Name: Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Öğrenin fare beyin dilimlerinde uzun menzilli girdilerin optogenetik stimülasyonu için stereotaksik enjeksiyon yöntemini. Bu teknik sinirbilimcilerin hücre tipine özgü fonksiyonel bağlantıları incelemesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang ve Jean Simonnet'e stereotaksik enjeksiyon protokolünün önceki sürümlerinin geliştirilmesinde yardımcı olmaları için teşekkür ederiz ve Marin Manuel ve Patrice Jegouzo teknik yardım için. Bu çalışma Fransa Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.) ve Agence Nationale de la Recherche Grant <span lang="FR" style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.) tarafından desteklendi.

Tüm prosedürler Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifi (2010/63/EU) uyarınca gerçekleştirilmiştir ve Paris Descartes Üniversitesi etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Deneyci, yerel yönetmeliklere uymak için prosedür için yetki almalıdır.
1. Deneyin planlanması
<ol><li>Hedef alınacak beyin bölgesini tanımlayın. Bir fare beyin atlası15yardımıyla enjeksiyon alanının stereotaksik koordinatlarını belirleyin. Sağ antero-dorsal talamik çekirdek için (ADN), koordinatları şunlardır: -0.82 posterior, 0.75 lateral, -3.2 derinlik (mm) bregma göre. Koordinatların farklı yaş, cinsiyet veya zorlanmadaki hayvanlar için ayarlanması gerekebilir.</li>
	<li>Bir pilot deneyde epifloresan mikroskobu ile gözlemlenebilir bir floresan izleyici (150 ila 300 nL) enjekte ederek koordinatların kesinliğini doğrulayın ve belgelayın(Şekil 1A,B).
</li>
	<li>Enjekte edilecek virüsün türünü tanımlayın. Virüsü üreticinin önerdiği şekilde -80 °C'de 6°L aliquots'ta saklayın. Belirli bir günde bir ila altı hayvan enjeksiyonu için, ameliyathaneye buz üzerine yerleştirilen 1 aliquot getirin. AAV kullanımı için biyogüvenlik düzenlemeleri ülkeye veya kuruma bağlı olabilir ve PSM 2 başlık kullanımı gerekebilir. NOT: Burada, Synapsin organizatörü AAV5 kontrolü altında yeşil floresan proteinerimiş hızlı bir channelrhodospin-2 varyantı olan Chronos'u ifade eden Bir AAV2/5 serotipi kullanıyoruz. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.</li>
</ol>2. Stereotaksik cerrahi
<ol><li>Kararlı bir standart laboratuvar tezgahüzerinde bir pompa tutucu ile donatılmış bir stereotaksik çerçeve yükleyin. Stereoskopu, hayvanın kafasının yerleştirileceği bölgeyi net bir şekilde görebilmek için ayarlayın. Aydınlatma için bir LED ışık kaynağı kullanın. Ameliyatın ilk adımları için gerekli olmayan pompa tutucuya erişmek için stereoskopu uzağa döndürün.</li>
	<li>Pompa tutucuya 33 G yontucu metal iğne ile donatılmış 10 μL Hamilton şırıngası takın. Fırlatma sistemini suyla test edin.</li>
	<li>Ketamin hidroklorür ve ksilazin karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile 4 ila 5 haftalık C57BL6 fare (sırasıyla 100 mg/kg ve 10 mg/kg) anestezi. 1 mL ketamin ve 0,5 mL xylazine karışımını 8,5 mL %0,9 NaCl olarak hazırlayın. Bu karışımda 10 mg/mL ketamin ve 1 mg/mL xylazine ile sonuçlanır. Bu karışımdan, hayvanın vücut ağırlığının gramı için intraperitoneally 10 μL enjekte edin. Anestezi süresi yaklaşık 1 saattir.</li>
	<li>Hayvanın ayak parmak çimdikiyle iyi anesthetize olduğunu doğrulayın. Sonra, nefes kolaylaştırmak için dil çekin. Kafatasının saçlarını tıraş edin.</li>
	<li>Lokal anestezi için başın derisinin altına 20 μL lidokain hidroklorür (4 mg/mL; 2 mg/kg) enjekte edin ve etkinin başlaması için 5 dakika bekleyin. Kuruluk nedeniyle göz hasarı önlemek için, topikal oftalmik merhem ile gözleri kaplayın.</li>
	<li>Kafatası ortaya çıkarmak için, küçük cerrahi makas ile kafa derisi düz bir kesim oluşturun. Bir stereotaksik çerçeve içinde hayvan yerleştirin, kemik üzerinde dinlenmek ve kafatası için iyi bir erişim oluşturmalıdır deri aşağı çekmek için gerçek kulak biraz rostral kulak çubukları ekleyerek. Yerine sıkın. Burun parçasını töben.</li>
	<li>Boy ayarlı bir destek kullanarak hayvanın vücudunu yatay olarak baş seviyesinde koruyun. Fizyolojik sıcaklıkta tutmak için farenin altına bir ısıtma yastığı yerleştirin.</li>
	<li>Kemikten yumuşak doku kaldırmak için bir pamuklu bez ile% 0.9 NaCl uygulayarak kafatası temizleyin. Ameliyatın geri kalanında stereoskopu kullan.</li>
	<li>Kafatasını, bregma-lambda ekseninin seviyesi, burun ve diş parçasının yukarı veya aşağı hareket ettirilmesi için ayarlayın. Bu bregma ve lamba yinelemeli önlemler gerektirir, her ikisi de burun seviyesinin ayarını takiben değişecek gibi.</li>
	<li>Kafatasındaki enjeksiyon yerini bulun. Enjeksiyon iğnesini enjeksiyon bölgesinin üstündeki posterior ve medial koordinatlara göre ayarlayın ve kafatasını tek kullanımlık bir iğneyle işaretleyin. Enjeksiyon iğnesini 4 cm yukarı doğru hareket ettirin.</li>
	<li>Maksimum hızın yarısında 1 mm çapında kraniyotomi gerçekleştirmek için matkapla 0,5 mm'lik bir çapak kullanın. Bir kağıt mendil ile nihai kanama swab.</li>
	<li>Hamilton şırıngasında bulunan suyu tamamen pompayla dışarı atarak depolamak için boşaltın. Sadece iğne hala suyla dolacak. İğne saf deiyonize su ile her kullanım arasında yıkanır. Sterilizasyon gerekli değildir.</li>
	<li>Bu gün için kullanılacak virüs aliquot atın. Viral çözeltinin artık dondurulmadığını ancak soğutulduğundan emin olun (buz üzerinde 0 °C'ye yakın). Sadece kısa bir süre küçük hacimler için bir mikropipet ile 700 nL elde etmek için buz kaldırın. 5 cm x 5 cm'lik parafin filminin üzerine damlayı yatırın. Kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Kalan viral çözeltiyi tekrar buza koy. NOT: Damla hacmi istenilen enjeksiyon hacminden daha büyük olmalıdır (enjekte edilen 200 nL için 700 nL). Bu, sıvının bir kısmının aktarım sırasında kaybolması durumunda bir güvenlik marjı sağlar ve devam etmeden önce küçük bir test çıkarma işlemini (adım 2.16) sağlar.</li>
	<li>Parafin filmini kraniyotominin üstüne yerleştirin. Antero-posterior ve lateral pozisyondeğiştirmeden viral çözelti damla iğne Dalma.</li>
	<li>Fırdamacın parafin filmine atıldığı yaklaşık 500 nL viral çözeltiile doldurmak için pompanın "geri çekme" işlevini kullanın.  Bunu görsel kontrol (stereoskop) altında yapın, damlanın kaybolmasını izleyin ve hava yıkmayın.</li>
	<li>Şırınganın doğru doldurulduğundan emin olun. Görsel kontrol altında 50 nL likit küçük bir damla çıkarmak test etmek için piston aşağı sürüş tarafından fırlatma sisteminin işleyişini doğrulayın. Damlayı sil.</li>
	<li>Stereotaksik aygıtın dorso-ventral eksenini kontrol eden kalayı saat yönünde çevirerek iğneyi beyne seçili derinliğe yerleştirin. "Çalıştır" düğmesine basın (hız 15 nL/dk hacim başına 150 nL enjekte). Küçük bir hacim (50-300 nL, kullanılan virüse bağlı olarak) yavaş yavaş otomatik bir pompa ile 10 dakika üzerinde atılır.</li>
	<li>Enjeksiyon alanından sızmamak için enjeksiyondan sonra 10 dakika bekleyin. Daha sonra, dorso-ventral ekseni saat yönünün tersine kontrol eden tonucu çevirerek 3-5 dk üzerinde yavaş yavaş iğne çıkarın.</li>
	<li>Stereotaksik çerçevenin dikey kısmını şırınga yla hayvandan uzaklaştırın. Tıkanmasını önlemek için iğneyi hemen temiz distile suda birkaç kez doldurarak yıkayın. Su dolu şırıngayı saklayın.</li>
	<li>Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın. 4-0 poliamid dikiş filament ile cilt dikiş. 2-1-1 standart cerrahi düğümile bağlı üç veya dört stiches olun.</li>
	<li>Tamamen anestezi uyanır kadar ısıtılmış bir kafesiçinde fare yerleştirin ve yere yerleştirilen bir Petri kabında su ve ıslatılmış gıda sağlar. Isı kaynağı kafesin altındaysa, aşırı ısınmayı önlemek için bir spacer ızgarası kullanın. NOT: Lokal kılavuzlara göre ağrıyı önlemek için tek doz ketoprofen (2-5 mg/kg, deri altı) veya buprenorfin (0.05-0.1 mg/kg, subkutan olarak) uygulanabilir.</li>
	<li>Hayvan tamamen uyanık olduğunda, ev kafesine geri dönün ve özellikle enjeksiyonu takip eden gün, onun refahını izleyin. Ağrı belirtileri olup yok. Herhangi bir davranışsal değişiklik gözlenirse, hayvan vücut ağırlığını izlemek için tartılır.</li>
	<li>Kullanılan virüse bağlı olarak, tam ifade süresi değişebilir. Burada, AAV5 ifadesi için 3 hafta izin verir. Syn.Chronos-GFP.</li>
</ol>3. Akut dilim kayıtları ve fiksasyon için çözümler
<ol><li>10x konsantre kesme çözeltisi (125 mM NaCl, 25 mM sakkaroz, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO3,1,25 mM NaH2PO4 ve 2,5 mM D-glikoz) ve yapay cerebrospinalspinal sıvı (ACSF) çözeltisi (124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM Elektrofizyoloji deneyleri öncesinde saf deiyonize suda NaHCO3, 1 mM NaH2PO4 ve 11 mM D-glukoz) Bu çözeltileri CaCl2 ve MgCl2olmadan 1 L şişelerde 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Deney günü, kesme çözeltisi ve ACSF 10x'in stok çözümlerini her biri 0,5 L'lik son bir hacme seyreltin. Bir manyetik karıştırıcı ile çalkalama ve% 95/5% O2/ CO2ile köpürerek oksijen. Kesme çözeltisi için 0,1 mM CaCl2 ve 7 mM MgCl2, ACSF için 2 mM CaCl2 ve 2 mM MgCl2 son konsantrasyonları elde etmek için divalent iyonlar ekleyin.</li>
	<li>Potasyum-glukonat bazlı pipet çözeltisini içerecek şekilde hazırlayın: 135 mM K-glukonat, 1.2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 4 mM MgATP, 0.4 mM Tris-GTP, 10 mM Na2-fosfokreatin ve 2.7-7.1 mM post-hoc hücre için biyositin morfoloji vahiy. Çözeltinin pH'ını 7.3'e, ozmolaritesini 290 mOsm'a ayarlayın. -20 °C'de 1 mL aliquots saklayın.</li>
	<li>BupH PBS kuru karışım toz poşetleri 500 mL distile suda seyrelterek 0,1 M PBS hazırlayın ve 0,1 M sodyum fosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,2 elde edin.</li>
	<li>1 L %4 PFA çözeltisi hazırlamak için, 111 mL%36 sıvı PFA ve 90 mL 10x PBS çözeltisini damıtılmış suda seyreltin.</li>
	<li>0,1 M PBS'lik 500 mL'de 150 g sakaroz içeren %30 sakaroz çözeltisi hazırlayın.</li>
</ol>4. Beyin dilimlerinin hazırlanması
<ol><li>Perfüzyon dan önce emici tezgah kağıdı ile tezgah alanı hazırlayın.</li>
	<li>Yerçekimi ile beslenen perfüzyon için tezgah yaklaşık 1 m yukarıda bir damla yükleyin. 24 G kelebek iğnesi takın.</li>
	<li>Vibratomun kesme odasını buzla çevreleyin ve dondurucuda saklayın.</li>
	<li>Ameliyat için kullanılan aynı ketamin-ksilazin karışımı intraperitoneal enjeksiyon ile fare anestezi. Anestezinin evresini, parmak parmaklarını forceps ile sıkıştırarak değerlendirin. Tam uykudayken, intraperitoneal olarak 100 μL heparin (5000 U.I./mL) enjekte edin.</li>
	<li>Hayvanı emici kağıda yapışkan bantla düzeltin. Göğüs kafesini, sol ve sağ taraftaki kaburgaları diyaframdan yukarı doğru küçük makaslarla keserek açın. Yapışkan bant yardımıyla göğüs kafesini açık tut.</li>
	<li>İnen aortu hemostat la kenetleyin ve kalbin sol ventrikülünden 4 °C soğutulmuş ve oksijenli (%95/5 O2/CO2)ile perfüzyon ile 24 G kelebek iğnesi ile çözeltiyi keserek sıkıştırın. 5 s sonra, küçük makas ile sağ atriyum açın.</li>
	<li>Perfüzyon 5 dakika sonra, organlar kansız olduğunda, perfüzyon durdurun. Hayvanın kafasını büyük makasla ayırın ve kafanızı Petri kabında 4 °C'lik soğutulmuş ve oksijenli kesme çözeltisine batırın.</li>
	<li>Beyni çıkarmak için, deriyi boyundan buruna kesmek, sonra da son omurları kafatasından makasla kes. El ile deri geri ve kafatası açmak için küçük makas kullanın, orta hat boyunca kesme, kaudal rostral için, yukarı göz arasında.</li>
	<li>Dikkatle kavisli veya kemik forceps ile frontal kemik parietal kemik ve kaudal kısmını çıkarın. Beyin ve kranial zemin arasında alet ekleyerek küçük bir yuvarlak spatula ile beyin ayıklayın, koku ampul kesit, optik sinir ve diğer kranial sinirler, ve beyincik.</li>
	<li>Beyni buz gibi kesme çözeltisine (4 °C) yavaşça bir kabın batırın. Kortikal yüzeyi nazikçe kurutmak için beyni filtre kağıdına yerleştirin. Yatay beyin dilimlerini kesmek için beyin korteksini bir vibratomun örnek tutucusuna yapıştırın, kaudal tarafı bıçakla bakacak şekilde.</li>
	<li>Kesme odasını buz gibi oksijenli kesme çözeltisi ile doldurun, böylece beyin tamamen gömülmüş olur. Dilimler üzerinde potansiyel sol-sağ belirsizliği önlemek için sol yarımkürede (enjekte edilen tarafa kontralateral) bir kesim yapın. DİkKAT: Çözeltiyi her zaman oksijene maruz edin ve dilimleri ışığa maruz kalmaktan koruyun.</li>
	<li>1 mm genlikte 0,07 mm/s hızla 300 μm kalınlığında dilimler vibratom ile kesin. Bu aşamada, floresan el feneri (440-460 nm) ve ilgili filtre gözlükleri (500 nm uzun geçiş) kullanarak talamusta chronos-GFP ifadesini kısaca kontrol etmek önerilir.</li>
	<li>Hipokampal bölgeyi neşterle izole edin ve banyo ile dolu bir kabın içinde yer alan bir odaya aktarın (34 °C), oksijenli (%95/5 O2/CO2) ACSF.</li>
	<li>15 dk sonra, ısıtılan su banyosu ndan odayı alın ve dilimlerin oda sıcaklığında dinlenmesine izin verin, kullanıma kadar en az 45 dakika oksijenli olun.</li>
</ol>5. Tüm hücreli yama-kelepçe kaydı
<ol><li>Hipokampal kompleksi içeren bir beyin dilimini, özel yapım cam transfer pipetiyle dik bir mikroskoba monte edilmiş kayıt odasına nazikçe aktarın. Transfer pipeti, kauçuk pipet ampule bağlı kısaltılmış pasteur pipetten (iç çap 6,5 mm) yapılır. Kayıt odasını (3 mL) 34 °C (ısıtılmış) ACSF ile %95/5 O2/CO2ile sürekli olarak perfüzyon. Peristaltik pompanın hızını 2-3 mL/dk'ya ayarlayın.</li>
	<li>Mavi LED aydınlatma (470 nm) ile ilgi bölgesindeki akson terminallerinde Chronos-GFP ifadesini kısaca inceleyin ve 4x objektif olarak gözlemleyin. GFP floresansı, bilgisayar ekranında görüntülenen bir CCD kamera görüntüsüyle uygun bir emisyon filtresi aracılığıyla görselleştirilir.</li>
	<li>Onu korumak için dilimin üzerine, sıkıca aralıklı naylon dizeleri ("arp") ile U şeklinde platin telden yapılmış bir dilim çapa yerleştirin.</li>
	<li>63x daldırma hedefine değiştirin ve odağı ayarlayın. Chronos-GFP ifade aksonları kontrol edin ve yama kaydı için bir piramidal nöron seçin.</li>
	<li>Hedefi yukarı doğru hareket ettirin.</li>
	<li>Pipetleri borosilikat camdan Kahverengi-Yanan elektrot çekmecesi kullanarak çekin. Çekmece, yaklaşık 1 μm uç çapına sahip pipetler üretecek şekilde ayarlanmıştır. Pipetleri K-glukonat bazlı iç solüsyonla doldurun.</li>
	<li>Pipeti pipet tutucuya baş sahnede monte edin. Hazneyi odadaki pipeti indirin ve ucu hedefin altında bulun. Pipet direnci 3-8 MΩ arasında olmalıdır. Pipetten çıkan bir çözelti konisi görmek ve pipeti ve hedefi dilimin yüzeyine kademeli olarak düşürmek için şırınga ile hafif pozitif basınç uygulayın.</li>
	<li>Hücreyi voltaj-kıskaç yapılandırmasında yama: tanımlanan nörona yaklaşın ve pipet ucunu soma üzerine hassas bir şekilde bastırın. Pozitif basınç membran yüzeyinde bir gamze üretmelidir. Giga-ohm mührünü (>1 GΩ direnci) oluşturmak için basıncı bırakın. Mühürlendikten sonra tutma gerilimini -65 mV'ye ayarlayın. Negatif basınç keskin bir darbe ile membran break: Bu pipet tutucubağlı bir tüp güçlü emme uygulanarak elde edilir.</li>
	<li>Tam hücre akım kelepçe modunda kayıt nöron yanıtları hiperpolarize ve depolarize akım adımları(Şekil 2A). NOT: Bu protokol hücrenin aktif ve pasif içsel özelliklerini belirlemek için kullanılacaktır. Özel yazılmış MATLAB yordamları off-line analiz10,16için kullanılır.</li>
	<li>Chronos ifade afferent liflerin tüm alan 475 nm LED stimülasyonu için akım veya voltaj-kıskaç postsinaptik tepkiler kayıt. 20 Hz 'de 2 ms süreleri 10 stimülasyon trenler ile uyarın (Şekil 2B,C). Işık yoğunluğu 0.1-2 mW arasında değişebilir. NOT: Işık yoğunluğu, hedefe göre konumlandırılmış fotodiyat sensörü ile donatılmış dijital el optik güç konsolu ile ölçüldü. 2-4 ms'lik yanıt gecikmeleri monosinaptik bağlantı için karakteristiktir.</li>
	<li>Uzun menzilli afferents ve kayıtlı nöron arasındaki sinaptik iletimin doğasını araştırmak için farklı farmakolojik ajanlar kullanılabilir. Farmakolojik olarak ağ aktivasyonu yoluyla dolaylı yanıtlardan doğrudan, monosinaptik yanıtları ayırt etmek için ACSF'ye 1 μM TTX ve 100 μM 4-AP ekleyin. NOT: Glutamat reseptör blokerlerinin banyo uygulaması serbest bırakılan nörotransmitterin doğasını ve postsinaptik reseptörlerin kimliğini belirlemeye olanak sağlar. Örneğin, AMPA tipi glutamat reseptörleri NBQX (10 μM) ve NMDA reseptörleri tarafından APV (100 μM) tarafından bloke edilecektir. Çalışmanın amacına bağlı olarak, sinaptik yanıtların veya yanıt dinamiğinin zaman adedine olan gerilim bağımlılığını araştırmak için protokoller tasarlanabilir.</li>
	<li>Başka bir hücreyi yamalamak için orijinal ACSF solüsyonuyla yıkayın veya biyositin dolu bir nöron içeren dilimi %4 PFA ile dolu küçük bir şişeye aktarın.</li>
	<li>%4 PFA'da gece fiksasyonundan sonra, dilimi 0,1 M PBS (5 dk için 2 x, 20 dk için 1x) yıkayın.</li>
	<li>4 °C'de %30 sakarozda saklayabilirsiniz.</li>
</ol>6. Biocytin vahiy
<ol><li>Biyositin dolu nöronların bulunduğu sabit dilimleri %30 sakaroz damlasında cam bir bıçak üzerine aktarın ve üç kez donma-erime gerçekleştirin: bıçağı sakaroz damlaları tamamen dondurulana kadar 1 dakika boyunca strafor kutusuna atfedilen kuru buzüzerine yerleştirin, sonra erimesi için bıçağı avuç içine bastırın.</li>
	<li>0,1 M PBS (5 dk için 2x, 1 saat ve 50 dakika için 1x), hafifçe ajite dilim 3x yıkayın. Son yıkama için 2 saati geçmeyin.</li>
	<li>Membranları 0,1 M PBS'de permeabilize etmek için %2 süt tozu (20 mL'de 0,4 g) ve %0,5 Triton X100 (20 mL'de 0,1 mL) içeren ajite tampon çözeltisi içinde 2 saat boyunca RT'deki dilimi önceden inkübedin.</li>
	<li>%2 süt tozu, %1 Triton X100, streptavidin-Cy5 konjuge (1/500) ve DAPI (1/1000) içeren bir çözeltide gece boyunca 0,1 M PBS'de hafifçe ajite edin.</li>
	<li>Dilimi 0,1 M PBS 'de üç kez yıkayın (5 dk için 2 kat, 2 saat için 1x). Son yıkama arka plan boyama azaltmak için, 4 saate kadar, daha uzun sürebilir.</li>
	<li>Dilimi takmadan önce, PBS ile dolu bir bölmede işaretli hücreyi içeren dilimin yan tarafını belirlemek için Cy5 floresan işaretleyicilerini gözlemlemek üzere yapılandırılmış 10x büyütmede epifloresan mikroskobu kullanın.</li>
	<li>Bir bıçak üzerine dilim aktarın, hücre tarafı kadar, bir kağıt mendil ile kuru, ve yüksek dirençli montaj ortamı kullanarak monte.</li>
	<li>Hücre gövdesinin konumunu incelemek için Cy5 ve DAPI yapılandırmasında 10x büyütmede epifloresan mikroskobu kullanın ve GFP yapılandırmasında işaretli afferentleri veya ayrıntılı somatik, aksonal ve dendritik morfoloji (Şekil 2D,E). Filtre ayarları Malzemeler Tablosu'ndaayrıntılı olarak açıklanmıştır.</li>
</ol>

<ol><li>Goodridge, J. P., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+postsubiculum+and+anterior+thalamus+in+the+generation+of+head+direction+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).</li>
<li>Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+navigation.+Disruption+of+the+head+direction+cell+network+impairs+the+parahippocampal+grid+cell+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal.</a> Science. 347 (6224), New York, N.Y. 870-874 (2015).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+decrease+of+excitability+in+rat+hippocampal+neurons+through+increases+in+I%28h%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h).</a> Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).</li>
<li>Takahashi, H., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+Interactions+and+Synaptic+Plasticity+in+the+Dendritic+Tuft+Regions+of+CA1+Pyramidal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).</li>
<li>Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+nucleus+reuniens+and+entorhinal+cortex+projections+in+hippocampal+field+CA1+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat.</a> Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).</li>
<li>Callaway, E. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulating+neurons+with+light%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Stimulating neurons with light.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).</li>
<li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuBi-Glutamate%3A+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, 2(2009).</li>
<li>Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+neuronal+circuits+underlying+the+interaction+between+sensory+and+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex.</a> Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).</li>
<li>Simonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependent+feedback+inhibition+may+maintain+head+direction+signals+in+mouse+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum.</a> Nature Communications. 8, 16032(2017).</li>
<li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+Thalamic+Excitation+and+Feedforward+Inhibition+of+Presubicular+Neurons+Projecting+to+Medial+Entorhinal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).</li>
<li>Fricker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+cells+of+rodent+presubiculum+express+a+tetrodotoxin-insensitive+Na%2B+current%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current.</a> The Journal of Physiology. 587, Pt 17 4249-4264 (2009).</li>
<li>Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neuroanatomy+of+rat+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cellular neuroanatomy of rat presubiculum.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).</li>
<li>Simonnet, J., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+components+and+circuitry+of+the+presubiculum+and+its+functional+role+in+the+head+direction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system.</a> Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic. New York. (2013).</li>
<li>Huang, L. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+Localization+and+Projection-Specific+Properties+of+Presubicular+Neurons+Targeting+the+Lateral+Mammillary+Nucleus%2C+Thalamus%2C+or+Medial+Entorhinal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex.</a> eNeuro. 4 (2), (2017).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+Projections+from+the+Medial+Septum+Selectively+Inhibit+Interneurons+in+the+Medial+Entorhinal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).</li>
<li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice%3A+a+neurosurgical+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).</li>
<li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20(2015).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Hass, C. A., Glickfeld, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+optical+excitation+of+cortico-cortical+projections+at+physiological+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Tanımlanmış bir beyin bölgesinde ışığa duyarlı opsinler ifade etmek için in vivo viral enjeksiyon uzun menzilli fonksiyonel bağlantı10optogenetik analizi için bir seçim yöntemidir,11,17,18. Stereotaksik enjeksiyonlar tam olarak beynin belirli bir alanı hedef imkanı sunuyoruz. Floresan bir muhabir ile bir opsin coexpression uygun başarılı ifade ve kesin enjeksiyon sitenin onayı değerlendirilmesi...

Beyin bölgeleri arasındaki bağlantıyı tanımlamak nöral devreleri anlamak için gereklidir. Klasik anatomik izleme yöntemleri bölgelerarası bağlantının kurulmasına olanak sağlarken, lezyon çalışmaları bilgi akışının hiyerarşik organizasyonunu anlamaya yardımcı olur. Örneğin, uzamsal oryantasyon ve baş yön sinyali için beyin devreleri, talamustan presubiculuma kadar olan bilginin yön akışını içerir. Bu antero-dorsal talamik çekirdeklerin lezyon çalışmaları ile gösterilmiştir (ADN) downstream dorsal presubiculum baş yön sinyalini bozan, yanı sıra parahipokampal ızgara hücre sinyali1,2.
Beyin bölgeleri arasındaki fonksiyonel bağlantı hücresel ve hücre altı düzeyde kurmak daha zordur. Hipokampus, son derece organize anatomi dilim hazırlanmasında elektrik simülasyonu kullanarak yola özgü sinaptik bağlantıları araştırmak için izin verir. CA1'in stratum radyatumuna yerleştirilen stimülasyon elektrotları özellikle CA33'tenSchaffer teminat girdisini uyarmak için kullanılabilir. CA1'in stratum lacunosum molekülerine yerleştirilen uyarıcı elektrotlar, CA14,5'eperforant yol girişini aktive edecektir. Elektriksel stimülasyon akson terminallerinden nörotransmitter salınımı aktive; ancak, stimülasyon bölgesine yakın somata ile nöronlar aktive yanı sıra geçiş aksonları. Bu nedenle, neokortekste olduğu gibi, farklı orijin bölgelerinden liflerin hedef yapıda iç içe geçtiğinde, tanımlanmış beyin bölgelerinden gelen afferentlerin incelenmesinde sınırlı kullanım söz konusudur.
Nöronlar da ışık ile uyarılabilir. Optik yöntemler kafesli glutamat fotoaktivasyonu içerir, hangi bir kombine edilebilir- veya iki foton lazer tarama. Birden fazla yakın aralıklı siteler ardışık olarak uyarılabilir, doku hiçbir mekanik hasar ile6. Bu başarıyla sinaptik reseptörleri harita yanı sıra bireysel nöronlaretkinleştirmekiçin kullanılmıştır 7 . Glutamat uncaging yerel devre analizi için kullanılabilir iken, uzun menzilli girişlerin özel aktivasyonu için izin vermez.
Nöronal devrelerde uzun menzilli bağlantının araştırılması için tercih edilen bir yöntem virüs aracılı kanalrhodopsin ekspresyonu kullanımıdır. Burada açıklandığı gibi in vivo stereotaksik enjeksiyonlar kullanılarak, ışık kapılı iyon kanallarının ifadesi hedeflenebilir ve mekansal olarak istenilen beyin bölgesi ile sınırlı olabilir. Bu şekilde, kanaloidpsinler bir bölgeden hedefine uyarıcı veya inhibitör bağlantı haritalama için etkilidir. Transfected akson terminalleri bir beyin dilimi hazırlık ışık ile uyarılabilir, ve yama-kelepçe kayıtları bir okuma olarak beyindeki belirli devre bileşenlerinin işlevleri ve güçlü lerinin incelenmesine izin8. Optogenetik yaklaşım bir virüsün stereotaksik enjeksiyonu ile birlikte benzeri görülmemiş özgüllük ve genetik kontrol sunuyor9. Ayrıca ışık ile uyarıcı hem yüksek zamansal ve mekansal hassasiyet10,11sağlar.
Presubiculum hipokampus geçiş altı katmanlı kortikal yapı ve para-hipokampal oluşumu12,13. ADN11'den önemli sinaptik giriş alır, aynı zamanda diğer birçok kortikal ve subkortikal bölgeden14. Bu nedenle, bir presubiküler dilim içinde talamik aksonlar terminallerinin seçici stimülasyon elektriksel stimülasyon veya glutamat uncaging ile mümkün değildir. Bu protokolde açıklanan yöntem, ışık kapılı kanalları ifade eden viral vektörlerin hassas stereotaksik enjeksiyonları kullanılarak beyin bölgeleri (ADN ve presubiculum) arasındaki fonksiyonel bağlantıyı belirleme yöntemleridir. Ayrıca açıklanan kendi hedef bölgede nöronlar projektör aksonların terminalleri fotostimülasyon, beyin dilimi hazırlanmasında post-sinaptik nöronların tüm hücre yama-kelepçe kayıtları ile birleştiğinde.

<table><tbody><tr><td>0,5 mm çapak;</td><td>Harvard</td><td>Aparatı 724962</td><td></td></tr><tr><td>10 ve mikro; L Hamilton şırınga</td><td>Hamilton</td><td>1701 RN - 7653-01</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS çözeltisi</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9624</td><td>&nbsp; metin</td></tr><tr><td>%36 PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>470 nm LED&nbsp;</td><td>Cairn Araştırma</td><td>P1105/470/LED&nbsp; DC / 59022m</td><td>, eşleşen uyarma filtresi 470 / 40x & nbsp; ve GFP için emisyon filtresi ile kullanım & nbsp;</td></tr><tr><td>AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td><td>Penn Vektör Çekirdeği</td><td>AV-5-PV3446</td><td>lot V6026R, qTiter GC / ml 4.912e12, ddTiter GC / ml 2.456e13 & nbsp;</td></tr><tr><td>Tüm kimyasallar</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bath sıcaklık kontrol cihazı</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM7</td><td>34 ° C'ye ayarlandı; C&nbsp;</td></tr><tr><td>eğimli metal iğne</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 ölçü, 13mm, nokta stili 4-20&deg;</td></tr><tr><td>Büyük makas</td><td>Dahle Allround</td><td>50038</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td>final 1-3 mg/ml</td></tr><tr><td>Borosilikat Kılcal</td><td>Damarlar Havard Aparatı</td><td>GC150-10</td><td>1,5 mm dış, 0,86 iç çap</td></tr><tr><td>Kahverengi Alevli elektrot çektirme</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>BupH Fosfat Tamponlu Tuzlu su paketi</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td>perfüzyon için kelebek iğne</td><td>Braun&nbsp;</td><td>Venofix A</td><td>24G</td></tr><tr><td>CCD Kamera</td><td>Andor&nbsp;</td><td>DL-604M</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td>20X</td></tr><tr><td>kavisli forseps</td><td>FST&nbsp;</td><td>11011-17</td><td></td></tr><tr><td>CY5 konfigürasyonu (konfokal)</td><td></td><td></td><td>Helyum-Neon 633nm (5,0 mW) lazer; Ayna: MBS 488/561/633&nbsp;</td></tr><tr><td>CY5 yapılandırması (epifluo)</td><td>Nikon/Chroma</td><td></td><td>Floresan ışığı (Intensilight); Uyarma filtresi: BP645 / 30; Dikroik ayna: 89100 BS ; Emisyon filtresi: BP705/72</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DAPI yapılandırması (epifluo)</td><td>Nikon/Chroma</td><td></td><td>Floresan ışık (Intensilight); Küp: Semrock seti DAPI-5060C-000-ZERO (Uyarma: BP 377/50; Ayna: BS 409; Emisyon: BP 447/60)</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dijital el tipi optik sayaç</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>475 nm</td></tr><tr><td>Çift egde paslanmaz çelik tıraş bıçağı</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72000</td><td>Dilimleyicide bıçağın yarısını kullanın</td></tr><tr><td>Çift Floresan Protein El Feneri</td><td>Nightsea</td><td>DFP-1</td><td>uyarma, 440-460 nm; Camlarda emisyon filtresi, 500 nm uzun geçirgen.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4368</td><td>final 0,2 mM</td></tr><tr><td>Epifloresan Mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE-2000E</td><td>10 veya 20X</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Ruby %10</td> <td>Millipore</td><td>AG335</td><td>100 ve mikroda 10 mg çözündürür; l damıtılmış su; 150 ila 300 nl</td></tr><tr><td>GFP konfigürasyonu enjekte edin (epifluo)</td><td>Nikon/Chroma</td><td></td><td>Floresan ışık (Intensilight); Küp: Filtre Seti Nikon B-2E/C FITC (Uyarma: BP 465-495; Ayna: BS 505; Emisyon: BP 515-555)</td></tr> <tr><td>Isıtma plakası</td><td>Physitemp</td><td>HP4M</td><td></td></tr><tr><td>Heparin choay 5000 U.I./ml</td><td>Sanofi</td><td></td><td>5 ml flakon</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>final 10 mM</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı döner mikromotor kiti</td><td>Foredom</td><td>K.1070</td><td>maksimum delme hızı 38.000 rpm</td></tr> <tr><td>< güçlü > İç çözelti bileşikleri: < / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzole Nabız Stimülatörü</td><td>A-M Sistemleri</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>final 1,2 mM</td></tr><tr><td>Ketamin 1000</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketofen %10</td> <td>Merial</td><td></td><td>100 mg/ml : seyreltik 1 ve mikro; toplam 1 ml içinde l (% 0,1)</td></tr> <tr><td>Laokain (lidokain)</td> <td>MSD</td><td></td><td>16,22 mg / ml : toplam 4 ml'de 1 ml seyreltin (yaklaşık% 4)</td></tr> <tr><td>Ameliyat için LED yüksek güç noktası</td><td>Fotonik (Phymep aracılığıyla)</td><td>10044</td><td></td></tr><tr><td>LED Güç Kaynağı</td><td>Cairn Research</td><td>OptoLED Işık Kaynağı</td><td></td></tr><tr><td>Manipülatörleri</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-7</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP 2H20</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>final 4 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>63069</td><td>final 2 mM</td></tr><tr><td>Mikro sıcaklık kontrol cihazı</td><td>Physitemp</td><td>MTC-1</td><td></td></tr><tr><td>Süt tozu</td><td>Karanfil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Akson Aletleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na Fosfokreatin</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td>final 10 mM</td></tr><tr><td>Na3-GTP 2H20</td><td>Sigma</td><td>G9002</td><td>final 0.4 mM</td></tr><tr><td>iğne tutucu/hemostat</td><td>FST</td><td>13005-14</td><td></td></tr><tr><td>pClamp edinme yazılımı</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td>14-16 ekranda 2-3 ml / dak & nbsp;</td></tr><tr><td>Potasyum glukonat (K-glukonat)</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td>Final 135 mM</td></tr><tr><td>ProLong Altın antifade montaj ortamı</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>P36390</td><td></td></tr><tr><td>Rompun %2 (ksilazin)</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>küçük makas</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür %0,9 &nbsp;</td><td>Virbac</td><td></td><td>toplam 10 ml içinde 8.5 mL seyreltik</td></tr><tr><td>Stereomikroskop VISISCOPE SZT</td><td>VWR</td><td>630-1584</td><td></td></tr><tr><td>Dijital göstergeli stereotaksik çerçeve</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td>Küçük hayvan stereotaksik aleti</td></tr><tr><td>Streptavidin-Cy3 konjugat</td><td>Yaşam teknolojileri&nbsp;</td><td></td><td></td>434315</tr><tr><td>Streptavidin-Cy5 eşlenik</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>Superglue3 Loctite</td><td>Dutscher</td><td>999227</td><td>1g tüp</td></tr><tr><td>Sütür filamenti Ethilon II 4-0 poliamid</td><td>Ethicon</td><td>F3210</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>kdScientific</td><td>Legato 130 - 788130</td><td>Kullanım Demleme ve Çekme modları</td></tr><tr><td>Doku dilimleyici</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>hızı 0.07, genlik 1.</td></tr><tr><td>boru</td><td>Gilson</td><td>F117942, F117946</td><td>Sarı/Siyah, Mor/Siyah</td></tr><tr><td>dik mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51W1</td><td></td></tr><tr><td>Versi-dry tezgah emici kağıt</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare beyin dilimlerinde uzun menzilli girdilerin optogenetik stimülasyonu için vivo İntraserebral stereotaksik enjeksiyonlarda

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Hücre tipi spesifik sinaptik bağlantı bilgisi, beyin çapındaki nöronal devreleri anlamak için çok önemli bir ön koşuldur. Uzun menzilli bağlantıların fonksiyonel incelemesi, tanımlanan uzak girdilerin spesifik uyarılmasıyla birlikte tek nöronların hedefli kayıtlarını gerektirir. Bu genellikle geleneksel ve elektriksel stimülasyon teknikleri ile elde etmek zordur, yukarı beyin bölgelerinde yakınsama aksonhedef bölgede iç içe olabilir, çünkü. Işığa duyarlı iyon kanallarının virüs aracılı ekspresyonu için belirli bir beyin bölgesinin stereotaksik hedeflemesi, o bölgeden gelen aksonun ışıkla seçici olarak uyarılmasını sağlar. İntraserebral stereotaksik enjeksiyonlar beyin deki diğer subkortikal veya kortikal alanlara ek olarak, anterior talamik çekirdekleri gibi iyi delimited yapılarda kullanılabilir.
Burada açıklanan fare beyninde channelrhodopsin ifade viral vektörlerin hassas stereotaksik enjeksiyon için teknikler bir dizi, beyin dilimi hazırlanmasında akson terminalleri fotostimülasyon takip. Bu protokoller basit ve yaygın olarak uygulanabilir. Postsynaptically bağlı nöron dan tam hücre yama kıskaç kaydı ile birlikte, aksonların fotostimülasyon fonksiyonel sinaptik bağlantıların tespiti sağlar, farmakolojik karakterizasyon, ve güçlerinin değerlendirilmesi. Buna ek olarak, kaydedilen nöronun biyositin dolgu postinaptik nöronun post-hok morfolojik belirlenmesi için kullanılabilir.

Burada sunulan prosedür, anterograd adeno ilişkili virüsün stereotaksik enjeksiyonu ile talamus (ADN) antero-dorsal çekirdeğinde GFP'ye kaynaşmış mavi ışığa duyarlı channelrhopsin (Chronos) ifade etmek için kullanılmıştır. Stereotaksik koordinatlar fare beyin atlasına göre belirlendi ve 200 nL floresan izleyici floro-yakut enjekte edilerek test edildi. Hayvan enjeksiyondan 10 dakika sonra kurban edildi ve beyin bir gecede çıkarıldı ve sabitlendi. Koronal beyin bölümleri doğru yerleştirilmiş ve ADN ile sınırlı enjeksiyon ...

Bu protokol, ex vivo beyin dilimlerinde optogenetik stimülasyonlar kullanarak uzak beyin bölgelerinden gelen uzun menzilli girdilerin hücre tipi spesifik fonksiyonel bağlantısını belirlemek için bir dizi yöntemi açıklamaktadır.

Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Bu yöntemin amacı, uzak beyin bölgelerinden gelen uzun menzilli girdilerin fonksiyonel bağlantısını beyin dilimlerinde fotostimülasyon kullanarak belirlemektir. Işığa duyarlı iyon kanallarının çeşitli aracılı ekspresyonu için belirli bir beyin bölgesinin stereotaksik hedeflemesi, o bölgeden gelen aksonun ışıkla seçici uyarılmasını sağlar. Prosedürü gösteren Louis Richevaux, benim grup bir doktora öğrencisi olacaktır.Ameliyattan önce, hayvanın ayak parmak çimdikiyle iyi anons edilebiyi doğrulayın. Yavaşça nefes kolaylaştırmak için dilini çekin. Sonra, kafatası nın saçlarını tıraş edin.Yerel anestezi için baş deri altına 20 mikrolitre lidokain hidroklorür enjekte edin ve beş dakika bekleyin. Kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisini kes. Sonra, stereotaksik bir çerçeve içinde hayvan yerleştirin.Kulak çubukları yerleştirin ve kemiklerin üzerinde hafifçe kulaklara rostral onları dinlenme ve kafatası iyi erişim oluşturmak için deri aşağı çekin. Kulak çubuklarını sıkın ve burun parçasını töşeyin. Boy ayarlı bir destek kullanarak hayvanın vücudunu yatay olarak ve baş seviyesinde koruyun.Fizyolojik sıcaklıkta tutmak için hayvanın altına bir ısıtma yastığı yerleştirin. Daha sonra yumuşa

in-vivo-intracerebral-stereotaxic-injections-for-optogenetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Video, transfekte edilmiş bir fare hipokampal beyin dilimindeki sinaptik etkileşimleri ve nöronal tepkileri incelemek için bir protokol göstermektedir. Aksiyon potansiyellerini tetiklemek için uzun menzilli duyusal nöronların aydınlatılmasını ve elde edilen uyarıcı post-sinaptik potansiyellerin tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanılarak kaydedilen nöronda kaydedilmesini içerir.

Fare hipokampal dilimlerindeki nöronların fotostimülasyon ve tam hücre yama kelepçesi kayıtları

Bu video, fare hipokampal beyin dilimlerinde uyarıcı sinaptik akımların mikroRNA aracılı inhibisyonunu göstermektedir. CA3 nöronları, bir floresan raportörü eksprese etmek için bir yapıyı, ışıkla aktive olan bir membran kanalını ve voltaj kapılı kalsiyum kanallarının ekspresyonunu aşağı regüle eden bir mikroRNA'yı barındıran rekombinant bir viral vektör ile enfekte edildi. Bir kayıt odasına bir dilim yerleştirildikten ve bir CA1 nöronunu bir kayıt pipeti ile yamaladıktan sonra, ışıkla aktive...

Fare Hipokampal Dilimlerinde Uyarıcı Postsinaptik Akımların MikroRNA Aracılı İnhibisyonu

Bu video, medial prefrontal korteks (mPFC) aksonlarını optogenetik olarak uyararak ve LEC'deki piramidal nöronların yanıtlarını kaydederek lateral entorinal kortekste (LEC) sinaptik verimliliği inceleme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, sinaptik plastisiteyi incelemek için yama-kelepçe kayıtlarını ışık stimülasyonu ile sinaptik aktivasyon ile birleştirir.

Sıçan Beyin Dilimlerinde Sinaptik Olayların Optogenetik Stimülasyonu ve Elektrofizyolojik Kaydı

Kaynak: Fricano-Kugler, C. J., et al. Stereotaksik enjeksiyon yoluyla yüksek titreli CRISPR retro ve Lentivirüslerin tasarımı, paketlenmesi ve teslimi. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, fare beyninde hassas nöronal gen düzenlemesi için stereotaksik viral enjeksiyonu göstermektedir. Protokol, dentat girusa doğru virüs iletimini sağlayarak, nöral devreleri, gen fonksiyonunu ve hastalık mekanizmalarını in vivo olarak incelemek için floresan etiketleme ve CRISPR aracılı gen nakavtını mümkün kılar.

Fare beyninde hedeflenen nöronal gen düzenlemesi için stereotaksik viral enjeksiyon

Nöronal popülasyonları in vitro olarak fotostimül etmek için optogenetik bir yaklaşım kullanarak ön beyin devrelerinin fonksiyonel topografyasını ve sinaptik özelliklerini karakterize etmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Optogenetically Hedeflenen Önbeyin Devreler Lazer tarama photostimulation

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Ex vivo beyin dilimleri, uçucu anesteziklerin afferent girdilere uyarılmış yanıtlar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. Optogenetik, talamokortikal ve kortikokortikal afferentleri primer olmayan neokortekse bağımsız olarak aktive etmek için kullanılır ve sinaptik ve ağ yanıtları izofluran ile modüle edilir.

Beyin Dilimlerinde Afferent Yolakların Optogenetik Aktivasyonu ve Uçucu Anesteziklerle Yanıtların Modülasyonu

Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, serbestçe davranan farelerde nöronal dinamikleri ve mikro devreleri incelemek için güçlü bir tekniktir. Bu protokol, bir miniskop kullanarak iyi in vivo kalsiyum görüntüleme elde etmek için beyin ameliyatları yapmayı açıklar.

Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Burada, ışık iletimi için optik fiberlere ve nöral kayıt için bir elektrot dizisine sahip bir optrode sisteminin üretim yöntemini sunuyoruz. Channelrhodopsin-2'yi eksprese eden transgenik farelerle yapılan in vivo deneyler, eşzamanlı optogenetik stimülasyon ve elektrofizyolojik kayıt için sistemin fizibilitesini göstermektedir.

Eşzamanlı Optogenetik Modülasyon ve Elektriksel Nöral Kayıt için Optrode Dizisi

Bu protokol, viral teslimat, optrod implantasyonu, fototrombotik indüksiyon, astrosit ve nöron aktivitesinin eşzamanlı kaydı ve astrositlerin optogenetik uyarılmasını içeren entegre bir yöntem sağlar. Bu entegre yöntem, iskemik incinin akut ve kronik evreleri arasında astrosit-nöron ilişkisinin eşzamanlı incelenmesini sağlamayı amaçlamaktadır.

Fototrombotik İnme Modelleme ve Davranış Eden Farelerde Nöronal ve Astrositik Aktivitenin In Vivo Optrode Kaydı İçin Entegre Bir Yöntem

Öğrenin fare beyin dilimlerinde uzun menzilli girdilerin optogenetik stimülasyonu için stereotaksik enjeksiyon yöntemini. Bu teknik sinirbilimcilerin hücre tipine özgü fonksiyonel bağlantıları incelemesine olanak tanır.

Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

Daha fazla video keşfet