Bir hücre kazıyıcı kullanarak şişenin altındaki hücreleri kazıyın. 10 mililitrelik pipet kullanarak PBS ve hücre süspansiyonu çizin ve sıvının tamamını 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne dağıtın. Hücreleri 500 kez g ve dört santigrat derecede iki dakika döndürün.PBS'yi hücre peletini arkada bırakarak aspire edin. PH 7.4'te 0.25 molar sakaroz, bir milimolar EDTA, 10 milimolar HEPES ve %0.5 BSA ekleyerek homojenizasyon tamponunun 10 mililitresini hazırlayın. Kullanmadan hemen önce, PMSF'yi bir milimolar son konsantrasyona ve üç mililitre çekirdek süspansiyon tamponuna ekleyin.Doğrudan hücre peletinin homojenizasyon tamponunun beş mililitresini ekleyin ve tamamen askıya alın. Süspansiyonu 500 kez g ve dört santigrat derecede iki dakika santrifüj edin. Santrifüjden sonra, süpernatant atın ve homojenizasyon tampon beş mililitre pelet resuspend.Sonra sıkı bir uydurma cam Teflon homogenizer ile 500 RPM başına 10 vuruş hücreleri homojenize ve 1, 500 kez g ve dört derece Santigrat 10 dakika süspansiyon santrifüj. Santrifüjden sonra supernatant atın. Çekirdeği süspansiyon tampon bir mililitre pelet resuspend ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.Kuluçkadan sonra, 10 dakika boyunca 600 kez g santrifüj. Santrifüjden sonra, süpernatant atın, çekirdek süspansiyon tampon ve santrifüj bir mililitre pelet resuspend tekrar. Son pelet izole çekirdekler olacak.1X lysis tamponunun 25 mikrolitresini doğrudan hücre peletine eklemeden önce tarif edilen proteinleri ayıklayın. Daha sonra çözünür protein ekstresinin her biri 10 mikrolitre alarak SDS PAGE için iki örnek hazırlayın ve 10 mikrolitre 2X Laemmli SDS numune tamponu ve bir mikrolitre BME ekleyin. Formaldehit çapraz bağlantısını tersine çevirmek için bir numuneyi 37 derecede 5 dakika, ikinci numuneyi ise 98 santigrat derecede 15 dakika ısıtın.25 milimolar Tris, 192 milimolar glisin ve hacim Başına %0,1 ağırlık SD karıştırarak 1X Tris-glisin çalışan tampon bir litre hazırlayın. Daha sonra SDS PAGE çalışan aparatı ayarlayın. Üreticiprotokolüne göre %16 önceden yayınlanmış TGX SDS-PAGE paketini açın ve kaseti çıkarın. Kuyuları ve bandı kasetin altından astarlayan tarakçıkarın ve jeli çalışan aparata yerleştirin.Kuyular sıvıya batırılana kadar odayı 1X çalışan tamponile doldurun. Plastik bir pipet kullanarak çalışan tampon ile kuyuları durula. Numuneleri, önceden boyanmış standart işaretleyicinin 10 mikrolitresi ile birlikte jel üzerine yükleyin.Son olarak, boya ön jel in altından yaklaşık bir santimetre olana kadar 200 volt jel çalıştırın. BME azaltıcı ajanın yokluğunda toplam hücre ekstrelerinin batıda yapılan bir leke analizi, farklı insan hücre popülasyonlarında çok merik kompleks bir oluşum olduğunu göstermiştir. Kompleks, incelenen dört hücre hattında da BME eklenmesiyle ortadan kayboldu ve disülfür bağlantısının varlığını gösterdi.Hasat sırasında insan hücrelerinde dUTPase monomerik onay dUTPase isoformen az üç bir kombinasyonudur: mitokondriyal isoform, nükleer isoform, ve bir kesilmiş versiyonu M24 kaydetti. Kontrol olarak kullanılan mitokondriyal izoform disülfür bağlantısı oluşturmamış ve monomerik protein için öngörülen moleküler ağırlığa göç etmiştir. Nükleer dUTPase'nin formaldehit çapraz bağlanması çok meric kompleks oluşumunu göstermiştir.Çapraz bağlantı, numuneyi 95 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırarak tersine çevrildiğinde, kompleksin dengesi bozuldu ve monomerik durumunda görüntülenebilecekti. Iyodoacetamide eklemek, serbest sistein kalıntılarını engellemek ve disülfür bağlantılarının ekstraksiyon prosedürünün bir sonucu olmadığından emin olmak için bu prosedürde önemli bir adımdır. SDS-PAGE örneklerinize BME veya DDT gibi herhangi bir azaltıcı etken eklememeniz önemlidir, çünkü bu durum örneğinizde bulunan disülfür bağlantılarını azaltacaktır.

combining-non-reducing-sds-page-analysis-chemical-crosslinking-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Hücre geçirgen çapraz bağlayıcı DSP [dithiobis-(succinimidyl propiyonat)] stabilize geçici ve labil...

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

Yakalama Bileşikler fotoğraf crosslinking ve saflaştırma takip fonksiyonel geri dönüşümlü küçük molekül-protein etkileşim proteom karmaşıklığını azaltmak için trifunctional küçük moleküllerdir. Burada Yakalama...

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

Bu videoda, doğal protein komplekslerini doku homojenatlarından ayırmak için multimerik PAGE açıklanmaktadır. Teknik, mavi yerel PAGE ve SDS-PAGE tekniklerinin bir karışımıdır. Ayrılan kompleksler, hücre işleyişindeki rolleri için karakterize edilebilir ve incelenebilir.

Doğal protein komplekslerini ayırmak için Multimer-PAGE: bozulmamış multimerik proteinleri doku lizatından ayırmak için Blue Native-PAGE ve SDS-PAGE'den oluşan hibrit bir ayırma tekniği

Bu videoda, multimerik protein komplekslerini analiz etmek için protein örneklerini indirgeyici olmayan SDS-PAGE ile ayırma tekniği açıklanmaktadır. Bu teknik, disülfid bağları tarafından tutulan ve daha sonra western blotlama ile analiz edilebilen bir proteinin multimer alt birimlerini korur.

İndirgeyici Olmayan SDS PAGE: Disülfide Bağlı Multimerik Protein Komplekslerini Analiz Etmek İçin Bir Yöntem

Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Bu makale, insan hücrelerinin lizatlarından elde edilen dinnamin benzeri GTPase MxA proteininin oligomerik durumunu, denatüre olmayan PAGE ile western blot analizinin bir kombinasyonunu kullanarak değerlendirmek için basit ve hızlı bir protokolü açıklamaktadır.

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Burada, bir çapraz bağlayıcı varlığında gliserol gradyan santrifüjleme olan Grafix'in (Gradyan Fiksasyonu), spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için kullanımını açıklıyoruz.

Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes Geçici Interactors Tespiti için Grafix kullanımı

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Öğrenin, disülfid bağlarıyla stabilize edilmiş multimerik protein komplekslerini U-2 OS hücrelerinde hızlı ve düşük maliyetli bir şekilde analiz etmek için indirgenmeyen SDS-PAGE ve kimyasal çapraz bağlama yöntemlerini.

Kültürde memeliler hücrelerinde Disulfide bağlantıları ile stabilize Multimeric kompleksleri algılamak için non-azaltma SDS-sayfa analizi ve kimyasal Crosslinking birleştiren (Video) | JoVE Journal

Kültürde memeliler hücrelerinde Disulfide bağlantıları ile stabilize Multimeric kompleksleri algılamak için non-azaltma SDS-sayfa analizi ve kimyasal Crosslinking birleştiren

Daha fazla video keşfet