Larva A roman koni şeklindeki sünger-uç elektrot kullanarak Zebra balığı Electroretinogram kayıt

Bu protokol, görsel gelişim ve genetik hastalık modellerinin önemli bir fonksiyonel okumasını sağlayan larva zebra balıklarında elektroretinogram veya ERG ölçümlerinin basitleştirilmesine yardımcı olur. Bu protokolde kullanılan elektrotların kayıt yumuşak sünger uçları ekonomik ve hazır malzemeler kullanılarak üretilmesi kolaydır ve larva gözlerde potansiyel hasar dan önler. Yumuşak sünger uçlu elektrot aynı gözün tekrarlanan ERG ölçümlerini kolaylaştırabilir.

Bu yordamın yeni bireyleri, yordam boyunca kullanılan loş kırmızı ışık altında çalışmakta zorlanabilir. Ama karanlık adaptasyonun sürdürülmesi önemlidir. Koni şeklindeki sünger kayıt elektrodu hazırlamak için, platin elektrot kurşun uzantısı ndan ucunu kesin ve dış politetrafloroetilen yalıtım kaplamasının 10 milimetrelik kısmını uzatmanın yeni ucundan çıkarmak için neşter kullanın.

0,3 milimetre çapında gümüş telden 40 milimetrelik bir parça kesin ve elektrot kurşununa teli güvenli bir şekilde takmak için gümüş teli açığa çıkan iç telle birleştirin. Yaklaşık 15 milimetre uzunluğunda gümüş tel maruz bırakarak yalıtım bandı ile ortak kaplı. Başka bir kabloyu pilin negatif terminaline bağlayın ve kablonun diğer ucunu tuzlu suya daldırın.

Maruz kalan gümüş teli normal tuzlu ya daldırın ve diğer ucunu dokuz voltluk doğru akım kaynağının pozitif terminaline bağlayın. 60 saniye sonra, kuruması için emici doku üzerine tel yerleştirin. Bu arada, bir koni şekli içine polivinil asetat sünger 20 tarafından 20 milimetre kare kesilmiş ve bir kez Ringer tampon sünger doygunluk.

Mercek üzerinde kireç çubuğu olan bir ışık mikroskobu altında, koninin apeksini yaklaşık 40 mikrometre çapa kadar şekillendirmek için neşter bıçağı kullanın. Katı olana kadar emici mendil kağıt üzerinde koni şeklindeki süngeri hava kurutun. Kurutulmuş katı koni şeklindepolivinil asetat sünger içine gümüş tel eklemeden önce konin tabanı ile, fotovoltaik eserler azaltmak için herhangi bir aşırı maruz metal izole etmek için maske bant kullanarak.

Deney günü, süngeri tam olarak doygunhale getirmek için sünger uçlu elektrotu Ringer'ın tamponuna 15 dakika batırın. Kayıtlardan en az sekiz saat önce, tek bir 15 mililitrelik tüpe kapaksız ve koyu renkli bir kuvözde alüminyum folyoya sarılmış en fazla 20 zebra balığı larvası yerleştirin. Kuluçka nın sonunda, koyu adapte olmuş zebra balığını, ışık yayan bir diyottan loş kırmızı ışıklandırma altında bir petri kabına dökün.

Sünger platformu hazırlamak için, sünger çanak içinde rahatça uyacak şekilde 35 milimetre petri çanak derinliğine kabaca eşit polivinil asetat sünger bir parça kesti. Referans elektrotun gümüş tel karşılamak için sünger bir ucundan dikey küçük bir kesim yapmak ve sünger doymuş olana kadar japon balığı Ringer tampon sünger ıslatın. Sonra temiz bir 35 milimetre petri kabına sünger yerleştirin ve hafif bir parmak basın yanıt olarak hiçbir çözüm sünger sızan kadar ekstra sıvı emmek için bir kağıt havlu kullanın.

Deney için hayvanı konumlandırmak için, anestezili bir larvayı üç santimetre kare kağıt havluya aktarmak için üç milimetrelik Pasteur pipeti kullanın ve kareyi nemli süngerin üzerine yerleştirmek için forseps kullanın. Ringer'ın tamponuna batırılmış ince bir fırça kullanarak, larvanın konumunu bir gözü yukarı bakacak şekilde ve larvanın altındaki havludaki herhangi bir sıvıdan uzağa doğru ayarlayın. Hayvan elektroretinogram kayıt boyunca sulu tutmak için nemlendirici göz jeli ile larva vücut sır.

Ve bir Faraday kafes içinde bulunan Ganzfeld kase ışık uyarıcı önünde küçük, su ısıtmalı platform üzerinde çanak yerleştirin. Referans elektrot'u platform süngerinde yapılan kesime takın. Ve ticari olarak elde edilmiş bir yer elektrotünü Faraday kafesine bağlayın.

Kayıt elektrotunu bir elektrot tutucuya takın ve tutucuyu bir mikromanipülatörün stereotaksik koluna sabitlayın. Üç milimetrelik Pasteur pipeti kullanarak elektrotun sünger ucunu bir damla Ringer çözeltisi ile yeniden doygunlaştırın ve mikroskobu Faraday kafesindeki elektroretinogram platformunun üzerine yerleştirin. Elektrot sünger ucundan herhangi bir fazla sıvı kaldırmak için bir emici doku ucu kullanın ve mikroskop altında, sünger ucu yavaşça larva zebrabalığı gözünün merkezi kornea yüzeyine dokunur şekilde aktif elektrot konumlandırın.

Daha sonra Ganzfeld kabını sünger platformuna doğru hareket ettirin ve larvanın kasenin üzerini kapladığını ve gereksiz elektromanyetik gürültüyü azaltmak için kafesi kapatın. Larva zebra balığı retinasının sönük yanıp söner duyarlılığı yaşla birlikte artar. A-ve b-dalgaları döllenme sonrası dört gün sonra metre başına eksi 1,61 log kandela saniye daha düşük yoğunluklarda tanınabilir değildir net sinyaller eski larvalarda bu yoğunluklarda tespit edilir.

B dalgası genliği döllenme sonrası dört ila beş arasında belirgin bir şekilde artar. Yedi gün, metre kare başına 2,48 günlük kandela saniye sinyal gün beş ve altı post fertilizasyon ile karşılaştırıldığında daha büyüktür. A-ve b-dalgası örtük kez beş gün sonra döllenme sonrası önemli ölçüde daha hızlı olur.

Genel olarak, bu sonuçlar dört ila yedi gün post-fertilizasyon arasında zebrabalığı retina fonksiyonu nda bir olgunlaşma gösteren. Bu protokolü başarıyla gerçekleştirmek için süngerlerin, kayıt elektrotunun iletkenliğini korumaya yardımcı olan ve gürültü seviyelerini düşüren sıvıyla tamamen doymuş olması önemlidir. A-dalga özellikle ilgi ise, farmakolojik tedaviler b-dalga bileşeni böylece tam a-dalga açığa engellemek için uygulanabilir.