Name: Kültür ve ölçme fetal ve yenidoğan Murine uzun kemikler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Keşfedin fetal ve yenidoğan murine uzun kemiklerinin ekzojen kültür yöntemini. Bu teknik, kemik gelişimini canlı görüntüleme ve farmakolojik manipülasyon ile kontrollü koşullarda analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu protokol kuruldu onun desteği için Alexandra Joyner teşekkür etmek istiyorum, Edwina McGlinn ve yi-Cheng Chang retinoik asit paylaşımı için. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü Victoria devlet hükümeti ve Avustralya hükümeti hibe tarafından desteklenmektedir.

Tüm deneyler, Laboratuvar hayvanlarının etik olarak işlenmesi için yerel hükümet ve kurumsal yönergelerin ardından yapılmalıdır.
1. kemik kültürü gününden önce preparatlar
<ol><li>Embriyonik gün 14,5 (E 14.5) ve daha sonra fetus ve pups elde etmek için zamanlanmış fare matings ayarlayın. Not: Uzun kemikler kültürü farklı fare suşları için başarıyla uygulanabilir; Mevcut protokolde, Isviçre Webster vahşi tip fareler dışarı kullanılır.</li>
	<li>Diseksiyon ortamını hazırlayın (Houston ve al.15' ten uyarlanmıştır): seyreltmeli α-asgari esansiyel Orta (α-mem) veya Dulbecco 'Nun modifiye kartal Orta (dmem) 1/13 fosfat-tamponlu tuz (PBS) ve 2 mg/ml Sığır serum albümin (BSA) ve filtre sterilize 0,22 μm, 33 mm çapında şırınga filtresi ile. Alquots-20 °C ' de saklayın.</li>
	<li>Fetüsleri çıkarmadan önceki gün, 0,2% BSA, 0,5 mM L-glutamin, 40 U/mL penisilin/streptomisin, 0,05 mg/mL askorbik asit ve 1 mM betaglycerophosphate içeren DMEM 'den oluşan serum içermeyen kemik kültürü ortamını hazırlayın. 0,22 μm, 33 mm çapında şırınga filtresi ve 1 aya kadar 4 °C ' de muhafaza edilen filtre sterilize edilir.</li>
	<li>Kültür günü ve fare dağılmadan önce, 24-kuyu plakaları hazırlamak ve 60 mm yemek diseksiyon orta ve onları buz soğuk tutmak. 37 °C ' lik su banyosunda kemik kültürü ortamını ısıtın. Sprey 80% (v/v) etanol (cımbız ve küçük makas), fetus işleme için kullanılacak araçlar üzerinde. Bir sınıf II Biyogüvenlik kabinine dürbün kapsamını aktarın.</li>
</ol>2. fetus ve yenidoğan Tibia ve femur kültürü
<ol><li>İstenen Gestasyonel aşamada servikal çıkığı ile hamile fare Cull (e 14.5 den e 18.5 kadar). Eğer yenidoğan yavruları kullanılırsa, onları annenden tek tek çıkarın ve deptitasyon ile itlaf.</li>
	<li>Fareyi arkasına yerleştirin ve yüzeyinde% 80 (v/v) etanol püskürterek abdominal bölgeyi sterilize edin.</li>
	<li>Uterin boynuzları erişmek için küçük makas ile cilt ve karın kası kes.</li>
	<li>Rahim, cımbız ve küçük makas yardımıyla Karın boşluğundan ayıklayın, mezometriumu kaldırarak ve boynuzların tabanı kesme. Rahim bir 60 mm Petri çanak buz-soğuk diseksiyon orta ile yerleştirin ve tüm prosedür sırasında buz üzerinde kültür çanak tutmak.</li>
	<li>Biyolojik güvenlik kabinine rahim ile Petri tabağı aktarın ve şu andan itibaren orada çalışın.</li>
	<li>Saclar arasında kesim yaparak bireysel fetüsleri makas ile ayırın.</li>
	<li>Diseksiyon orta ile temiz bir 60 mm çanak bir diseksiyon mikroskoptan altında bireysel sac transfer ve plasentas fetüsleri ayırmak ve membranlar onları temizlemek için cımbız ile açın. Not: Geri kalanı buzda tutarken, bir defada bir embriyo ile çalışın.</li>
	<li>Fetüsleri kesip temizleyin ve vücudu 1 mL kesilmiş steril pipet ile temiz yeni 60 mm tabak ile aktarın.</li>
	<li>Geri başlayarak cımbız ile fetüslerin veya pups cilt çıkarın ve ayak parmakları kadar soyulmuş.</li>
	<li>Omurgaya yakın cımbız ile kesme ve buz-soğuk diseksiyon orta ile temiz bir çanak onları aktarmak bedeninden hindekstremite ayırın.</li>
	<li>Distal femur ve proksimal tibia yüzey kıkırdağı arasında dikkatle tanıtmak tarafından cımbız ile femur gelen Tibia ayırın.</li>
	<li>Proksimal femur ve kalkaneus kemik ve Tibia gelen fibula kalça kemikleri çıkarın.</li>
	<li>Dikkatlice femur ve Tibia dan kıstırma ve çekerek yumuşak doku çıkarın. Not: Mümkün olduğunca çok yumuşak doku kaldırmak için önemlidir, iki kıkırdak direkleri bağlayan doku kaldırma özel bakım alarak, ama kıkırdak zarar kaçınarak, perichondrium, ve kemikler.</li>
	<li>Plastik 1 ml steril pipet ile 24 kuyu plakasının ilk kuyusu içinde dört kemiği (sol ve sağ kaval ve femurs) yerleştirin. Alternatif olarak, sol ve sağ ekstremitelerde farklı tedavilerin etkisini karşılaştırmak için, farklı kuyularda kontralateral ekstremite yerleştirin. Not: Kemikleri kuyulara aktarıldığında ekstra bakım alınmalıdır, böylece pipet kolayca yapışabilir.</li>
	<li>Gerektiğinde birçok Fetüslerle aynı şekilde devam edin. Not: Açıkça disseke kemikler görmek önemli olduğu gibi, çok bulutlu alır en kısa sürede diseksiyon orta ile çanak değiştirin.</li>
	<li>
İstenilen tüm kemikler kuyulara aktarıldığında, diseksiyon ortamını plastik 1 ml steril pipet ile çıkarın ve kemikleri Aspire değil, ekstra özen yapın.
	<ol>
<li>Deneme amacına bağlı olarak, denemenin timepoint sıfır olarak diseksiyon orta çıkarmadan önce resimler kemikler alınabilir. Dijital kameraya bağlı bir mikroskop ile fotoğraf çekin ve kullanılan pozlama ve ölçek ek açıklama ekleyin. Kolay ve güvenilir ölçümler sağlamak için, mineralize parçayı ayırt etmek için iyi kontrast içeren resimler çekin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her iyi kültür orta 1 mL ekleyin. Herhangi bir tedavi kemikler (Doksisiklin, tamoksifen, büyüme faktörleri, vb) üzerinde tasarlanmıştır, şimdi eklenmesi gerekir.</li>
	<li>Kültür koşullarında büyüme inhibisyonu etkisini gözlemlemek için, retinoik asit (ra, 500 Nm) ile sol kaval tedavi, araç eşdeğer bir hacim ile doğru tifite inkükleme sırasında (dimetil sülfoxid [DMSO], nihai konsantrasyon 0,1%) bir kontrol olarak.</li>
	<li>Standart hücre kültürü koşullarında (37 °C ' de% 5 CO2 kuluçta) bir hücre kültürü kuluçta iki gün veya daha fazla büyümek için kemikleri bırakın.</li>
	<li>Proliferasyon değerlendirmek için, 5-etynyl-2'-deoxyuridine (EdU) veya 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) orta 10 μM 1 − 2 h son konsantrasyonda, fiktasyon önce ekleyin. Not: EdU 'nın stok konsantrasyonu 20 mM 'dir. Dikkat: EdU ve BrdU, timidin analogları ve toksik ve mutajisik olabilir.</li>
	<li>Çözülme 4% paraformaldehit (PFA) ve bireysel 2 mL tüplerde PFA daldırma tarafından kemikleri düzeltin. Dikkat: PFA toksik ve olası bir insan kanserojen olarak belirlenir. Civarında formaldehite tozu ve buharları nefes kaçının. EdU ve BrdU, timidin analogları ve toksik ve mutajisik olabilir.</li>
	<li>Oda sıcaklığında PFA 'da kısa bir 10 dk sabitleme sonrasında, son zaman noktasında resim edinme için kemikleri PBS 'ye aktarın. Sonra 4 °C ' de gece sabitleme için kemikleri PFA 'ya geri yerleştirin.</li>
	<li>Sabitleme kemikleri istenen akış uygulamaları için işlenebilir sonra.</li>
</ol>3. kemik ve mineralize bölgenin tam uzunluğunun ölçülmesi ve Analizi
<ol><li>Görüntünün ölçeğini dikkate alarak, kemiklerin uzunluğunu ölçmek için bir görüntü düzenleme yazılımı kullanın. Kemik ve mineralize bölgenin toplam uzunluğunu ölçün. İlk karanlık hücrelerdeki ölçümleri, diğer ucunda son olanlar kadar bir ucunda başlatın. Not: Mineralize bölge koyu renk ile karakterize ve kolayca kıkırdak ayırt edilir.</li>
	<li>Büyüme hızını hesaplamak için, günlük uzunluğu ortalama artış olarak tanımlanan, kemik son uzunluğu ve ilk bir kültür gün sayısı arasındaki farkı bölmek.</li>
</ol>

<ol><li>Long, F., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+endochondral+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of the endochondral skeleton.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334(2013).</li>
<li>Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endochondral+ossification%3A+how+cartilage+is+converted+into+bone+in+the+developing+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).</li>
<li>Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The control of chondrogenesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).</li>
<li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+the+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li>
<li>Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skeleton%3A+a+multi-functional+complex+organ%3A+the+growth+plate+chondrocyte+and+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification.</a> The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).</li>
<li>Maes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast+precursors%2C+but+not+mature+osteoblasts%2C+move+into+developing+and+fractured+bones+along+with+invading+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels.</a> Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts%3A+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li>
<li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development%2C+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genetics. 10 (12), e1004820(2014).</li>
<li>Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+and+pattern+of+the+onset+of+differential+growth+among+growth+plates+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).</li>
<li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).</li>
<li>Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+1alpha%2C+25-dihydroxyvitamin+D3+and+transforming+growth+factor-beta3+on+bone+development+in+an+ex+vivo+organotypic+culture+system+of+embryonic+chick+femora%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora.</a> PloS One. 10 (4), e0121653(2015).</li>
<li>Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+coordinates+oriented+cell+division+and+cell+rearrangement+in+clonally+expanding+growth+plate+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+studying+the+temporal+modulation+of+embryonic+skeletal+development+using+organotypic+bone+cultures+and+microcomputed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).</li>
<li>Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Murine+Embryonic+Metatarsals%3A+A+Physiological+Model+of+Endochondral+Ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+rats+and+mice+as+animal+models+in+ex+vivo+bone+growth+and+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+%26+Joint+Research%22%5BJournal%5D)">The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies.</a> Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).</li>
<li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+aging+of+growth+plate+cartilage+underlies+differences+in+bone+length+and+thus+helps+determine+skeletal+proportions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005263(2018).</li>
<li>Agoston, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+natriuretic+peptide+regulates+endochondral+bone+growth+through+p38+MAP+kinase-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways.</a> BMC Developmental Biology. 7, 18(2007).</li>
<li>Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-nonautonomous+local+and+systemic+responses+to+cell+arrest+enable+long-bone+catch-up+growth+in+developing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice.</a> PLoS Biology. 16 (6), e2005086(2018).</li>
<li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+ex+vivo+explant+cultures%3A+applications+in+bone+research%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEy Reports. 5, 818(2016).</li>
<li>Okubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+bioluminescence+monitoring+in+mouse+ex+vivo+bone+culture+revealed+persistent+circadian+rhythms+in+articular+cartilages+and+growth+plates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates.</a> PloS One. 8 (11), e78306(2013).</li>
<li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+analysis+of+the+growth+plate+in+a+murine+long+bone+explanted+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10332(2018).</li>
<li>Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+cell+adhesion+surface+regulates+tissue+architecture+in+growth+plate+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage.</a> Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).</li>
<li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Alvarez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta2+mediates+the+effects+of+hedgehog+on+hypertrophic+differentiation+and+PTHrP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression.</a> Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).</li>
<li>De Luca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+is+a+potent+regulator+of+growth+plate+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis.</a> Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).</li>
<li>Stern, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isometric+Scaling+in+Developing+Long+Bones+Is+Achieved+by+an+Optimal+Epiphyseal+Growth+Balance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance.</a> PLoS Biology. 13 (8), e1002212(2015).</li>
<li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+and+Mineral%22%5BJournal%5D)">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium.</a> Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).</li>
<li>Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErben%2C+RG+%22Handbook+of+histology+methods+for+bone+and+cartilage%22">Handbook of histology methods for bone and cartilage</a>. , Springer. 99-117 (2003).</li>
<li>Hu, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+to+bone+transformation+during+fracture+healing+is+coordinated+by+the+invading+vasculature+and+induction+of+the+core+pluripotency+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes.</a> Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).</li>
<li>Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+strain+history+of+bone%3A+spatial+uniformity+and+self-similarity+of+low-magnitude+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains.</a> Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).</li>
<li>Duncan, R. L., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+the+functional+response+of+bone+to+mechanical+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain.</a> Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Kemik ex vivo kültür yöntemleri, kemik büyümesi28biyolojisi değerlendirmek için bir süre kullanılmıştır, ancak nadiren murine uzun kemikler uygulanmıştır. Görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi ile ex vivo kemik kültürü, in vivo koşullarına yakından benzeyen bir ortamda kemik büyümesini gerçek zamanlı olarak incelemek için cazip bir yol sunar. Bu senaryoda, uzun kemiklerin büyümesini in vivo kendi büyüme karşılaştırılabilir koşulları tanımlamak önemlidir.
Bu çalışmada...

Organ büyümesi, büyüme bozukluklarının görünümünü önlemek için sıkı bir şekilde ayarlanmalıdır ve vücudun farklı bölgelerinde birden fazla hücre tipi, moleküler yol ve Crosstalk düzenlenmesi içerir. Görüntüleme teknikleri, zaman içinde büyüyen bir embriyo içinde meydana gelen değişiklikleri ele almak için esastır, hem normal koşullarda, hem de bir pertürasyon sonra sistemde indüklenir. Yaygın olarak kullanılan kemirgen modelleri gibi intrauterin gelişimi ile embriyolar, ex vivo kültür tekniklerini kullanarak kısmen üstesinden gelebilmek için canlı görüntüleme ve ilaç tedavisi için ek bir zorluk sunar. İn vivo süreçlerin başarıyla reapitasyon ve anlamlı sonuçlar elde etmek için, her organ veya doku için doğru kültür koşullarını bulmak için çok önemli olur.
Memelinin iskelet çoğu kemikleri endokondral ossifikasyon ile büyür, burada embriyonik kıkırdak (kondrositler denilen hücrelerden oluşan) uzunlamasına büyüme sürücü ve kademeli olarak kemik değiştirilir. Bu süreç, üç bölge ayırt edilebilir uzun kemikler, sonunda bulunan büyüme plakaları, olur: dinlenme, proliferatif ve hipertrofik1,2. İlk olarak, dinlenme bölgesinde yuvarlak progenitör kondositler proliferatif bölgede bisiklet sütunlu kondositler içine geçiş. Farklılaşma bir sonraki aşamasında, bu kondrositler hipertrofik haline gelir ve tip X kollajen salgıcı başlar. Hipertrofik kondrositler ossifikasyon sonraki adımlarını düzenler: Bunlar bağlantı dokusu büyüme faktörü, kemik morfogenetik proteinler ve Hint kirpi gibi anahtar sinyalizasyon moleküllerini salgılaştırır ve matrisin mineralizasyonu doğrudan, işe kemiğin orta kısmına kan damarlarının, ve, apoptozis üzerine, osteoblastlar izin (kemik şekillendirme hücreleri) Primer ossifikasyon merkezi oluşturmak için matris istila etmek3,4. Mineralize matris, Osteoblastların bir kemik matrisiyle bu bozulmuş kıkırdak yerine göç ettiği kan damarlarının nüfuz etmesini kolaylaştırır5. Çoğu osteoblastlar perikhondrium kıkırdak matris istila, kıkırdak sarar fibröz bir tabaka6. Alternatif olarak, hipertrofik kondrositlerin bir oranı, osteoblastlar7,8,9' a karşı hayatta kalabilecektir. Kemiğin son uzunluğu, büyüme oranı hipertrofik kondrositlerin sayısına ve boyutuna ve matris üretimini10' a bağlı olan geçici kıkırdak birikiminin kaynaklanmaktadır. Ayrıca, son hipertrofisi aşamasının süresinin, kemik11' in son uzunluğu ile ilişkili olduğu son zamanlarda gösterildi. Bu nedenle, uygun kemik boyutunu sağlamak için bu hücrelerin proliferasyonu ve farklılaşma sıkı düzenleme gereklidir.
Büyüme plakalarının örgütlenmesi ve geliştirilmesi konusunda yıl içinde elde edilen önemli bilgiye rağmen, bu sonuçların çoğu sabit histolojik bölümlerin gözlemlenmesi üzerine kuruludur. Doku bölümleme bu süreç hakkında değerli bilgiler sağlar, ancak teknik eserler ile basılabilir, bu nedenle her zaman güvenilir farklı aşamaları arasında morfolojik veya boyutu değişiklikleri tahmin etmek için kullanılamaz. Ayrıca, kemik büyümesi dinamik bir süreçtir, statik iki boyutlu (2D) görüntüler büyüme plakasında hücrelerin hareketi içine sınırlı bir anlayış sunar, canlı doku zaman atlamalı görüntüleme davranışı hakkında değerli bilgiler sunabilir iken kondrocytes büyüme plakası.
Tüm bu sınırlamalar ex vivo kemik kültürlerini kullanarak potansiyel olarak çözülebilir. Kemik kültürü protokolleri bir süre önce geliştirilirken, duvar uzun kemiklere sınırsız olarak uygulanmıştır. Çalışmaların çoğu Chick modeli12,13tarafından sunulan teknik avantajları nedeniyle civciv kemikleri kullanın. Organotypic kültürler (hava/sıvı arayüz), 10 gün14için kültürde tutulan Chick embriyonik femurs, uygulandı. Mouse 'ta bulunan sofistike genetik araçlar bu modeli ex vivo kemik kültüründe kullanılmak üzere çok cazip hale getirmek. Fareler kemik büyümesi bakmak için kullanılan çalışmalar Metatarsal kemikler ile çoğunlukla çalıştı15, muhtemelen küçük boyutu ve daha büyük sayılar embriyo başına elde nedeniyle16. Geleneksel olarak uzun kemikler olarak kabul rağmen, metatarsi (azalan proliferasyon ve büyüme plakası17) daha önce diğer uzun kemikler içinde vivo ile karakterize ve bu nedenle sürekli büyüme ex vivo değil, yaşlanma girin Gerçekten in vivo süreci özetlemek. Bu makalenin amaçları için, proksimal ve ara ekstremite bölgelerden kemikler için uzun kemikler terimi kullanacağız. Birkaç önceki çalışmalar, Tibia gibi uzun murine kemikleri, ex vivo kültürlerde kullanılan ve kıkırdak ama küçük ossifikasyon önemli bir büyüme gözlenen18. Ayrıca son zamanlarda, özellikle kondrosit dinamikleri19çalışma tibial kültürler kullanılır. Diğer çalışmalar genç fareler20 ya da sadece kültür21için femur distal kısmı femoral kafaları kullandı. Bazı daha yeni eserler başarıyla üç boyutlu (3D) kondrocytes filmleri canlı fare dokusu22,23elde etmek için zaman atlamalı görüntüleme ile tam kemik ex vivo kültürü birleştirir. Yazarlar, kemik ex vivo kültürünün potansiyel uygulama iyi bir örnek proliferatif bölge23 kondrositlerin yeniden düzenlenmesi daha önce fark edilmemiş olayları gözlemlemek başardı. Alternatif, yani, statik görüntüleri analiz, dolaylı ve karmaşık teknikler gerektirir. Bu kıkırdak büyüme için transversally odaklı klonlar önemini değerlendirmek son bir çalışma tarafından örneklenmiştir, matematiksel modelleme ile birleştiğinde çok renkli muhabir fare suşları ile genetik izleme kullanıldı24. Bu nedenle, ex vivo kültür daha hızlı ve daha basit bir şekilde dinamik süreçlere anlayış elde etmenize yardımcı olabilir.
Burada, farklı moleküler tedaviler ve/veya zaman aşımı canlı görüntüleme ile kombine edilebilir murine uzun kemikler kültürü için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol15,18,25önceki raporlarda kullanılan yöntemleri uyarlar, ancak bazı ek sorunları giderir ve uzun kemikler gibi Tibia, Metatarsal kemikler yerine odaklanır. Son olarak, farklı maddelerin varlığını ayrı olarak sol ve sağ kemikler kültür tarafından istatistiksel olarak güçlü eşleştirilmiş karşılaştırmalar kullanma potansiyelini araştırıyor.

<table><tbody><tr><td>5-Etinil-2'-deoksiüridin</td><td>Santa Cruz</td><td>CAS 61135-33-9</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2 & prime;-deoksiüridin</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 mm TC ile işlenmiş Merkez Kuyu Organ Kültürü Kabı, 20/Paket, 500/Kutu, Steril</td><td>Falcon</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS4</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>Kapsam için temel ünite</td><td>Zeiss</td><td>435425-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Betagliserofosfat</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Binoküler dürbün</td><td>Zeiss</td><td>STEMI-2000</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA) fraksiyonu v</td><td>Roche/Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DigiRetina 500 kamera</td><td>Aunet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon kiti</td><td>Cumper Robbins</td><td>PFS00034</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 2 mL tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Etanol %96Merk</td><td></td> <td>159010</td><td></td></tr><tr><td>Forseps Dumont#5 Inox08</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>T05811</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150 CO2 inkübatörü</td><td>Thermo Fisher</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Esansiyel Orta Eagle</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24 kuyulu</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plastik pipetler 1 mL Steril Ayrı ayrı sarılmış</td><td>Thermo</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi 0.2 um</td><td>Yaşam Bilimleri</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Terumo şırınga 20 mL</td><td>Terumo</td><td>DVR-5174</td><td></td></tr><tr><td>Tretinoin (retinoik asit)</td> <td>Sigma</td><td>PHR1187-3X</td><td></td></tr><tr><td>Trinoküler kapsam</td><td>Aunet</td><td>AZS400T</td><td></td></tr></tbody></table>

kültür ve ölçme fetal ve yenidoğan murine uzun kemikler

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Uzun kemikler karmaşık ve dinamik yapıları, bir kıkırdak ara yoluyla endokondral ossifikasyon ortaya çıkar. Sağlıklı insan kemiklerine sınırlı erişim, özellikle kemik büyümesi ve homeostasis farklı yönlerini bakmak için, fare ve sıçan gibi memeliler modellerinin kullanımı değerli hale getirir. Ayrıca, fareler içinde sofistike genetik araçların geliştirilmesi uzun kemik büyümesi daha karmaşık çalışmalar sağlar ve kemik büyümesini incelemek için kullanılan tekniklerin bir genişleme ister. Burada, ex vivo murine kemik kültürü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, bu da kemik ve kıkırdak araştırmasına sıkı kontrollü bir şekilde izin verirken, in vivo sürecinin çoğunu yeniden özetleyin. Tarif edilen yöntem, Tibia, femur ve Metatarsal kemikler de dahil olmak üzere bir dizi kemik kültürünü sağlar, ancak burada esas olarak tibial kültüre odaklanıyoruz. Dahası, zaman aşımı canlı görüntüleme veya ilaç tedavisi gibi diğer tekniklerle birlikte kullanılabilir.

Kemik kültürü farklı aşamalardan başlayarak yapılabilir. Şekil 1a-D, kültürlü Tibia ve eşdeğer aşamalarında taze çıkarılan olanlar arasında bir karşılaştırma gösterilir. İlk gözlem, elde edilen iki günlük kültürün, hem kıkırdak hem de mineralize kemik (Şekil 1a, B, D) için in vivo kemik büyümesi ile karşılaştırılabilir olması. Daha uzun kültür dönemleri, kültürlü kemikler ile taze çıkarılan (<str...

Burada, hem fetal hem de yenidoğan aşamalarında uzun duvar kemiklerinin ex vivo kültürü için bir yöntem sunuyoruz, kontrollü koşullarda kemik ve kıkırdak gelişimini ve homeostazisini analiz etmek için uygun ve in vivo sürecini yeniden özetlemekteyiz.

Kültür ve ölçme fetal ve yenidoğan Murine uzun kemikler

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Bu yöntem, metatarsal kültür protokolünü daha büyük kemiklere uyarlayarak, kemik gelişimiile ilgili süreçleri ele almak için doğrudan kemik manipülasyonu ile karmaşık genetik modeller ile birleştirilerek izin verir. Bu teknik, canlı görüntüleme veya doğrudan fiziksel ve farmakolojik manipülasyon gibi in vivo mümkün olmayan kemik büyümesinin manipülasyon ve analizine olanak sağlar. Bu ex vivo kültür yöntemi, tedavinin organizma üzerindeki sistemik etkisinden ayıran kemikteki genetik insetin lokal etkilerinin özel olarak incelenmesini sağlar.Gebe bir gebelik günü 14.5-18.5 fare% 80 etanol ile karın bölgesisterilize ve rahim boynuzları erişmek için cilt ve karın kasları açmak için küçük makas kullanarak başlayın. Karın boşluğundan rahim çıkarmak için, mesometrium kaldırmak ve boynuzları tabanını kesti. Daha sonra rahmi buz üzerinde buz gibi diseksiyon ortamı içeren 60 milimetrelik petri kabına aktarın.Bir biyogüvenlik kabine tek tek fetusları ayırmak için makas ile çuvallar arasında kesilmiş, ve bir diseksiyon stereo mikroskop altında taze diseksiyon ortamı ile yeni bir 60 milimetrelik çanak içine bireysel bir çuval transfer. Fetusları plasentalardan ayırmak ve fetusları membranlardan

culturing-and-measuring-fetal-and-newborn-murine-long-bones

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol, farelerin kurban edilmesini gerektirmeden femur kemik iliğinin (BM) seri örneklemesi için bir prosedürü tanımlar. Bu prosedür, farelerin BM bileşiminin zaman içinde uzunlamasına çalışmalarını kolaylaştırır ve ex vivo ve transplantasyon çalışmaları için BM içindeki hücrelere seri erişim sağlar.

Canlı Farelerde Femoral Kemik İliği Aspirasyon

Burada, laboratuvar faresinden arka bacak uzun kemiklerinin (femurlar ve tibialar) diseksiyonu için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, kemik iliğinin kemik iliği boşluğundan çıkarılması için santrifüjlemeyi kullanan, bu kemiklerden kemik iliği izolasyonu için hızlı bir teknik tarif ediyoruz.

Murin Hind Ekstremite Uzun Kemik Diseksiyon ve Kemik İliği İzolasyonu

Embriyonik gün 15 (E15) murin metatarsal kemiklerini incelemek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz. Endokondral ossifikasyonun bu son derece fizyolojik ex vivo modeli, tek tabaka veya 3D kültürdeki hücrelerden daha in vivo duruma daha yakın koşullar sağlar ve kemik büyümesi ve gelişimini araştırmak için hayati bir araçtır.

Fare Embriyonik metatarsallara Kültürü: endokondral Kemikleşmenin bir Fizyolojik Modeli

Bu el yazması bir iletişim kuralına izole etmek ve kültür Osteoklastlar vitro fare kemik iliği ve rapamycin karmaşık 1 Osteoklast oluşumunda memeli/mekanik hedef rolü çalışmaya açıklar.

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Kemik eksektijinin ex vivo kültürü kemik fizyolojisi ve kemik remodeling ve kemik hastalıklarında ilaçların potansiyel değerlendirilmesi çalışmaları için değerli bir araç olabilir. Sunulan protokol, yeni doğan fare kafataslarından izole edilen calvariaların hazırlanmasını ve kültürünün yanı sıra uygulamalarını da açıklamaktadır.

Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma

Mevcut protokol, bir kantilever bükme kurulumunda murine femoral boyunlar için tekrarlanabilir bir test platformunun geliştirilmesini açıklamaktadır. Femurları optimum hizalamada tutarlı ve sert bir şekilde sabitlemek için özel 3D baskılı kılavuzlar kullanılmıştır.

Murine Femoral Boyunların Kantilever Bükülmesi

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Bu protokol, ergen kemik büyüme plakası yaralanmaları için geliştirilmiş bir fare modelini tanımlar. Büyüme plakasının üç farklı substratı ile ilişkili birincil matrisler olan kollajen tip I, II ve X için üç soylu floresan raportörlere sahip transgenik fareler kullanılarak, yaralanma yerleşimi mikroskop altında doğal floresan tarafından yönlendirilir.

Büyüme Plakası Yaralanmasını İncelemek için Üç Renkli Transgenik Murin Modeli

Murin kemik iliği yaralanması modeli, intramembranöz ossifikasyon yoluyla doğum sonrası osteogenezi incelemek için yararlı bir araçtır. Bu basitleştirilmiş cerrahi protokol, yaralanma sonrası yeni kemik oluşumunun ve hücresel yanıtların aşağı akış değerlendirmesi için kemik iliği ablasyon prosedürünü tanımlar.

Bir Murin Kemik İliği Yaralanması Modelinde İntramembranöz Ossifikasyon Yoluyla Postnatal Osteogenezi İncelemek için Geliştirilmiş Metodoloji

Keşfedin fetal ve yenidoğan murine uzun kemiklerinin ekzojen kültür yöntemini. Bu teknik, kemik gelişimini canlı görüntüleme ve farmakolojik manipülasyon ile kontrollü koşullarda analiz etmenizi sağlar.

Kültür ve ölçme fetal ve yenidoğan Murine uzun kemikler

Daha fazla video keşfet