Name: Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerinde çinko ve iz elementleri grafit fırın atomik absorbans spektroskopisi ile hassas ve düşük maliyetli ölçüm için hücre içi havuzların izolasyonu ve analizi yöntemlerini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Massachusetts Tıp Fakültesi Üniversitesi 'nden öğrenci çeşitliliği akademisyenler Ödülü 'nden tuvalet-B ' d e k i desteklenmektedir. TAN. SEP-CONACYT, Grant 279879 tarafından desteklenmektedir. J. G. N, National Science Foundation Grant DBı 0959476 tarafından desteklenmektedir. Yazarlar onun teknik destek için N2A hücre hattı ve Daniella Cangussu sağlamak için Dr Daryl A. Bosco minnettar.

1. mammalin hücre kültürü
<ol><li>Genel hususlar
	<ol>
<li>Daha önce gözden38memelinin hücre kültürü için aseptik teknikleri izleyin.</li>
		<li>37 °C ' de nemlendirici% 5 CO2 kuluçte tüm hücre çizgilerini koruyun. Hücre kültürü koşulları her hücre türü için farklılık gösterir. Kullanılan her hücre çizgisi için uygun kültür koşullarını korumak önemlidir, bu prosedürlerin varyasyonları anormal fenotürleri ve hücre kültürünün başarısızlığa yol açacaktır.</li>
		<li>İlgi hücre hattı ile tanıdık emin olun ve belirli deneyler için seçilen her hücre türü için sağlanan protokolleri izleyin (aşağıdaki bazı örnekler bakın).</li>
	</ol></li>
	<li>Tripsinizasyon ve yapışıcı hücrelerin geçişini Genel prosedür
	<ol>
<li>Hücre kültürü ortamını kültür plakadan aspirasyon ile çıkarın.</li>
		<li>Hücreleri hafifçe kalsiyum ve magnezyum olmadan PBS kullanarak yıkayın (10 cm2 kültür yüzey alanı başına 5 ml). Hücre monolayer ayırma önlemek için plaka tarafına yıkama çözümü ekleyin; çözüm kapsamını maksimize etmek için plaka girdap. Epitelyal hücreler için, aşağıdaki adımlarla hücrelerin dağılmasını kolaylaştırmak için PBS 'de 37 °C ' de kuluçvörün içinde 10 ila 15 dakika hücreleri inkübe etmek gerekir.</li>
		<li>Yıkama çözümünü aspirasyon ile çıkarın.</li>
		<li>Plaka (10 cm2başına yaklaşık 0,7 ml) için yeterli ayrışma reaktif (0,25% tripsin) ekleyin. Hafifçe girdap hücre monolayer tam kapsama almak için plaka.</li>
		<li>2 ila 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kültürü inküye. Gerçek kuluçş süresi kullanılan hücre hattına göre değişir, epitelyal hücreler durumunda 37 °C ' de kuluçte 10 ila 15 dakika boyunca inkübe edilmesi tavsiye edilir. Hücre dekolmanı için mikroskop altındaki hücrelere dikkat edin.</li>
		<li>Hücrelerin çoğu ayrılmış olduğunda, ön ısıtılmış kaplama veya büyüme orta 5 mL hücre süspansiyon kurtarmak (bazı örnekler için aşağıya bakın). Hücreleri birkaç kez hücre tek tabakalı üzerinde pipetleme tarafından mekanik olarak ayırmak.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL Konik Tüpe aktarın ve 2 ila 5 dakika 1.000 x g 'de santrifüjün. Santrifüjleme hızı ve süresi hücre tipine göre değişir. Hassas aspirasyon ile medya çıkarın, hücre Pelet dokunmak için değil dikkatli olmak. Hücre pelemini 5 ila 10 mL 'Lik uygun ön ısıtılmış büyüme ortamını resuspend ve bir hemokytometer veya otomatik hücre sayacı kullanarak sayma için bir örnek çıkarın.</li>
		<li>Her belirli hücre hattı için önerilen yoğunluğu tohum için hücre süspansiyon uygun hacminin yararlanın (bazı örnekler için aşağıya bakın). Kültür çanak boyutuna göre Kültür medya yeterli hacim ile ek ve geri kuluçla hücreleri yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Fare uydu hücrelerinden türetilen primer myoblastlar
	<ol>
<li>Başlamadan önce, primer myoblast büyümesi için kollajen kaplı plakalar hazırlayın. Deiyonize suda% 0,02 kollajen ve 0,05 M asetik asit içeren bir çözüm, 0,22 μm steril filtre cihazı ile filtrasyon ile sterilize edilmelidir. 37 °C ' de bir gecede kollajen çözeltisi ile kültür plakalarını kulyın.</li>
		<li>Ertesi gün, kollajen çözeltisi Aspire, steril kabine kuru hava plakaları izin ve depolama 4 °c kullanım kadar. Not: en az miktarda kollajen şunlardır: 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.</li>
		<li>Tohum primer myoblastlar 1 x 104 hücreli/cm2 ' de 55 cm2 kollajen kaplı kültür plakaları. Proliferasyon medya Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM)/ham 's F12 besin karışımı Kültür medya içeren 20% fetal Sığır serum (FBS), 25 ng/mL rekombinant temel fibroblastik büyüme faktörü (FGF), ve 100 U/mL penisilin/streptomisin. Not: proliferating ve stok hücreleri% 50 altında tutarsızlık tutulmalıdır. Hücre teması, hücrelerin miyojenik farklılaşması için taahhüt eder ve kültürün büyüme yeteneklerini bozar.</li>
		<li>Primer myoblastlar ayırt etmek için, hücrelerin% 80 ulaşmak için izin 100% konfluency, normal olarak oluşur sonra 48 h kaplama. Sonra, farklılaşma medyasını değiştirin (DMEM,% 2 at serumu, 1% insülin, transferrin, selenyum A Supplement, ve 100 U/mL penisilin/streptomisin). Hasat kadar günlük medya yenileyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Murine Nöroblastom (N2A)
	<ol>
<li>Plaka N2A hücreleri 2 x 104 hücreler/cm2 büyüme medyasında, düşük serum orta/dmem yüksek glikoz ve L-glutamin içeren bir karışımı içeren (1:1, v:v), ek 10% FBS ve 100 U/ml penisilin/streptomisin. 50% konfluency altında hisse senedi kültürünü koruyun.</li>
		<li>N2A hücrelerin farklılaşması,% 25 ' e% 40 ' a ulaştı. Azalan serum orta/DMEM,% 1 FBS ve 20 μM retinoik asitle 7 ila 10 gün arasında bir karışım içeren farklılaşma medyasını değiştirin. Hücre hasat kadar her gün medya yenileyin. Not: N2A hücreleri ayırt gibi, bazı hücreler yuvarlak, kolayca ayırın ve Apoptozis çıkabilir. Ne zaman duman çekiş ve plaka Kültür medya ekleyerek dikkatli olun.</li>
	</ol></li>
	<li>3T3 L1 murine ön adipocytes
	<ol>
<li>Yüksek glikoz ile DMEM fare 3T3/L1 hücreleri korumak, 10% FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ile tamamlayıcı. Adipojenik süreç hücrelerin konfluence bağlıdır; Bu nedenle, stok kültürünün% 50 ' den fazla konfluency üzerinde büyümesine izin vermeyin, daha yüksek konfluence hücrelerin ayırt etmek için yeteneğini zarar verecektir.</li>
		<li>Hücreleri 2 x 104 hücreli/cm2' de plaka. Bu yoğunlukta, hücreler 3 gün içinde konfluence ulaşacaktır.</li>
		<li>Hücrelerin% 100 konflukans ulaştıktan sonra iki gün Adipojenik farklılaşma neden. İndüksiyon medyası,% 10 FBS, 10 μg/mL insülin, 0,5 mM 3-İzobutil-1-methyxanthine, 1 μM dexametazon ve 10 μM troglitazon içeren DMEM 'den oluşur.</li>
		<li>% 10 FBS ve 5 μg/mL insülin içeren DMEM 'den sonra 48 h inkübasyon yaptıktan sonra indüksiyon medyasını değiştirin. Her gün hasat kadar medyayı yenileyin. Tam farklılaşma temsili örnekleri genellikle Adipojenik indüksiyon sonrası 7 ile 10 gün arasında toplanır. Not: Adipogenesis ilerledikçe, hücreler yuvarlak hale gelir ve kolayca ayırmak eğilimindedir. Ne zaman duman çekiş ve plaka Kültür medya ekleyerek dikkatli olun.</li>
	</ol></li>
	<li>MCF10A hücreler
	<ol>
<li>Plaka MCF10A hücreler DMEM/F12 (1:1, v:v), ile tamamlayıcı 5% FBS, 100 U/mL penisilin/streptomisin, 0,5 μg/mL hidrokortizon, 10 μg/mL insülin, ve 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF). Önerilen tohumlama yoğunluğu 1 x 105 hücreli/cm2' dir. Bu koşullar altında, hücreler 4 gün içinde% 100 konflukans ulaşacaktır. Ortam her 2 ile 3 gün hasat kadar yenileyin. Not: MCF10A hücreleri ayırmak zordur. 37 °C ' de, tripsinizasyon öncesinde 0,5 mM EDTA ile kalsiyum içermeyen PBS 'de 10 ila 15 dk 'lik hücrelerin inküyasyonu önerilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Madin-Darby köpek böbrek hücreleri (mdck)
	<ol>
<li>Plaka MDCK hücreleri DMEM ile tamamlayıcı 10% FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin. Önerilen tohumlama yoğunluğu 1 x 105 hücreler/cm2, hücreler 3 gün içinde% 100 konfluency ulaşacaktır. Hasat kadar her 2 günde bir medya yenileyin. Not: MDCK hücreleri ayırmak zordur. Tripsinizasyon öncesi kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS 'de 37 °C ' de 5 ila 10 dk. arasında hücrelerin inküyasyonu önerilir. Hücre ayrışma önlemek için hücreleri ayırmak için beklerken Flask vurmak veya sallayarak plakaları karıştırmayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. aas için mammalian hücre kültürü örnek hazırlama: tüm hücre ve hücre altı fraksiyonlama
<ol><li>Kültür 55 cm2 plaka ilgi hücreleri. Küçük kültür plakaları kullanımı GF-AAS algılama sınırları altında metaller seviyeleri ile numune verebilir.</li>
	<li>Tüm hücre ekstresi<ol>
<li>Bir vakum tuzağı kullanarak kültür medyasını aspirate. Tüm medya izlerini kaldırtığınızdan emin olun. Hücreleri istenilen zaman noktalarıyla veya kültür koşullarından üç kez, buz-soğuk PBS kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir şekilde durulayın.</li>
		<li>Hemen 1 mL PBS kalsiyum ve magnezyum ücretsiz yeni bir plastik hücre kazıyıcı kullanarak plaka hücreleri kazıyın. Numuneyi 1,5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 2.000 x g 'de 2 dakika santrifüjün ve süpernatant Aspire. Protokol burada duraklatılmış olabilir. Pelet örneklerini-20 °C ' de saklayın veya 2,4 adıma geçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Subcellular fraksiyonlama<ol>
<li>Bir vakum tuzağı kullanarak kültür medyasını aspirate. Tüm medya izlerini kaldırtığınızdan emin olun. Hücreleri istenilen zaman noktalarıyla veya kültür koşullarından üç kez, buz-soğuk PBS kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir şekilde durulayın. 1 mL buz-soğuk PBS kalsiyum ve magnezyum ile plaka kapalı hücreleri scrape.</li>
		<li>Numuneleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buzun üzerine tutun. 10.000 x g'de 10 s için santrifüjler. Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlar Metal Analizi istenirse çekirdeklerin hızlı yalıtım devam edin. Bu prosedür, hücre ekstraksiyon39, 40nedeniyle metaller olası kaybını en aza indirir.</li>
		<li>Aspirasyon ile süpernatant çıkarın ve 400 μL buz-soğuk PBS kalsiyum ve magnezyum ücretsiz, 0,1% nonidet P-40 (NP-40), olmayan bir iyonik deterjan içeren hücre Pelet pelletini. Transfer 100 μL yeni bir mikrosantrifüjte tüp ve tüm hücre örneği olarak düşünün. Bu kısım numunenin% 25 'ini temsil eder.</li>
		<li>Bir P1000 micropipet ucu ile buz üzerinde 5 ila 10 kez hücre süspansiyonu pipetleme çekirdekleri izole. Epitelyal hücrelerin çekirdekleri yalıtımı% 0,5 NP-40 konsantrasyonu gerektirir. Bir 30 1/2 g iğne ile 10 ila 15 pasajlar takip 10 ila 15 kez, bir 26 3/4 G iğne üzerinden hücre süspansiyonu geçirerek hücre ayrışma elde. Not: 40X hedefi kullanarak ışık mikroskobu ile nükleinin bütünlüğünü doğrulayın.</li>
		<li>Kalan hücre lysate süspansiyonunu (300 μL) 10.000 x g'de 10 s için santrifüjler. Süpernatant sitosolik fraksiyonu içerecektir. 300 μL 'i yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
		<li>500 μL PBS 'de nükleer fraksiyonu içeren pelet kalsiyum ve magnezyum içermeyen,% 0,1 NP-40 içeren, daha sonra 10 s için% 10.000 x gsantrifüjte durulayın. Süpernatant kaldırmak ve aynı çözeltinin 100 μL içinde çekirdekleri içeren pelet pelletini. Not: protokol burada duraklatılmış olabilir. Örnekler-20 °C ' de depolanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Üç sonication döngüleri (30 s/30 s kapalı, 50 kHz, 200 W) ile hücreleri Lyse 5 dk. Bradford41tarafından örnekteki toplam protein içeriğini ölçmek.</li>
	<li>Nükleer (Histonlar, kromatin remodelers, nükleer matris proteinleri) veya sitosolik fraksiyonları (β-tubulin, β-akin) için spesifik antikorları kullanarak Batı leke tarafından fraksiyonları saflığının kalite kontrolünü gerçekleştirin (Şekil 2). Not: sonicators metal ucu ile kullanmayın. Bu numuneyi metallerle kirletebilir.</li>
</ol>3. atom emici spektroskopisi ile memelinin hücre kültürlerinin tüm hücre ve hücreler fraksiyonları Zn içerik analizi
<ol><li>80 °C ' de 1 saat, daha sonra 20 °C ' de gece için konsantre HNO3 iz metal notu (dikkat) eşit hacimli kullanarak asit sindirimi ile hücre kültürü örneklerini (tüm hücre veya nükleer fraksiyonları) mineralize.</li>
	<li>H2O 2 reaksiyon hacminin% 30 ' unu ekleyerek reaksiyonu durdurun. Örnek hacmi 18 MΩ arıtılmış suyla 500 μL 'ye getirin. Not: HNO3 elleçleme, kimyasal güvenlik gözlükleri, sıçrama koruması için bir yüz kalkanı, eldiven ve yeterli havalandırma (duman başlığı) kullanılmadığı takdirde onaylı bir buhar solunum cihazı giymelidir. Protokol burada duraklatılmış olabilir. Örnekler oda sıcaklığında (RT) saklanabilir.</li>
	<li>Grafit fırını ile donatılmış AAS tarafından Zn ölçümleri için standart çözümler ve deneysel örnekler hazırlayın.<ol>
<li>Deiyonize suda% 2 (v/v) HNO3 çözeltisi kullanın, standart eğri için kullanılan aynı toplu işlem boyunca kalibrasyon için boş bir çözüm olarak geliyor. 18 MΩ arıtılmış suda seyreltilmiş analitik sınıf standartlarını kullanın.</li>
		<li>% 2 (v/v) HNO3 çözeltisi ile ticari olarak kullanılabilir bir 1.000 ppm Zn stok çözeltisi içinde Zn 1.000 PPB bir standart hazırlayın deiyonize suda çözüm. 100 PPB standardından çalışma standart çözümlerini 5, 8, 10, 15, 20 ve 25 PPB 'ye doğrudan deiyonize suda% 2 (v/v) HNO3 çözeltisi ile seyreltilerek hazırlayın. Zn standartlarını ve boşluğu% 0,1 (1 g/L) mg (NO3)2 matris değiştirici ile hazırlayın. Not: Zn LOD 0,01 PPB (μg/L) ' dir. Standartların konsantrasyonunu artırarak Zn 'ın doğrusallık limiti 20 PPB olarak belirlendi (Şekil 3).</li>
		<li>Aynı optimum koşullarda standart ve numuneleri ölçün: 250 mL/dak, enjeksiyon sıcaklığı 20 °C ve GF Sıcaklığı 1.800 °C ' nin giriş debisi. Not: GF Sıcaklığı, yeni bir numune veya standart enjeksiyonu öncesinde, temizleme adımları için 2450 °C ' ye yükseltilmiştir.</li>
		<li>Lamba (C-HCL) ' nin geçerli bir 20 A, dalga boyu 213,9 Nm ve 0,7 Nm yarık optimize edin.</li>
		<li>Metal içeriğini belirlemek için Zn standart eğrisini kullanarak mineralize numuneleri ölçün. Küçük hacimler ölçüldüğünde, ölçümler uzun süre alırsa numuneler Buharlık yapabilir. Bu nedenle, örneklere su eklemek için tavsiye edilir. Elde edilen veriler LOD 'in ötesinde ise% 0,01 HNO3 (analitik sınıf) ile tedavi edilen 18 MΩ arıtılmış su ile numuneleri seyreltin. Not: genellikle, numuneler 500 μL, standart eğri kurulduktan sonra doğru ölçülecek AAS otomatik otomatik örnekleyici yerleştirilen bir hacmine seyreltilir. Gerekli hacim Kullanıcı tarafından belirlenmeli ve konsantrasyonların son hesaplamaları dikkate almanız gerekir. Bir girişimde tam bir deney AAS tarafından Zn belirlemeler bitirme önerilir. Ölçümleri duraklatma büyük deneysel varyasyonlar ve tutarsızlıkları neden olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PPB ölçümlerini, AAS ile ölçülen Zn 'den elde edilen molarite dönüştürün. Zn (65,39 amu) kütlesini düşünün. 63.390.000 tarafından AAS tarafından elde edilen PPB miktarını Böl. Hücrelerde, Zn konsantrasyonları pmol birimlerinden μmol 'e kadar değişir.<ol>
<li>Bradford tarafından belirlenen örnekteki ilk protein kütlesi ile Zn (pmol veya μmol) konsantrasyonunu bölün (adım 2,4). Bu hesaplama, numunenin mg protein başına yer alan metal miktarını (pmol veya μmol Zn) işleme alacak. Not: metal belirlemeler sırasında kullanılan seyreltme faktörlerini dikkate almak önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Atomik emilme spektroskopisi, küçük hacimli/kütle biyolojik örneklerinde Zn ölçümü için son derece hassas bir yöntemdir. Zn ölçümünün tanımlanan optimizasyonu bu yöntemin uygulanması basit hale getirir ve ideal analitik koşulları garanti eder. Burada, GF-AAS ' ı kullanarak, tüm hücrelerde Zn konsantrasyonunu, farklı hücre hatlarından siterik ve nükleer fraksiyonları tespit ettik. Sonuçlar, bu tekniğin floresan problar ve ıCP-MS ile elde edilenlere karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Örneğin, çeşitli floresan pro...

Zn, cu, MN ve Fe gibi geçiş ve ağır metaller, gıda ve kirleticilerin her iki besinindeki ortamda doğal olarak bulunur. Tüm yaşayan organizmalar bu mikroutrients farklı miktarlarda gerektirir; Ancak, yüksek seviyelere maruz organizmalar için zararlı. Metal edinme ağırlıklı olarak diyet yoluyla, ancak metaller de solunabilir veya cilt üzerinden absorbe edilebilir1,2,3,4,5. Atmosferik partiküllerde metaller varlığının arttığını ve sağlık riskleriyle büyük ölçüde ilişkili olduğunu dikkate almak önemlidir. Antropojenik faaliyetler nedeniyle, AG, as, CD, CR, HG, ni, Fe ve PB gibi ağır metaller seviyeleri atmosferik partikül madde, yağmur suyu ve toprak6,7' de tespit edilmiştir. Bu metaller, özellikle Zn ve Fe, temel fizyolojik iz elemanları ile rekabet potansiyeline sahip ve Biyolojik süreçler için temel enzimleri devre dışı bırakarak toksik etkileri teşvik.
İz öğesi Zn redoks Neutral ve biyolojik reaksiyonlar bir Lewis asit olarak davranır, bu da protein katlama ve katalitik aktivite için gerekli olan temel bir kofaktör meme proteinlerinin% 10 ' dan fazla8,9, 10; Sonuç olarak, çeşitli fizyolojik fonksiyonlar için esastır8,11. Ancak, birçok iz elemanları gibi, bu metaller normal fizyolojik fonksiyon kolaylaştırarak ve toksisite neden arasında hassas bir denge vardır. Memelilerde, Zn eksiklikleri anemiye yol açar, büyüme geriliği, hipogonadizm, cilt anomalileri, ishal, alopesi, tat bozuklukları, kronik inflamasyon, ve bağışıklık ve nörolojik fonksiyonları özürlü11,12, 13,14,15,16,17,18. Aşırı olarak, Zn sitotoksisdir ve bakır gibi diğer temel metallerin emilimini bozar19,20,21.
Ayrıca, cu ve Fe gibi bazı metaller zararlı reaksiyonlara katılma potansiyeline sahiptir. Fenton kimya ile reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi, demir sülfür kümesi proteinlerinin montajına müdahale edebilir ve lipid metabolizmasını değiştirebilir22,23,24. Bu hasarı önlemek için, hücreler toksik etkileri önlemek için metal bağlayıcı şaperonlar ve taşıyıcılar kullanır. Kuşkusuz, metal homeostaz sıkıca belirli hücre türlerinin metaller uygun düzeylerde korumak sağlamak için kontrol edilmelidir. Bu nedenle, biyolojik numunelerde iz metallerin doğru ölçümü için teknikleri ilerletmek için önemli bir ihtiyaç vardır. Gelişmekte olan ve olgun organizmalarda, hücresel düzeyde, farklı gelişimsel aşamalarda ve normal ve patolojik koşullarda iz elemanları için diferansiyel biyolojik ihtiyaç var. Bu nedenle, organizmal metal homeostazisini anlamak için doku ve sistemik metal düzeylerinin kesin belirlenmesi gereklidir.
Grafit fırını atomik emilim spektrometresi (GF-AAS), küçük numune hacimleri için kullanılan, biyolojik ve çevresel örneklerde mevcut geçiş ve ağır metaller ölçmek için ideal hale getirmek için son derece hassas bir tekniktir25,26 , 27 , 28. dahası, tekniğin yüksek hassasiyetinden dolayı, Xenopus kullanarak na+/k+-ATPase ve gastrik H+/y+-ATPase ' i n ince taşıma özelliklerini incelemek için uygun olduğu gösterilmiştir. bir model sistemi olarak oosit29. GF-AAS, bir örnek içinde atomized elemanlar bir ışık kaynağı ile ilgi metal içeren yayılan radyasyon dalga boyu absorbe, elemanın konsantrasyonuna orantılı absorbe radyasyon ile. Elemental elektronik uyarma her kimyasal eleman için benzersiz bir quantized sürecinde ultraviyole veya görünür radyasyon emilimi üzerine gerçekleşir. Tek bir elektron sürecinde, bir foton emilimi atom içinde daha yüksek seviyeye daha düşük bir enerji seviyesinde hareket eden bir elektron içerir ve GF-AAS radyasyon emici sayısı ile orantılı örnek tarafından emilen fotonların miktarını belirler elementleri grafit tüpünde atomize edilir.
Bu tekniğin seçicilik atomların elektronik yapısına dayanır, hangi her eleman belirli bir emilim/emisyon spektral hattı vardır. Zn durumunda, emici dalga boyu 213,9 Nm ve tam olarak diğer metallerden ayırt edilebilir. Genel olarak, GF-AAS, Zn 'ı yeterli tespit sınırı (LOD) ve yüksek hassasiyet ve seçicilik25ile ölçmek için kullanılabilir. Emilen dalga boyu değişiklikler entegre ve belirli ve izole dalga boylarında enerji emme doruklarına olarak sunulmaktadır. Belirli bir örnekteki Zn konsantrasyonu genellikle, emici, numunenin Zn konsantrasyonu ile doğrudan orantılı olduğu Beer-Lambert kanununa göre bilinen konsantrasyonların standart bir eğrisinden hesaplanır. Ancak, GF-AAS analizlerine Beer-Lambert denklemi uygulanması da bazı komplikasyonlar sunar. Örneğin, numunelerin atomizasyon ve/veya homojen olmayan konsantrasyonlarındaki varyasyonlar metal ölçümlerini etkileyebilmektedir.
GF AAS iz Elemental analizi için gerekli metal atomizasyon üç temel adımlardan oluşur. İlk adım, sıvı çözücünün buharlaşma olduğu desolvasyon; Fırından sonra kuru bileşikler bırakarak yaklaşık 100 °C sıcaklığa ulaşır. Sonra, bileşikler 800 den 1.400 °C (analiz edilecek öğeye bağlı olarak) onları ısıtarak buharlaştırılmış ve bir gaz haline gelir. Son olarak, gaz durumundaki bileşikler 1.500 ila 2.500 °C arasında bulunan sıcaklıklarda atomize edilir. Yukarıda da anlatıldığı gibi, bir metal konsantrasyonunun artması GF-AAS tarafından algılanan emilim üzerinde orantılı artışlar oluşturacaktır, ancak fırın, mümkün olan konsantrasyonların çalışma aralığı olan dinamik analiz aralığını azaltır cihaz tarafından belirlenir. Böylece, teknik düşük konsantrasyonları ve LOD ve bira-Lambert Kanununun doğrusallık (LOL) sınırını belirleyerek yöntemin dinamik aralığının dikkatli bir şekilde belirlenmesi gerektirir. LOD, bir maddenin tespit edilmesi için gereken asgari miktardır, matrisin Zn standart sapması üç kez tanımlanır. LOL Beer-Lambert Kanunu kullanılarak tespit edilebilir maksimum konsantrasyon.
Bu çalışmanın içinde, tüm hücre özleri, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlar içinde Zn seviyelerini analiz etmek ve kültürlü hücrelerde proliferasyon ve ayrım yapmak için standart bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1). Numune hazırlama sırasında metal kaybını önlemek için farklı hücresel sistemlere çekirdekler protokolünün hızlı izolasyonu uyarlanmıştır. Kullanılan hücresel modeller, fare uydu hücrelerinden elde edilen primer myoblastlar, murine Nöroblastom hücreleri (N2A veya Neuro2A), murine 3T3 L1 adipocytes, insan olmayan-tumorigenic meme epitelyal hücre hattı (MCF10A) ve epitelyal madin-Darby köpek böbrek ( MDCK) hücreleri. Bu hücreler farklı sırlardan kurulmuştur ve in vitrometal düzeylerinin erit spesifik varyasyonlarını araştırmak için iyi modellerdir.
Fare uydu hücrelerinden elde edilen primer myoblastlar, iskelet kası farklılaşmasını araştırmak için iyi uygun bir in vitro modeli oluşturmaktadır. Yüksek serum koşullarında kültürlü olduğunda bu hücrelerin proliferasyonu hızlıdır. Kas Kemine farklılaşma daha sonra düşük serum koşulları tarafından indüklenir30. Murine Nöroblastom (N2A) kurulan hücre hattı fare nöral arması türetilmiştir. Bu hücreler nöronal ve Kökbacaklılar kök hücre morfolojisi mevcut. Farklılaşma uyarıcı üzerine, N2A hücreleri neurons gibi nöronların çeşitli özellikleri mevcut, neurofilaments. N2A hücreler Alzheimer hastalığı araştırmak için kullanılır, nörit büyüme, ve nörotoksisite31,32,33. 3T3-L1 murine ön adipocytes kurulan hücre hattı genellikle Adipogenesis ile ilişkili metabolik ve fizyolojik değişiklikleri araştırmak için kullanılır. Bu hücreler fibroblast benzeri bir morfoloji sunar, ancak bir kez farklılaşma için uyarılır, onlar lipid sentezi ve trigliserid birikimi ile ilişkili enzimatik aktivasyon mevcut. Bu sitoplazmik lipid damlacıkları34,35üretmek için morfolojik değişiklikler olarak gözlemlenebilir. MCF10A, meme fibrokistik hastalığı36olan premenopozal bir kadından elde edilen tümör olmayan bir meme epitelyal hücre çizgisinin. Proliferasyon, hücre göçü ve istilası gibi meme Karsinogenezi ile ilgili biyokimyasal, moleküler ve hücresel çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Madin-Darby köpek böbreği (MDCK) epitelyal hücre hattı, epitelyal fenotipin kurulması ile ilgili özellikleri ve moleküler olayları araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Konfluence ulaştıktan sonra, bu hücreler polarize olur ve hücre-hücre yapışmaları, mammalin epitelyal dokularının özellikleri37.
Memeli hücrelerinde Zn seviyelerini ölçmek için AAS yeteneğini test etmek için, bu beş hücre hatlarının tüm ve hücre altı fraksiyonları (sitersol ve çekirdeği) analiz ettik. AAS ölçümleri bu hücre tiplerinde Zn farklı konsantrasyonları gösterdi. Konsantrasyonlarda primer myoblastlar proliferasyon ve farklılaşıyor (4 ila 7 nmol/mg protein) ve dört kurulan hücre hatları (20 ile 40 nmol/mg protein arasında değişen) daha yüksek. Primer myoblastlar ve nörblastoma hücrelerinde proliferasyon hücreleriyle karşılaştırıldığında, Zn düzeylerinde önemli olmayan küçük bir artış tespit edildi. Farklılaşmış adipanositlerde zıt etki tespit edildi. Ancak, proliferasyon 3T3-L1 hücreleri farklılaşmış hücrelere kıyasla metal yüksek konsantrasyonları sergiledi. Daha da önemlisi, bu üç hücreli çizgide, hücre içi fraksiyonlama, Zn 'ın bu hücrelerin metabolik durumuna göre sitersol ve çekirdeğin farklılaşması olduğunu göstermiştir. Örneğin, proliferasyon myoblastlar, N2A hücreler ve 3T3-L1 öncesi adipocytes, metal çoğunluğu çekirdeğe lokalizedir. Belirli hücre tedavileri kullanılarak farklılaşma indüksiyon üzerine, Zn bu üç hücre türlerinde sitüsol lokalize. İlginçtir ki, her iki epitelyal hücre hatları, bir karakteristik sıkı Tek tabakalı oluşmuş olan konfluence ulaştığında karşılaştırıldığında proliferasyon sırasında Zn daha yüksek düzeylerde gösterdi. Proliferasyon epitelyal hücrelerde, meme hücre hattı MCF10A Siton ve çekirdek arasında eşit Zn dağılımı vardı, böbrek kaynaklı hücre hattında iken, metal çoğu çekirdeğinde yer aldı. Bu iki hücre tipinde, hücreler konfluence ulaşıldığında, Zn ağırlıklı olarak siterona yer verildi. Bu sonuçlar GF-AAS düşük verim örneklerinde Elemental analiz yapmak için son derece hassas ve doğru bir teknik olduğunu göstermektedir. GF-AAS hücre altı fraksiyonlama ile birleştiğinde ve farklı hücre hatları ve dokularda iz metal öğelerin düzeylerini araştırmak için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>3-izobütil-1-metilksantin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1005706</td><td></td></tr><tr><td>Anti Brg1-antikor (G7)</td> <td>Santa Cruz biyoteknolojileri</td><td>sc-17796</td><td></td></tr><tr><td>Anti b-tubulin-antikor (BT7R)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>MA5-16308</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>Biorad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı/Besin Karışımı (DMEM/F12)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (DPBS)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Epidemal Büyüme Faktörü (EGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastik Büyüme Faktörü-Bazik (FGF) (AA 10-155)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>At serumu</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit (H2O2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95321</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin-Transferrin-Selenyum-A</td><td>ThermoFischer</td><td>51300044</td><td></td></tr><tr><td>Nitrik Asit (HNO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85125</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM (Azaltılmış Serum Ortamı)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>PureCol (Kolajen)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>Retiyonik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1187</td><td></td></tr><tr><td>Troglitazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>648469-M</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,25), fenol kırmızısı</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Çinko (Zn) Saf Tek Elementli Standart, 1.000 & g/mL, %2 HNO3</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300168</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>kurulu hücre hatları</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T3-L1</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CL-173</td><td></td></tr><tr><td>MCDK</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CRL-10317</td><td></td></tr><tr><td>N2A</td><td>Amerikan Tip: Kültür Koleksiyonu</td><td>CCL-131</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Atomik Absorpsiyon spektrofotometresi</td><td>PerkinElmer</td><td>Aanalyst 800</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagnode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr></tbody></table>

mammalin hücrelerinde hücre içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Geçiş metaller organizmalar için temel mikroutrients ancak proteinlerde fizyolojik metaller ile rekabet ve redoks stres üreten yüksek konsantrasyonlarda hücrelere toksik olabilir. Metal tükenmesi veya birikimine yol açabilen patolojik koşullar farklı insan hastalıklarının nedensel ajanlarıdır. Anemi, akrodermatit Enteropathica ve Wilson ve Menkes hastalıklarına örnekler dahildir. Bu nedenle, bu öğelerin normal fizyolojik işlevlere nasıl katkı sağlayacağını araştırmayı kolaylaştırmak için yüksek hassasiyet ve doğruluk ile biyolojik örneklerde geçiş metallerinin düzeylerini ve taşınması ölçmek mümkün olması önemlidir ve Toksisite. Çinko (Zn), örneğin, birçok memelinin proteinleri bir kofaktör, sinyalizasyon olaylara katılır ve hücrelerde ikincil bir haberci olduğunu. Fazlalığında, Zn toksik ve diğer metallerin emilimini inhibe edebilir, açık iken, potansiyel olarak ölümcül koşullara çeşitli yol açabilir.

Grafit fırını atomik emilim spektroskopisi (GF-AAS), çeşitli biyolojik örneklerde Zn ve diğer geçiş metal konsantrasyonlarını belirlemek için son derece hassas ve etkili bir yöntem sağlar. GF-AAS aracılığıyla elektrotermal atomizasyon, ilgi unsurunun uyarılma dalga boyu kullanarak sonraki seçici emme analizi için numunelerin küçük hacimleri parçalamalı ile metaller nicelik. Beer-Lambert Kanunu doğrusallık sınırları içinde, metal tarafından ışık emici doğrudan analit konsantrasyonu ile orantılıdır. Zn içeriğinin belirlenmesi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, GF-AAS hem ücretsiz hem de kompleks Zn proteinlerinde ve muhtemelen küçük numune hacimlerinde yüksek hassasiyetle küçük hücre içi moleküllerde algılanır. Ayrıca GF-AAS, İndüktif olarak bağlı plazma kitle spektrometresi (ıCP-MS) veya Synchrotron tabanlı X-ışını floresans ile daha kolay erişilebilir durumdadır. Bu yöntemle, GF-AAS ' l a analiz için farklı kültürlü hücre hatlarının sistematik numune hazırlanması açıklanmıştır. Bu iz elemanının varyasyonları, hem tam hücre endoglikozidazları hem de Proliferasyona ve farklılaşan hücrelerin alt hücreli fraksiyonları ilkesinin kanıtı olarak karşılaştırıldı.

GF-AAS ' ı ı, memelinin hücrelerinde Zn dakika seviyelerini algılamak için test ettik (Şekil 1). Böylece, fare uydu hücrelerinden elde edilen primer myoblastlar ve kurulan hücre hatları N2A (Nöroblastom türetilmiştir), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (meme epiteli) ve MDCK hücreleri (köpek böbrek epiteli) kültürüne sahibiz. İlk olarak, tüm bu hücre türlerinin tüm hücresini, sitosolik ve nükleer fraksiyonları izole ettik ve Batı leke tarafından fraksiyonları saflı...

Kültürlü primer veya kurulan hücre hatları yaygın hayvan modelleri kullanmadan önce bir ilk yaklaşım olarak temel biyolojik ve mekanik soruları ele almak için kullanılır. Bu protokol, çinko (Zn) ve Atom emici spektroskopisi ile diğer iz elemanlarının çalışmaları için tüm hücre özler ve hücre altı fraksiyonları hazırlamak açıklamaktadır.

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Geçiş metallerinin memeli gelişimindeki rolü büyük ölçüde küçümsenmemelidir. Ortaya çıkan kanıtlar metal homeostazın hücre ve dokuların gelişim evresine göre değişmeye devam ettiğini göstermektedir. Ayrıca, metallerin belirli hücresel hedefleri de geliştirme varietal, ve tabii ki, onların yerini belirlemek için zor.Bugüne kadar, metalleri ölçmek için farklı analitik teknikler geliştirilmiştir, ancak bunların çoğu pahalı veya erişilemezdir. Yoğun araştırma daha erişilebilir ve verimli bir şekilde metal tayinleri geliştirmek için odaklanmıştır. Grafit fırın atomik absorpsiyon spektroskopisi, GF-AAS, iki ana avantajı vardır.Çinko için düşük algılama limitleri sağlayarak doğru iz çinko analizi sağlar. Aynı zamanda yüksek hacimli numune gerektirmeyen bir tekniktir, çözeltinin mikrolitreleri analizi gerçekleştirmek için yeterli olma eğilimindedir. Bu iki avantajın birleşimi, GF-AAS'ı düşük hacimli numunelerde eser öğeleri analiz etmek için ideal hale getirsin.Birçok insan patolojik koşulları metal dengesizlikleri ile ilgilidir. Bazı örnekler anemi, akrodermatit enteropaica ve Wilson ve Menkes hastalıklarıdır. Bu nedenle biyolojik numunelerdeki geçiş metallerinin seviyelerini yüksek hassasiyet ve doğrulukla ölçmek için etkin ve güvenilir yöntemler geliştirmek önemlidir.GF-AAS, normal fizyolojik koşullarda ve patojenik vakalarda herhangi bir metalin belirlenmesini kolaylaştıran bir teknoloji üzerinde mükemmel bir örnektir. Yöntem çok yönlüdür. Birçok sistem uygulanabilir ve birçok eleman GF-AAS kullanılarak analiz edilebilir.Zorluklar, örneklerin bu sınıra düşmesini sağlayarak gerçekte algılama yöntemi sınırını belirlemektir. Örneklerin hacminin düşük olduğu göz önüne alındığında, test için çok fazla yer yoktur, bu nedenle verilerin dikkatle incelenmesi en başından beri yapılması gerekir. Numunelerin ilk analizinden sonra, numuneleri nicelleştirme için gerekli sınırlara getirmek için gereken seyreltme faktörünün ne olduğunu belirlememiz gerekir.AAS'ye gitmeden önce çekirdekleri düzgün bir şekilde kesirleyebildiğinizden emin olun. Batı lekeleri spektroskopik analizden önce her zaman iyi bir doğrulamadır. GF-AAS düşük hacimli olsa da, hücre içi havuzlar zaten düşük hacimlerdedir.Bu test için çok az yer verir. İlk ölçümler dikkatle yapılmalı ve incelenmelidir, böylece numune tedavisi sadece bir seyreltme faktörüne indirgenebilir. Başlamak için, kültür 55 santimetre kare plakalar ilgi hücreleri.Kültür medyaaspirate için bir vakum tuzağı kullanın. Ortamın tüm izlerini kaldırdıklarından emin olun. İstenilen zaman noktalarından veya kültür koşullarından hücreleri üç kez durulamak için kalsiyum ve magnezyum içermeyen buz gibi PBS kullanın.Sonra plakaya bir mililitre buz gibi pBS ekleyin ve hücreleri tabaktan kazıyın. Hücre süspansiyonlarını 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buzda tutun. 10, 000 kez G'de 10 saniye santrifüj yapın ve aspirasyon la supernatant'ı çıkarın.Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonların metal analizi isteniyorsa, iyonik olmayan bir deterjan olan 0.1%NP-40 içeren 400 mikrolitre buz gibi pbs içeren hücre peletini yeniden askıya alın. 100 mikrolitreyi tüm hücre numunesi olarak yeni bir mikrosentrifuge tüpüne aktarın ve eksi 20 derecede saklayın. Çekirdekleri izole etmek için, 400 mikrolitrelik hücre süspansiyonunun buzüzerinde 5 ila 10 kez yukarı ve aşağı inip çıkarmasını pipetlemek için P1000 mikropipet ucu kullanın.Sonra, hücre süspansiyon beş mikrolitre ayıklayın ve bir mikroskop cam slayt aktarın. Çekirdek bütünlüğünü doğrulamak için 40 kat objektif kullanarak bir ışık mikroskobu altında beş mikrolitre yerleştirin. Kalan 395 mikrolitre likit süspansiyonu 10 saniyede 10 saniye için santrifüj edin, 000 kez G.Sitosolik fraksiyonu içeren süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Daha sonra, 0.1% NP-40 içeren PBS 500 mikrolitre ekleyin nükleer fraksiyonu ile pelet durulayın, ve 10 saniye için santrifüj 10, 000 kez G.Supernatant çıkarın, ve aynı çözeltinin 100 mikrolitre çekirdekleri içeren pelet yeniden askıya. Hücreleri lyse için, beş dakika boyunca, üç kez, her biri için çözüm içeren tüm hücre ve çekirdekleri sonicate bir Bioruptor kullanın. Nükleer veya sitosolik fraksiyonlara özgü antikorlar kullanarak, fraksiyonların saflığının batı lekeleri tarafından kalite kontrolünü gerçekleştirmeye devam edin.İlk olarak, tüm hücre, sitoplazmik ve 1.5 mililitre mikrocentrifuge tüpler hücre süspansiyon 100, 500 ve 100 mikrolitre içeren nükleer fraksiyonları, tüm hücre, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonları konsantre nitrik asit eşit hacimli ekleyin ve bir saat hücre kültürünü mineralize etmek için 80 santigrat derece bir termal blok yerleştirin. Bundan sonra, termal blok tüpleri çıkarmak ve 20 santigrat derece de bir gecede asit sindirim devam etmek için bir rafa yerleştirin. Hidrojen peroksit numune hacminin% 30 ekleyerek reaksiyonu durdurun.18 mega Ohm saf su ile 500 mikrolitre numune hacmi getirin. Sonra, 15 mililitrelik Falcon tüp seyreltilmiş analitik sınıf standart nitrik oksit saflaştırılmış suda 18 mega Ohms kalibrasyon sırasında boş çözelti olarak iki hacimli nitrik asit çözeltisi hazırlamak için. Daha sonra, milyarda 1,000 parça konsantrasyonu ile ticari olarak kullanılabilir 1, 000 ppm çinko stok çözeltisi seyreltmek için iki hacimli nitrik asit çözeltisi kullanın.Çalışma standardı çözümleri milyon çinko standart çözeltisi başına 1, 000 parça, milyar çözelti başına 1,000 parça hazırlayın, sonra 5, 8, 10, 15, 20 ve 25 ppb doğrudan 2 hacimli nitrik asit çözeltisi ile seyreltin. Polipropilen örnek bardak içine% 0.1 magnezyum nitrat matris değiştirici bir mililitre yerleştirin ve sonra autosampler atlıkarınca içine bardak yükleyin. Otomatik olarak çinko standartlarına matris değiştirici beş mikrolitre eklemek için atomik soğurma spektrometre programlayın ve boş.Standart çözeltiler ve numuneler için atomik soğurma spektrometresinde aynı optimize edilmiş koşulu, dakikada 250 mililitre giriş akış hızı, 20 santigrat derecede enjeksiyon sıcaklığı ve dört adımlı işlemlerde 1, 800 santigrat dereceye ulaşan grafit fırın sıcaklığı ile ayarlayın. Kalibrasyon farklılıkları veya buharlaşma nedeniyle yapılan hataları önlemek için tek bir deneyin tüm standartları ve numuneleri aynı anda ölçülmelidir. Lamba C-HCL'yi 20 amper, dalga boyu 213,9 nanometre ve 0,7 nanometre yarık ile optimize edin.Pipet polipropilen örnek bardak örnekleri, ve autosampler atlıkarınca içine yerleştirin. Çinko tespiti alt sınırı milyarda 0.01 parçadır. Standartların konsantrasyonu artırılarak, çinko tespiti üst sınırı milyarda 20 parça olarak belirlenmiştir.Çinko standart eğrisi elde edildikten sonra, metal içeriğini belirlemek için mineralize numuneleri ölçün. Elde edilen veriler algılama sınırının ötesindeyse, numuneleri %0,1 analitik sınıf nitrik asitle arıtılmış 18 mega Ohm arıtılmış su ile seyreltin. Çekirdek protokolünün bu hızlı yalıtımında, ayırt edici birincil miyoblastlardan temsili bir batı lekesi hücre altı fraksiyonlarının saflığını gösterir.Kromatin remodeler enzimi Brg1 nükleer fraksiyonu tanımlamak için kullanıldı ve tubulin sitosolik fraksiyonu tanımlamak için kullanıldı. Bu şekil, her hücre tipinin çoğalan ve farklılaştırılmış veya confluent monolayers için temsili ışık mikrograflar gösterir, ve tüm hücre özleri karşılık gelen çinko içeriği, sitosolik ve nükleer fraksiyonları. Bu çalışmada analiz edilen tüm hücre hatları nanomolar aralığında çinko konsantrasyonları gösterdi.Diferansiye primer miyotüpler çoğalan hücrelere göre daha yüksek düzeyde çinko sergiledi. Benzer bir althücre çinko dağılımı nöroblastom türetilmiş hücre hattı N2A tespit edildi. Öte yandan, kurulan 3T3-L1 hücre hattı, pre-adipositler indüklenen veya farklılaştırılan zamana göre çoğalan çinko daha yüksek düzeyde sergiledi.MCF10A hücreleri çoğalan hücrelerde sitosolik ve nükleer fraksiyonlar arasında eşit düzeyde çinko gösterdi. MCF10A hücreleri biraraya ulaştığında, tüm hücre çinko düzeylerinde %40 azalma saptanır ve metalin en çok sitosolik fraksiyonda yoğunlaştığı bulunmuştur. Grafit fırın atomik absorpsiyon spektrometresi biyolojik ve çevresel örneklerde geçiş ve ağır metaller ölçmek için son derece hassas bir tekniktir.Hücre altı fraksiyonlarının hazırlanmasında özel bakım ve temizlik yapılmalıdır, çünkü minimum kontaminasyon, ekipmanın hassasiyeti nedeniyle analize engel olacaktır. Her deneydeki düşük hacimler ve metallerin iz seviyeleri göz önüne alındığında, çinkoölçmek için GF-AAS'den daha iyi ve daha doğru bir teknik düşünmek zordur. GF-AAS'ın nispeten düşük maliyetinde algılama ve düşük hacim limitlerini sağlayabilecek güncel teknikler yoktur.Grafit fırın atomik absorpsiyon spektrometresi doğru, hassas, uygun maliyetli ve erişilebilir. Bu analitik teknik, temel algılama teknolojileri ilerlemeye devam ettikçe gelişmeye devam edecektir. Çinko ve diğer metallerin GF-AAS tarafından saptanması için gelecekte yapılacak uygulama, organlar, hayvan modellerinden elde edilen dokular ve sistemik metal dengesizlikleri ile ilişkili hastalığı olan hastalardan alınan biyopsileri içerecektir.Nitrik asit çok hızlı bir şekilde ciddi kimyasal yanıklara neden yeteneğine sahip son derece aşındırıcı bir asittir. Bu kimyasal aynı zamanda metalik tozlar gibi bazı bileşikler ile şiddetle tepki verebilir. Nitrik asitin oluşturduğu tehlike nedeniyle, nitrik asit kullanımı nda sıkı güvenlik önlemleri almak önemlidir.Nitrik asit kullanırken, havalandırma yeterli değilse güvenlik kimyasal gözlükleri, sıçrama koruması için yüz kalkanı, eldiven ve onaylı buhar solunumu takmanızı şiddetle tavsiye ediyoruz.

atomic-absorbance-spectroscopy-to-measure-intracellular-zinc-pools

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Fare organlarında yüksek hassasiyetli çinko izotop oranları ile ölçüm yapma tekniğini sunuyoruz.

Fare Organlar Uygulanan Yüksek Hassasiyetli Çinko İzotopik Ölçümler

Periplasmic Geçiş metalleri refakatçi yerli bağlama ortakları bağlamında ve x-ışını Floresans ve radiometal alımını sundu tarafından substrat içeriğini biyofiziksel karakterizasyonu çıkarılması için bir protokol.

Ayagin Gram-negatif bakterilerde temel Metal alımı: x-ışını Floresans, Radioisotopes ve hücre ayırma

Bu makalede, Atlantik somonunda mikro mineral kullanılabilirliğini değerlendirmek için sistematik bir yaklaşım ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Metodoloji, biyolojik karmaşıklığı artan araç ve modelleri içerir: (1) kimyasal spektasyon analizi, (2) in vitro çözünürlük, (3) hücre hatlarında alım çalışmaları ve (4) in vivo balık çalışmaları.

Atlantik Somonunda Çinko Örneğiyle Gösterilen Tamamlayıcı Yöntemler Kullanılarak Balık Yemlerinde Mineral Kullanılabilirliğinin Değerlendirilmesi

Bu protokol, kapsüllenmiş insan hücrelerini 72 saate kadar canlı tutmak için bir NMR biyoreaktörünün kurulumunu ve ardından zamanla çözülmüş hücre içi NMR veri toplama ve analizini açıklar. Metodoloji, hücre içi protein-ligand etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak izlemek için uygulanır.

İnsan Hücrelerinde Protein-Ligand Etkileşimlerinin Yüksek Hücre Yoğunluklu Biyoreaktör Kullanarak Gerçek Zamanlı Kantitatif Hücre İçi NMR ile İzlenmesi

Çinko taşınmasının, protein fonksiyonuna zayıf nedensel bağlantılar ve düşük zamansal çözünürlük nedeniyle ölçülmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, Zn 2 + duyarlı bir floresan boya kullanarak canlı hücrelerden Zn2 + ekstrüzyonunu yüksek zamansal çözünürlükle izlemek için bir yöntemi açıklar, böylece doğrudan bir Zn2 + akışı ölçümü sağlar.

İn Vitro Çinko Taşıma Testi Kullanılarak Memeli Çinko Taşıyıcılarının Karakterize Edilmesi

Aşağıdaki çalışma, gerçek zamanlı, yüksek verimli bir tarama tekniği olan elektrik hücresi-substrat empedans algılamasını (ECIS) kullanan seçilmiş bir metal-organik çerçevenin toksikolojik profilini değerlendirmektedir.

Metal-Organik Çerçeve Toksikolojik Profillerinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Elektrik Hücresi-Substrat Algılama

Bu protokol, mikobakterilerde Zn2+ sınırlı ribozomlar üretmek için Zn2+ sınırlı ortamın, büyüme kaplarının ve tohum kültürlerinin hazırlanmasını detaylandırır. Zn2 + izleri Zn2 + sınırlayıcı büyümeye yol açar ve model bakteri, Mycobacterium smegmatis ve insan patojeni M. tuberculosis'te in vitro olarak Zn2 + sınırlamasını doğrulamak için biyoindikatör olarak kullanılan morfojenik özellikleri tanımlarız.

Mycobacterium smegmatis'in Mikobakterilerde Çinko Sınırlı Büyüme Koşulları için Biyoindikatör Olarak Kullanılması

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Supramolecular protein derlemeler atomik çözünürlükte yüksek alaka nedeniyle çok önemli rolleri biyolojik olayları çeşitli yapılardır. Burada, biz bir protokol tarafından magic-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MAS SSNMR) iplik çözünmez ve kristal makromoleküllerin protein derlemeler üzerinde yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için mevcut.

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Öğrenin, memeli hücrelerinde çinko ve iz elementleri grafit fırın atomik absorbans spektroskopisi ile hassas ve düşük maliyetli ölçüm için hücre içi havuzların izolasyonu ve analizi yöntemlerini.

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Daha fazla video keşfet