Name: Zebrafish objektif Nucleus yerelleştirme ve sütür bütünlüğü değerlendirmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Öğrenin, Danio rerio kullanarak lens morfolojisini ve çekirdek yerleşimini niceliksel olarak değerlendirmek için in vitro ve in vivo görüntüleme protokollerini. Bu yöntemler, lens gelişimi ve katarakt önleme mekanizmalarını anlamak için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz finansman kaynağı kabul etmek istiyorum: NIH R01 EY05661 J. E. H için, Ines Gehring aqp0a/b çift mutantlar ve zebra balığı yetiştiriciliği üreten ile yardımcı olmak için, Dr Daniel dranow tartışmalar için transgenics nesil lider, Dr Bruce Blumberg ve Dr Ken Cho 's Labs onların diseksiyon microscopes kullanımı için, ve Dr Megan Smith istatistiksel analiz yardım için.

Bu çalışmada kullanılan hayvan protokolleri, oftalmik ve vizyon araştırmalarında hayvanların kullanımı için ARVO Ifadesine uyarak California Üniversitesi Irvine 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıASUC) tarafından onaylanmıştır.

1. zebrafish yetiştiriciliği ve ötenazi
<ol><li>Standart Laboratuar koşulları altında zebra balığı (AB strain) yükseltmek ve korumak12. Embriyo Orta (EM)12embriyoları yükseltin. Ekle 0,003% PTU EM için 20-24 h sonrası (prim-5 aşaması önce) embriyolar pigment oluşumu önlemek için12 embryonik aşamalarında görüntüleme için kullanılan9. 6-30 gün sonrası (DPF) 14 DPF kadar canlı rotiferler bir diyet ve 14 DPF12sonra canlı Artemia dan larva yükseltmek. Dikkat: PTU çok zehirli</li>
	<li>
Dokunmaya duyarlı olmayan kadar tricaine kullanarak balık anestezize.
	<ol>
<li>3-amino Benzoik acidethylester 400 mg birleştirerek tricaine stok hazırlayın, 2,1 mL 1 M Tris (pH 9), içinde 100 mL ddH2O. pH 7,0 olarak ayarlayın ve-20 °c ' de saklayın. Dikkat: Tricaine zehirli.</li>
		<li>Seyreltmeli 4,2 mL trikül stokta 100 mL tank suyunda larvaları/yetişkinleri veya EM 'de embriyoları anestezize etmek için (% 0,0165 w/v 'de tricain son konsantrasyonu).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. embriyo ve larvaları sabitleme
Not: İmmünohistokimyasal protokoller daha önce yayınlanan materyallerden7' ye uyarlanmıştır.
<ol><li>Dechorionated embriyo veya larvaları 2 hafta sonrası% 4 (v/v) paraformaldehit (PFA) fosfat tamponlu tuzlu (PBS) bir rocker üzerinde 4 °C ' de bir gecede düzeltin. Dikkat: PFA yanıcı ve kanserojen.</li>
	<li>Embriyoları PBS 'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve 4 °C ' de gece% 10 Triton ve% 1 DMSO (PBS-T) ile PBS 'de geçirgen. Dikkat: DMSO toksik, yutulması veya cilt emilimi ile zararlı, cilt yoluyla tehlikeli maddeler taşır, ve yanıcı. Triton zehirli, korozif ve su ortamları için tehlikelidir.</li>
</ol>3. larval ve yetişkin zebrafish lensler diseksiyon
<ol><li>6 DPF larvaları ile yetişkinliğe kadar tricaine 'e dokunmayan, dokunmak için yanıt vermeyen ama hala güçlü bir kalp atışı gösteren balık anestezize edilir. 13. aşama için balık standart uzunluğunu Schilling (2002) uyarınca ölçün.</li>
	<li>
Hemen mikro Diseksiyon makas ve PBS (Şekil 2 yetişkin gözleri için gösterilen) bir diseksiyon çanak içine yer kullanarak gözleri eksizler.
	<ol>
<li>Objektif disikleri için silikon ile dolu özel bir 35 mm çanak olun. Silikon ayarlandıktan sonra, diseksiyon sırasında yetişkin gözleri/lensleri immobilize etmek için 2-3 mm çapında ve 0,5 mm derinlikte bir Divot dışarı çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yetişkin zebra balığı lensler diseksiyon
	<ol>
<li>PBS ile dolu çanak Divot posterior yan içine yetişkin bir göz yerleştirin. Optik disk üzerinden &lt; 45 ° açı forseps ekleyerek göz immobilize. Nick veya objektif sıkıştırmak için dikkatli olun. Retina ve sklera aracılığıyla optik diskten Diseksiyon makas ile siliyer bölgeye iki veya üç radyal kesikler olun.</li>
		<li>Çiçek yaprakları gibi Retina ve sklera geri Peel ve göz ters, kornea tarafı yukarı. Retina ve forseps ile bağlı dokulara uzağa çekerek, makas düz tarafı ile sklera ve kornea manipülasyon yoluyla dolaylı objektif immobilize. Dikkatle objektif aşırı doku Trim. Not: Sürekli sağlıklı lensler elde etmek için dikkatle incelemek için hayati önem taşımaktadır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Larva zebra balığı lenslerin diseksiyonu
	<ol>
<li>PBS ile dolu silikon çanak düz parçası üzerine bir larva göz arka tarafı yukarı yerleştirin ve başka bir tungsten iğne veya forseps ile göz immobilizing ederken Retina ve sklera üzerinden radyal kesikler yapmak için bir keskinleştirilmiş tungsten iğne kullanın. Not: Objektif zarar vermemek için dikkatli olun.<ol>
<li>% 10 (w/v) NaOH içine tel ucu askıya alarak elektron 0,1 mm Tungsten Tel 2 cm uzunluğunun ucunu keskinleştirmek ve düşük voltaj alternatif akım14uygulama. İğne, bir Bunsen brülörü kullanarak cam ucunu erime ile Pasteur pipet içine sabitleyin. Not: Alternatif ince diseksiyon araçları da kullanılabilir. Dikkat: NaOH korozif.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hafifçe iğne künt bir tarafı ile kesildiği göz objektif dışarı kepçe ve dikkatle bağlı doku çekin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. dissected lensler sabitleme
<ol><li>Oda sıcaklığında (RT) 24 saat boyunca PBS 'de% 1,5 (v/v) PFA 'da disseke lensler hemen düzeltin. PBS 'de üç kez her biri 10 dakika yıkayın lensler.</li>
	<li>Tüm montaj analizi veya kriyobölümleme için kriyokoruma için lensler geçirgen (bkz. Bölüm 8).<ol>
<li>4 °C ' de bir gecede PBS-T lensler geçirgen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. objektif Immünhistokimya
<ol><li>Phalloidin-Alexa Fluor 546 (1:200) ve PBS-T ' d a k i 4 °c ' de DAPI (1:1000 of 5 mg/ml stokta) ile hücre çekirdekleri ile sabit embriyo/larval veya yetişkin lenslerin etiket membranları. Dikkat: DAPı bir cilt ve göz tahriş edici.</li>
	<li>Her biri 10 dakika boyunca PBS-T ile üç kez yıkayın. % 30,% 50 ve% 70 gliserol PBS-T (v/v) içinde inkübasyon ile net doku her biri en az 1 saat veya 4 °C ' de bir gecede.</li>
	<li>PBS-T ' d a (v/v) 70% rogliserin içinde cam alt 35 mm 'lik mikrowell yemeklere, düz ve direkt olarak kapak kayma karşı mümkün olduğunca Mount balık. Küçük balık için, hafif bir anterior-lateral Tilt coverslip paralel olmak için objektif sütür yönlendirmek için yardımcı olabilir.</li>
</ol>6. bir transjenik Line In vivo kullanarak zebrafish anterior lens sütürler Analizi
<ol><li>Tol2 kiti15kullanarak TG (βB1cry: mAppleCAAX) hatları oluşturun. Tol2 transpoze eleman sistemi15 Mapple insan βb1300 BP tarafından tahrik olduğu yapının istikrarlı entegrasyonu sağlar-kristalin promotör16 ifade sonuçlanan caax sırası ile membran gergin Özellikle lens fiber hücreli membranlarda. Not: Bu yapı (ID: 122451) satın alınabilir.<ol>
<li>Enjeksiyon sabahı, enjeksiyon karışımı hazırlamak ve buz üzerinde tutun. RNase-ve DNase-Free H2O içeren son 10 μL hacmine ulaşmak için, ekle: 1,5 μL huβb1Cry: 50 ng/μL-[0.375-0.75 pg/final enjeksiyon] de mAppleCAAX DNA yapısı, 1,5 μL Tol2 Transposase mRNA Içinde 300 ng/μL (Tol2 kit)15 [15-30 pg/ Son enjeksiyon] ve 1 μL fenol kırmızı göstergesi% 1 w/v [1 x10-5% (w/v)/final enjeksiyon].</li>
		<li>Enjekte 50-100 pL enjeksiyon karışımı 1 hücreli aşama embriyo12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 DPF 'de Mapple pozitif lensler ile embriyo sıklığını ölçerek F0 enjekte embriyolar nakliyle verimliliği ölçmek. Not: Bu yöntemi kullanarak &gt;% 80 nakliyle verimliliği bekliyoruz. F0 mozaikler, bireysel hücrelerin membran morfolojilerinin ayrıntılı analizine izin verir. Farklı seviyede mozaikçilik, tek veya küçük hücre gruplarının morfolojilerini görüntülere sağlar, daha küresel objektif ifadesi ise lens sütürler in vivogibi çok hücreli yapıların analizine olanak sağlar.</li>
	<li>Outcross F0 mozaik balık tüm fiber hücre membranların etiket kararlı hatları, oluşturmak için. F0 kurucu transgeni ile germline entegre transgenik hatları olarak muhafaza edilebilir istikrarlı entegrasyonları ile yavru üretecek.</li>
</ol>7. bir transjenik Line In vivo kullanarak zebrafish anterior lens sütürler Analizi
<ol><li>Anestezize 3 DPF veya yetişkin mozaik veya istikrarlı transjenik balık ve Mount 1% düşük Melt agaroz (lma) ile tricaine göz düz cam alt mikrokuyu yemekleri kapak kayma karşı.<ol>
<li>1% LMA yapmak için 100 mL EM (metilen mavi olmadan) içinde LMA 1 g çözülür. 4 °C ' de 15 mL stoklar olarak uzun süreli saklayın. Mikrodalga her tüp kullanılıncaya kadar 42 °C ' de stok ve mağaza çözülür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trigren ile EM ile 6 DPF kadar kapak balık, veya LMA ayarlandığında yetişkinler için tricaine ile tank suyu ile.<ol>
<li>Metilen mavi veya tank suyu olmadan 5 mL EM Mix ile 250 μL tricaine stok ve 7 μL PTU görüntü PTU tedavi balık.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. objektif Kriyobölümleme ve Immünhistokimya
<ol><li>PBS (w/v) içinde% 10 sakaroz, RT 'de 1 saat için% 20 sakaroz (ya da 4 °c ' de bir gecede) ve 4 °c ' de% 30 sakaroz içinde bir gecede, sabit embriyolar veya yetişkin lensleri koruyun.</li>
	<li>Taban kalıplar Oct doku embed, ve sonra Ekim ile Aynalar üzerinde dondurmak. 12-14 μm de cryosection ve bir SuperFrost/Plus mikroskop slaytlar üzerine toplamak. 10 dakika boyunca slayt üzerine sıcak bölümler ~ 35 °C ' ye prewarmed.</li>
	<li>Her biri 10 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkama bölümleri. Phalloidin-Alexa un 546 (1:200) ile DAPı (1:1000) veya WGA-Alexa un 594 (1:200) ile etiket bölümleri, ardından üç PBS yıkanıyor. Anti-Fade montaj orta ve tırnak cilası ile mühür lamel magazini ile Mount.</li>
</ol>9. görüntüleme
<ol><li>Konfokal mikroskop ile görüntü kazanın. Z-yığınları veya optik dilimleri 60x N/A 1,2 su daldırma amacı veya benzer kullanarak, belirli bölgelerde posterior objektif kutup anterior elde. Aşağıdaki edinme ayarlarını kullanın: 1,2, 561 nm lazer, phalloidin-Alexa un 546 veya mApple için Texas kırmızı filtre veya DAPı için UV filtresi ile 405 lazer kullanarak havadar disk.</li>
	<li>Objektif derinliği ile sinyal kaybını karşı koymak için doğru z yoğunluklu lazer gücü. Bu sabit ve canlı 3 DPF embriyo posterior kutup güçlü bir sinyal ve yetişkin balık lensler Ekvator optik dilimleri güçlü sinyal sağlar.</li>
	<li>Resim işleme yazılımını kullanarak görüntüleri derleyin ve görüntüleyin.</li>
</ol>10. anterior-posterior eksen objektif Nucleus yerelleştirme ölçümü
<ol><li>Odak düzlemine paralel olarak direkler ve dikişler ile bir coverglass alt ile 35 mm tabak içinde PBS eksenel olarak taze eksiz lensler Orient. Genellikle objektif çekirdeğini tanımlamak için lens korteks ve objektif çekirdeğinin arayüzünde meydana gelen kırılma indeksinde bir fark arayın. Not: Sağlıklı vahşi tip yetişkin lensler çok zor objektif sütürler ve çekirdek görmek, ya da objektif yönünü belirlemek için yapım şeffaftır. Bu durumda, lens kapsülü için forseps ile hafif bir Nick küçük hasar neden olur, bu ölçüm için objektif yönlendirmek için yardım yaklaşık 10 dakika içinde sütürler ve objektif çekirdeği belirgin hale getirir. Ancak, lensler artık hasar gördüğü için aşağı akış uygulamaları için kullanılamaz hale gelir.</li>
	<li>Lens çekirdeği ile parlak alan aydınlatması altında veya DıC optik olmadan bir kamera bağlı bir diseksiyon mikroskop kullanarak objektif görüntüleri alın. Kalibrasyon için aynı büyütme altında bir mikrometre görüntü.<ol>
<li>Canlı Görünüm düğmesine tıklayın, objektif çekirdeği ve objektif çevre görselleştirmek için pozlama ayarlarını ayarlamak ve snap shot butonuna tıklayarak bir görüntü almak. Bir tif dosyası olarak kaydedin.</li>
		<li>Elde edilen lens görüntülerini kalibre etmek için görüntü işleme yazılımını kullanın. Düz çizgi aracını seçin ve mikrometre görüntüsünde bilinen uzunlukta bir çizgi çizin, analiz et | ölçek ayarlayın. Bilinen mesafeyi, birimleri girin ve ' Global ' kalibrasyonunu seçin ve Tamam 'ı tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Objektif çekirdeğinin merkezinin ön kutuplu (a-r) mesafesini ölçün.<ol>
<li>Objektif çekirdeğinin görselli merkezinde eksenel yönde bir çizgi çizmek için görüntü işleme yazılımındaki düz çizgi aracını kullanın. Objektif çekirdeğinin merkezi olarak bu satırın merkezini alın.</li>
		<li>Objektif anterior Pole bu noktadan başka bir çizgi çizin ve seçin ' ölçmek ' ' analiz ' menüsünde uzaklığı ölçmek için (a-r), burada bir objektif yarıçapı ve r merkezine objektif merkezinden uzaklığı olduğunu Çekirdeği.</li>
		<li>Arka kutuplara anterior başka bir çizgi çizin ve objektif çapı (2A) olarak bu mesafeyi ölçmek. Bu uzunlukları ' sonuçlar ' penceresinden kopyalayın ve bir elektronik tabloya veya istatistik programına aktarın. Not: Merceğin merkezine objektif çekirdeğinin merkezinden ölçme daha, tam olarak ön kutup çekirdeğinin merkezinden ölçmek daha kolaydır. Bu ölçüm, lens çekirdeğinin merkezinin lensin merkezine uzaklığını bildirmek için 10.3.5 adımda formüle göre dönüştürülür. Embriyonik çekirdeğin belirgin olmasına rağmen her zaman ölçümler için yetişkin çekirdeğini kullanın.</li>
		<li>Objektif yarıçapını hesaplamak için çapı 2 ' ye bölün .</li>
		<li>Objektif yarıçapına göre objektif <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59528/59528eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> çekirdeğinin normalleştirilmiş lokalizasyonu olan r/adeğerini hesaplayın. Not: ön kutup daha yakın yerleştirilen bir kernel Için, r/a &gt; 0.0 olacak, merkezi lokalize bir çekirdeğin 0,0 bir r/a olacak iken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zebra balığı gelişimi sırasında objektif çekirdeği lokalizasyonunda yapılan değişiklikleri belirlemek için normalleştirilmiş eksenel çekirdeği ölçümünün günlük olarak standart uzunluğun bir işlevi olarak grafiğini yapın.</li>
</ol>

<ol><li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li>
<li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aquaporin+Zero+Puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li>
<li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li>
<li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li>
<li>Lindsey Rose, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+Terminus+of+Lens+Aquaporin+0+Interacts+with+the+Cytoskeletal+Proteins+Filensin+and+CP49%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).</li>
<li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+0+plays+a+pivotal+role+in+refractive+index+gradient+development+in+mammalian+eye+lens+to+prevent+spherical+aberration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).</li>
<li>Uribe, R. A., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+Cryosections+from+Embryonic+and+Adult+Zebrafish+Eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).</li>
<li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+lens+development+in+the+zebrafish%3A+A+three-dimensional+time-lapse+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis.</a> Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).</li>
<li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2002).</li>
<li>Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchilling%2C+TF+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+A+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+human+%CE%B2B1-crystallin+promoter+activity+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).</li>
<li>Soules, K., Link, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+anterior+segment+in+the+zebrafish+eye%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye.</a> BMC Developmental Biology. 5 (1), 12(2005).</li>
<li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transparent+lens+and+cornea+in+the+mouse+and+zebra+fish+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).</li>
<li>Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Fate+and+Differentiation+of+the+Developing+Ocular+Lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).</li>
<li>Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+eye-a+paradigm+for+investigating+human+ocular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics.</a> Eye. 31, 68(2016).</li>
<li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Visual+System+of+Zebrafish+and+its+Use+to+Model+Human+Ocular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).</li>
<li>Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+on+the+move+towards+ophthalmological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Zebrafish on the move towards ophthalmological research.</a> Eye. 28 (4), 367-380 (2014).</li>
<li>Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+Microscopy+Reveals+Zones+of+Membrane+Remodeling+in+the+Outer+Cortex+of+the+Human+Lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).</li>
<li>Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Effects+of+Hyperbaric+Oxygen+on+the+Biochemical+and+Optical+Properties+of+the+Bovine+LensEffects+of+HBO+on+the+Bovine+Lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).</li>
<li>Gold, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKAP2+anchors+PKA+with+aquaporin-0+to+support+ocular+lens+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).</li>
<li>Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distributions+of+AQP5+and+AQP0+in+embryonic+and+postnatal+mouse+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development.</a> Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).</li>
<li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+%28NKCC1%29+and+sodium+chloride+cotransporter+%28NCC%29+and+their+effects+on+rat+lens+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li>
<li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+%CE%B15%2Ffibronectin1+and+focal+adhesion+kinase+are+required+for+lens+fiber+morphogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).</li>
<li>Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+proteasome+system+is+required+for+cell+proliferation+of+the+lens+epithelium+and+for+differentiation+of+lens+fiber+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish.</a> Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).</li>
<li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li>
</ol>

Hiçbir açıklama yok.

Zebra balığı objektif morfoloji Analizi mutantlar fenotipleri anlamada ilk adımdır, ya da oküler objektif biyoloji okumaya yönelik farmakolojik müdahalelerin etkileri. Objektif sütürler, kortikal fiber hücre morfolojisi ve objektif çekirdeğinin yönlerini analiz etmek için yöntemleri özetlemektedir. Bu yaklaşımlar in vitro ve In vivo ( tablo 1 ' de karşılaştırıldığında) bir kombinasyonudur. In vitro yöntemleri dış kortikal hücre morfolojisi daha fazla ayrıntı için, yanı sıra yet...

Zebra balığı, memeliler lenslere anatomik benzerlik, genetik ve farmakolojik manipülasyon, embriyonik göz gelişimi hızı, küçük boyut ve şeffaflık nedeniyle objektif gelişimi ve fizyolojisinin incelenmesi için mükemmel bir modeldir. In vivo görüntüleme için izin erken aşamalarında. Burada açıklanan yöntemler, sütür bütünlüğü, kortikal membran morfoloji in vitro ve in vivove objektif nükleer pozisyonun konumu ile birlikte embriyonik ve yetişkin aşamalarında zebra balığı lens morfolojisi analiz etmek için geliştirilmiştir. anterior-posterior eksen ex vivo. Bu yöntemler, objektif gelişimi ve fizyolojisinin fonksiyonel çalışmaları için bir başlangıç noktası olarak ve zebrafish objektif fenotürleri için ters genetik ekranlar olarak hizmet vermektedir.
Görüntüleme zebra balığı objektif morfoloji
Aquaporin 0 (AQP0) en bol objektif membran proteindir ve memelilerde birden çok temel fonksiyon nedeniyle, objektif gelişimi ve netlik için kritik öneme sahiptir. Zebrafish iki Aqp0s (Aqp0a ve Aqp0b) ve biz hem embriyonik ve yetişkin lensler fonksiyonlarının kaybını analiz etmek için yöntemler geliştirdik. Çalışmalarımız, aqp0a-/-mutantların anterior sütür istikrarsızlığından dolayı anterior kutup opaklığı geliştirmesini ve aqp0a/b çift mutantların nükleer opaklık geliştirilmesi olduğunu ortaya koyuyor1. AQP0 su taşımacılığı2, yapışma3,4, sitorsel çapa5 ve Refraktif endeks gradyan6nesil roller oynamak için gösterilmiştir, ancak bu çalışmalar büyük ölçüde yapılmıştır vitro. Zebra balığı, fonksiyon kaybına veya Aqp0a veya Aqp0b 'in tedirgin fonksiyonunun yaşam merceğinin morfolojisi ve fonksiyonunu nasıl etkileyeceğini incelemek için benzersiz bir fırsat sağlar. Gelişme sırasında objektif hücre morfolojisi ve sümetik bütünlüğünü değerlendirmek için, embriyonik ve yetişkin lenslerde kullanılmak üzere mevcut in vitro immünohistokimyasal yöntemleri7 ' ye değiştirdik ve bu süreci izlemek için üretilen transgenikler içinde vivo .
Tüm sabit embriyolar ve yetişkin lenslerde plazma membranı yapısı ve sütür bütünlüğü immunhistokimyasal analizi yapıldı. Zebrafish lensleri son derece küçüktür (objektif çapı, embriyolarda ~ 100 μm ve yetişkinlerde 1 mm 'ye kadar), memeli meslektaşları ile karşılaştırıldığında Böylece, tüm lensler dikiş bütünlüğü analiz etmek için gereklidir. Ön sütür oluşumunun In vivo Analizi ve hassas objektif hücre mimarisinin görüntülenmesi Için, Mapple 'ı özellikle objektif membranlarının etiketlemesi konusunda ifade eden transgenikler ürettik.
Objektif membran transgeniklerin canlı görüntülemenin avantajları şunlardır: 1) zaman atlamalı filmlerde dinamik morfolojik değişiklikleri okuyan, 2) sabitleme eserler kaçınarak, ve 3) daha önceki olayların daha sonra korelasyon olabilir uzunlamasına çalışmalar sağlayan fenotipleri. İris pigmentasyon normalde objektif çevre net görüntüleme önler. Primordia-5 (prim-5) aşamasından önce 1-fenil 2-Thiourea (PTU) eklenmesi, melanogenesis ve göz pigmentasyonunu yaklaşık 4 gün postfertilizasyon (DPF) olarak önler. Ancak 4 DPF 'den sonra lens çevresi özellikle eski aşamalarda in vivoolarak gizlenir. Ayrıca, objektifin yoğunluğu kendisi arka kutup görüntüleme gizler. Bu nedenle, lens çevre veya posterior sütür morfoloji çalışma, 4 DPF sonra, lensler eksize ve sabit olması gerekir.
Zojenik zebrafit hatları , vivo 10 ' daembriyonik objektif membran yapısını analiz etmek için kullanılmıştır. Q01 transjenik bir membran hedefleme dizisi için erimiş bir Camgöbeği floresan protein ifade, Gap43, EF1α organizatör ve bir hegzamer tarafından tahrik DF4 PAX6 artırıcı elemanı her yerde objektif fiber hücreler11. Q01 Retina içindeki amacrin hücreleri de dahil olmak üzere ekstra Lenticular ifade var, birincil faiz objektif ise arka plan sinyali ekler. Biz herhangi bir ekstra merceksi sinyal kaçınarak amacı ile özellikle objektif bir membran gergin mApple ifade eden bir roman transjenik çizgi geliştirdik.
Objektif çekirdeği lokalizasyonu
Biz objektif çekirdeğinin larva zebra balığı ilk anterior konumdan yetişkin lensler anterior-posterior ekseninde merkezi bir konuma hareket keşfetti. Yüksek refraktif indeks objektif çekirdeğinin pozisyonunda bu vardiya zebra balığı lens optik1normal gelişimi için bir şart olduğu düşünülmektedir. Yöntemlerimiz lens yarıçapı ile ilgili olarak objektif nükleer merkezileştirmenin ölçülmesine olanak sağlar. Bu yöntemi kullanarak, Aqp0a objektif nükleer merkezileştirme1için gerekli olduğunu gösterdi ve bu basit yöntem objektif geliştirme ve fizyolojisi ve zebra balığı modelinde optik özellikleri diğer çalışmalara uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>1-fenil-2-tiyoüre (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>DİKKAT &ndash; çok toksik%</td></tr><tr><td>4 Paraformaldehit sulu çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>RT 157-4</td><td>DİKKAT &ndash; sağlık tehlikesi, yanıcı</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>Objektif ve oda sıcaklığı -21 & olarak ayarlandı Deg; C</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>DİKKAT &ndash; gözleri ve cildi tahriş eder</td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>D128</td><td>DİKKAT &ndash; yanıcı, cilde nüfuz eder&nbsp;</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık taban kalıbı</td><td>VWR Scientific</td><td>15154-631</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Pasteur cam pipetler</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forseps</td><td>Dumont & Fils</td><td></td><td>Forseps keskinleştirilmiş tutun</td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Trikain)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>DİKKAT - toksik</td></tr><tr><td>Cam tabanlı mikro kuyu kabı (35 mm Petri kabı, 14 mm mikro kuyu, # 1.5 kapak camı)</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>hu ve beta; B1cry:mAppleCAAX DNA yapısı</td><td>Addgene</td><td>ID:122451</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Wayne Rasband, NIH</td><td>v1.51n</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Eriyik Agaroz (LMA)</td><td>Apex</td><td>902-36-6</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td>V 4.5</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR yazılımı</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus&nbsp; model 2.1.1.183 denetleyici ile</td><td>Olympus Corp</td><td>DP70</td><td></td></tr><tr><td>Olympus mikroskobu&nbsp;</td><td>Olympus Corp</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Unu 546</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22283</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Kırmızı göstergesi (%1 w/h)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>5725-16</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS5 v12.0</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop yazılımı</td><td>Adobe</td><td>CS5 v12.0</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo 60x/1.2 WD objektif</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>MTr 22</td><td>Veya eşdeğer güç kaynağı&nbsp;</td></tr><tr><td>Sürgülü ısıtıcı model No. 26020FS</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-594</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit boncuklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S612-3</td><td>DİKKAT - gözleri ve cildi aşındırıcı/tahriş edici, hedef organ - solunum sistemi, metaller için aşındırıcı</td></tr><tr><td>Superfrost/Plus mikroskop lamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silikon Dow Corning</td><td>World Prevision Instruments</td><td></td><td></td>SYLG184</tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Bileşik</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>DİKKAT &ndash; Toksik, sucul ortam için tehlikeli, aşındırıcı</td></tr><tr><td>Vannas mikro diseksiyon makası</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1346</td><td>Keskin/keskin düz uçlar</td></tr><tr><td>Vectashield antifade mouting ortamı</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Buğday Ruşeymi Aglütinin (WGA)-Alexa Un-594</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>W11262</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish objektif nucleus yerelleştirme ve sütür bütünlüğü değerlendirmesi

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Zebra balığı, genetik manipülasyon ve In vivo görüntüleme için benzersiz bir şekilde uygundur ve bu da ters genetik çalışmalar için ve in vivo görüntüleme için transgenics üretimi için giderek daha popüler bir model haline gelmiştir. Bu benzersiz yetenekleri zebra balığı oküler lens geliştirme ve Fizyoloji çalışma için ideal bir platform olun. Son bulgularımız bir Aquaporin-0, Aqp0a, anterior objektif sütür istikrar için gerekli olduğunu, hem de yaş ile objektif merkezi objektif çekirdeğinin kayması için bize özellikle zebra balığı lensler özelliklerini analiz etmek için uygun araçları geliştirmeye yol açtı. Burada hem larva hem de yetişkin lensler için uygulanabilir objektif diseksiyon için ayrıntılı Yöntemler özetlemektedir, histolojik analiz, immünhistokimya ve görüntüleme için hazırlamak. Objektif sütür bütünlüğü ve kortikal hücre morfolojisi analizine odaklanıyoruz ve objektif morfolojisinin In vivo görüntülemesinde elde edilen verilerle disseke lenslerden üretilen verileri, genetik olarak bir yeni transgenik zebra balığı hattı ile mümkün hale kodlanmış floresan Marker. Optik eksenine dik olan disseke lenslerin analizi, objektif çekirdeğinin anterior-posterior eksen boyunca göreli konumunun ölçülmesini sağlar. Bir ilk anterior konumdan merkeze objektif çekirdeğinin hareketi yetişkin zebrafish normal lens optik için gereklidir. Böylece, objektif nükleer pozisyon nicel bir ölçü doğrudan optik özellikleri ile ilişkilidir.

Yetişkin zebra balığı göz anatomisi memelilerin yakından benzerdir (Şekil 1a). Zebrafit ve memelinin gözleri arasında bazı farklılıklar olmasına rağmen, örneğin bir siliyer vücudu yerine bir siliyer bölgesi olmak gibi17, optik özelliklerde farklar18, ve embriyonik gelişim sırasında morfojenin farklılıkları19, zebra balığı göz göz gelişimi ve anlayış oftalmik hastalık okuyan için mükemmel ...

Bu protokoller kortikal lens morfolojisi, sabit ve canlı lenslerde zebra balığı lens sütürler yapısal bütünlüğü analiz etmek ve anterior-posterior eksen boyunca zebra balığı lens çekirdeğinin konumunu ölçmek için geliştirilmiştir.

Zebrafish objektif Nucleus yerelleştirme ve sütür bütünlüğü değerlendirmesi

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Protokollerimiz, lens gelişimi ve fizyolojisi ile ilgili fonksiyonel çalışmalar ve zebra balıklarında lens fenotiplerinin ters genetik taraması için bir başlangıç noktası sağlamaktadır. Protokollerimiz in vitro ve in vivo zebrafish lens membran morfolojisi analizleri arasında köprü kurar ve zebrabalığı lens optiklerinin gelişimini ölçmek için yeni ve basit bir yöntem sağlar. Zebrabalığı lens morfolojisi ve optik analizleri, lens gelişimini, normal fizyolojisini ve patofizyolojisini kontrol eden mekanizmalara ışık tutar.Bu anlayışlar da katarakt geciktirmek veya önlemek için bir yetenek yol açabilir. Asimetrik lokalize lens çekirdeklerinin zebra balığı dışında türlerde rapor edilmemiştir. Lens dikişlerinin tanımlanması, çekirdeğin lokalizasyonunu ölçmek için lensin doğru şekilde yönlendirilmesi için çok önemlidir.Tricaine ile yeterli sedasyon onaysonra, hemen bir yetişkin ya da bir larva zebra balığı her iki göz çıkarmak ve pbs ile dolu bir silikon diseksiyon kalıp ile 35 milimetrelik özel yapılmış Petri çanak içine her iki göz almak için mikrodiseksiyon makas kullanın. Lensi yetişkin bir zebra balığından almak için, göz arka tarafını yukarı yerleştirin ve optik diskten 45 dereceden daha az bir açıyla forceps takın. Optik diskten immobilize gözdeki sifiye bölgesine retina ve sklera yoluyla iki veya üç radyal kesi yapmak için diseksiyon makası kullanın ve çiçek yaprakları gibi retina ve sklera geri soyma.Gözü ters çevirin, kornea tarafı, ve retina ve bağlı dokuları çekmek için forceps kullanarak sklera ve kornea manipülasyonu yoluyla dolaylı olarak lens hareketsizleştirmek için makas düz tarafı kullanın, sonra dikkatle lens herhangi bir fazla doku kırpma. Larva zebrabalığı lens hasat için, PBS bir silikon çanak düz kısmına bir larva göz arka tarafı yerleştirin ve başka bir iğne veya forseps ile göz immobilize ederken retina ve sklera ile radyal kesikler yapmak için keskinleştirilmiş tungsten iğne kullanın, sonra yavaşça özel bir tungsten tel iğne snkün tarafı ile ayrışmış göz den lens kepçe ve dikkatlice bağlı doku çekin. Anterior-posterior eksen lens çekirdeğinin lokalizasyonunu ölçmek için, pbs'de yeni eksintif lensleri, odak düzlemine paralel kutuplu ve dikişli bir kapak cam alt kısmıyla 35 milimetrelik bir çanak tasnif edin.Lens çekirdeğini tanımlamak için, genellikle lens korteks ve lens çekirdeğinin arabiriminde meydana gelen kırılma indisi ile bir fark arayın. Lens dikişleri belirgin değilse, lens kapsülüne forseps ile hafif bir yalama dikişleri ve lens çekirdeğini ortaya çıkarır ve lensin ölçüm için yönlendirilmesine yardımcı olur. Çanak makine ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu sahnesine yerleştirin ve lens çekirdeği ile mercek görüntüleri parlak alan aydınlatma altında odak veya diferansiyel girişim kontrast optik ile.Kalibrasyon için aynı büyütmenin altında bir mikrometre görüntüleyin ve Canlı Görünüm'e tıklayın. Görüntü elde etmek ve resmi TIFF dosyası olarak kaydetmek için Anlık Görüntü'yi tıklatın. Edinilen lens görüntülerini kalibre etmek için, uygun bir görüntü işleme yazılımı programında, düz çizgi aracını seçin ve mikrometre görüntüsüüzerinde bilinen uzunlukta bir çizgi çizin.Analiz et ve Ölçeği Ayarla'yı tıklatın ve bilinen mesafeyi ve birimleri girin, ardından Genel kalibrasyon'u seçin ve Tamam'ı tıklatın. Lens çekirdeğinin merkezinden ön direğe olan uzaklığı ölçmek için, lens sütürünün yerini belirleyin ve eksenel bir yönde lens çekirdeğinin görüntülenmiş merkezine bir çizgi çizmek için düz çizgi aracını kullanın. Bu çizginin merkezi mercek çekirdeğinin merkezidir. Bu noktadan lensin ön direğine başka bir çizgi çizin ve mesafeyi ölçmek için Analyze menüsünde Ölçü'yü seçin.Ön kutuptan arka direğe başka bir çizgi çizin ve bu mesafeyi lens çapı olarak ölçün, ardından bu uzunlukları Sonuçlar penceresinden bir elektronik tabloya kopyalayın ve lens yarıçapına göre lens çekirdeğinin normalleştirilmiş yerelleştirilmesini hesaplayın. Üç gün sonra döllenme, ön kutupta ön dikişler oluşur ve hücrelerin çarpıcı yakınsaması sabit embriyolarda dar lif hücre zarlarının phalloidin boyama ile açıkça görselleştirilir. Lens membran lokalize mApple transgeninde daha güçlü geniş lifli hücre etiketlemesi membran alt etki alanlarının canlı görselleştirilmesine olanak sağlar, ancak sutural yakınsamadan yoksundır.Posterior dikişler hem in vitro hem de in vivo döllenme sonrası üç gün içinde görüntülenebilir. Ekvatoral düzlemde, phalloidin güçlü dış kortikal lif hücreleri etiketler, düzleştirilmiş altıgen şekli ortaya. Phalloidin sıkıştırılmış lens çekirdeği ve yabani tip ve mutant lens ayırt edilemez bir görünüm hariçtir.Lens membran lokalize mApple mozaiklerinde geniş lif hücrelerinin güçlü etiketlemesi, mutant lensin hücre hacminde bozulmaları ortaya koymaktadır. Transgen ekspresyonu geçirgenlikle sınırlı olmadığı için bazı mozaikler mercek çekirdeği etiketlemeyi ortaya çıkarır. Vahşi tip hayvanlarda, lens çekirdeği yetişkinlik döneminde merkezileşmeden önce gelişmenin erken aşamalarında ön lens direğine daha yakın başlar.Hücre zarlarının floresan kırmızı olduğu transgenik konaktaki yeşil etiketli proteinlerin ekspresyonu eşzamanlı protein lokalizasyonunun yanı sıra in vivo'da lif hücresi morfolojisinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Zebra balıkları in vivo çalışmalar için özellikle uygundur. Burada açıklanan araçları kullanarak, mercek mekanizmalarını inceleyebiliriz, büyük ölçüde in vitro olarak incelenmiştir, in vivo bir sistemde.

assessment-zebrafish-lens-nucleus-localization-sutural

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lens geliştirme, diğer dokuları ile etkileşimleri içerir. Çeşitli zebrafish göz mutantlar anormal küçük bir lens boyutuna göre karakterize edilir. İşte biz bu fenotip içsel nedenler veya objektif çevreleyen dokuların arızalı etkileşimler nedeniyle olup olmadığını belirlemek için bir lens nakli deney göstermektedir.

Zebra balığı Lens Nakli ve Göz Mutants Analizi Uygulaması

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Bu videoda, kortikal lens morfolojisini ve lens sütürlerinin yapısal bütünlüğünü analiz etmek için yetişkin ve larva zebra balığı lenslerini incelemek için geliştirilen protokol açıklanmaktadır.

Göz Lensi Diseksiyonu: Zebra Balığı Lens Morfolojisini Gözlemlemek İçin Bir Teknik

Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Zebra balığı artık kas distrofilerini, konjenital miyopatileri ve ilgili nöromüsküler hastalıkları modellemek için yerleşik ve güçlü bir araçtır. Çift kırılma ve dokunma ile uyarılmış kaçış davranışı, zebra balığı embriyolarının erken gelişim sırasında kas düzensizliği ve lokomotif bozukluğunun derecesini belirlemek için kullanılan iki yaygın noninvaziv testtir.

Larva Zebra Balıklarında İskelet Kası Defektlerinin Bikırılma ve Dokunma-Uyandırma Kaçış Yanıtı Deneyleri ile Analizi

Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Işık tabakası floresan mikroskobu, embriyonik gelişimi görüntülemek için mükemmel bir araçtır. Yakın fizyolojik koşullarda canlı embriyoların uzun hızlandırılmış filmlerinin kaydedilmesine izin verir. Geniş uzaysal-zamansal ölçeklerde zebra balığı gözü gelişimini görüntüleme uygulamasını gösteriyoruz ve çok görüntülü veri kümelerinin füzyonu ve evrişiminin çözülmesi için bir boru hattı sunuyoruz.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Burada, standart bir dizi protokol üstün oküler sulkus gözlemlemek için mevcut bir son zamanlarda tespit, evrimsel korunmuş yapısı omurgalı gözü önünde. Zebra balığı larva kullanarak, oluşumu ve üstün oküler sulkus kapatılması için katkıda faktörleri belirlemek için gerekli teknikleri göstermektedir.

Çift oküler sulkus görselleştirme Danio rerio embriyogenez sırasında

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Erken zebra balığı embriyolarının bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak bozulmamış bir koryon içinde görüntülenmesi için bir örnek hazırlama stratejisi açıklanmaktadır. Embriyoların %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında koryon içinde edindiği farklı yönelimleri analiz eder ve ışık tabakası sistemini kullanarak embriyo boyunca hücresel ölçekte çözünürlük elde etmek için görüntüleme stratejilerini detaylandırır.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Öğrenin, Danio rerio kullanarak lens morfolojisini ve çekirdek yerleşimini niceliksel olarak değerlendirmek için in vitro ve in vivo görüntüleme protokollerini. Bu yöntemler, lens gelişimi ve katarakt önleme mekanizmalarını anlamak için temel oluşturur.

Zebrafish objektif Nucleus yerelleştirme ve sütür bütünlüğü değerlendirmesi

Daha fazla video keşfet