Name: Erken gelişim sırasında deniz anemon Genotipleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Öğrenin deniz anemonu Nematostella vectensis'i erken embriyonik gelişim sırasında genotipleme yöntemini. Bu teknik, embriyoları öldürmeden mutant fenotipleri belirleyerek gelişim biyolojisi araştırmalarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazının önceki versiyonunda anonim yorumcular için teşekkür ederiz, bu da taslağı geliştirdi. Bu çalışma Arkansas Üniversitesi 'nden fon tarafından destekleniyordu.

1. yumurtlama indüksiyon, in vitro fertilizasyon, ve de-jellying
<ol><li>16 °C ' de karanlığın içinde bin başına 12 parça (PPT) tuzluluk ile deniz suyunda Nematostella vectensis koruyun, günlük Artemia besleme.</li>
	<li>Yumurtlama İndüksiyon öncesi gün, bir sıcaklık ve ışık kontrollü kuluçla hayvan yerleştirin. Böylece hayvanların 25 °C ' de 8 h ışığa maruz kalabilmesi için kuluçk programını programlamak. Opsiyonel: yumurtlama geliştirmek için küçük bir parça (< 1 mm3) istiridye, bireysel hayvanlar için kuluçtar içine yerleştirmeden önce beslemek.</li>
	<li>Hayvanlarını, 16 °C ' de 1 saat boyunca kuluçsa bırakın.</li>
	<li>Hayvanlarını kuluçla çıkarın ve yumurtlama izin vermek için oda sıcaklığında (RT) ışık ile bir tezgah üzerinde bırakın. Yumurtlama genellikle sonraki 1,5 – 2 saat içinde gerçekleşir.</li>
	<li>Erkek ve dişiler ayrı konteynerlerde ise, dişi kabından yumurta paketlerini sperm içeren bir erkek konteynırı kullanarak, uçları açılması büyütmek için kesilen bir transfer pipeti kullanılarak, yumurtaların mekanik stres sırasında zarar görmediğinden Transfer. Yumurta en az 15 dakika için erkek kap içinde bırakarak döllenmiş izin verin.</li>
	<li>De-Jelly deniz suyunda yumurta paketleri 3% sistein içeren (pH 7,4) bir petri çanak veya 15 mL tüp. Yavaşça 12 dakika boyunca bir shaker üzerinde sarsıcı.</li>
	<li>Kümeleri kırmak için plastik bir pipet kullanın ve tamamen de-jellied kadar başka bir 2-3 dk için karıştırmaya devam.</li>
	<li>En az 5x için taze deniz suyu ile medyayı değiştirerek sistein çıkarın.</li>
	<li>16 °C veya RT bir cam Petri çanak üzerinde döllenmiş yumurta tutun.</li>
</ol>2. bir gastrula embriyo bir aboral doku cerrahi kaldırılması
<ol><li>10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 ve 1 mg/mL proteinaz K ile oluşan bir DNA ekstraksiyon tamponu hazırlayın. embriyo başına 20 mL ekstraksiyon tamponu kullanın. İyi vortekslenir tarafından mix ve PCR tüpler içine arabellek kısım.</li>
	<li>Deniz suyunda% 1 agaroz eritin ve alt kapak için bir petri çanak içine dökün. Jel yatak yapmak için bir tezgah üzerinde cool. Petri çanak jel yatak kapsayacak şekilde taze deniz suyu dökün.</li>
	<li>24 saat sonrası fertilizasyon (HPF) embriyoları (erken-orta gastrula aşaması), agaroz jel yatağı içeren Petri tabağına aktarın.</li>
	<li>Bir iğne tutucu içine bir tungsten iğne takın ve alkol iğne ucu daldırma ile sterilize (70% veya daha yüksek) ve alkol yakmak için alev yerleştirerek.</li>
	<li>Bir diseksiyon mikroskop altında (20X 40X büyütme), bir embriyo boyutu hakkında yüzey agaroz bir parça kaldırarak agaroz yatakta bir depresyon yapmak için tungsten iğne kullanın ve onun lateral ile depresyon üzerine embriyo yerleştirin Mikrocerrahi için embriyonun hareketini kısıtlamak amacıyla aşağı bakacak şekilde.</li>
	<li>Oral blastoporal açılış karşısında bulunan aboral doku bir parçası cerrahi olarak tüketim tungsten iğne kullanın. Oral-aboral eksen boyunca embriyonik doku dörtte biri için bir aboral bir-üçte genellikle yeterlidir.</li>
	<li>İzole aboral dokusu (< 2 mL) 20 mL 'Lik DNA ekstraksiyon tamponu içeren bir PCR tüpüne aktarmak için P20 pipet kullanın.</li>
	<li>Ameliyat sonrası embriyo, 24 veya 96-kuyu plakasında en az 500 mL 'Lik taze deniz suyu içeren bir kuyu içine aktarın.</li>
	<li>Gerektikçe embriyo sayısı için 2.4 – 2.8 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Cerrahi sonrası embriyoları içeren kuyu plakasını 16 °C veya RT 'de Genotipleme tamamlanıncaya kadar bir kuluçta yerleştirin.</li>
</ol>3. genomik DNA ekstraksiyon ve genotipleme PCR
<ol><li>DNA ekstraksiyon tamponu ve izole embriyonik dokulara mini Santrifüjü kullanarak (örn. 2.680 x g , 10 s için), PCR tüplerini kısaca döndürün.</li>
	<li>Tek embriyodan genomik DNA 'yı ayıklamak için 55 °C ' de PCR tüplerini 3 h. 30 sn. Vortex için her 30 dakikada bir hücre kümeleri dağıldığından emin olmak ve hücre liziz geliştirmek.</li>
	<li>95 °c ' de PCR tüplerini 5 dakika boyunca devre dışı proteinaz K olarak kulbin.</li>
	<li>GDNA özleri 4 °C veya buzda tutun ve hemen PCR 'ye geçin. Not: protokol,-20 °C ' lik dondurucuda gDNA özleri yerleştirerek burada duraklatılabilir.</li>
	<li>İlgi genomik Locus yükseltmek için bir şablon olarak çıkarılan gDNA kullanarak bir PCR reaksiyon ayarlayın.<ol>
<li>Eğer faiz Locus farklı allonların boyutu fark agaroz jel elektroforez tarafından tespit edilebilir böylece büyüklüğü farklıdır, tüm Locus yükseltmek için tek bir set astar tasarımı.</li>
		<li>Alternatif olarak, yalnızca belirli bir ALLELE varlığında PCR ürünleri üreten ALLELE özgü astar kullanın; Örneğin, ekleme/silme mutasyonları içeren bir bölgeye bağlanan astar tasarlayarak.</li>
		<li>Tipik bir 20 mL PCR reaksiyon karışımı aşağıdaki gibi kullanın: 5 mL gDNA özler, 8 mL çekirdeksiz su, 4 mL PCR tampon, 0,2 mL mm dNTPs, 0,6 mL DMSO, 1 mL 10 mM ileri astar, 1 mL 10 mM ters astar ve 0,2 mL DNA polimeraz (bkz. malzeme tablosu). Not: çoklu astar, PCR reaksiyonunda kullanılabilir. Örneğin, bir evrensel ileri astar ve iki ALLELE özel ters astarlar kombine edilebilir, sürece iki ters astar farklı boyutlarda PCR ürünleri üretmek için tasarlanmıştır, böylece varlığı/yokluğunda iki alelleri belirsizliğe sahip olabilir Jel Elektroforez tarafından belirlenir (bkz. temsili sonuçlar bölümü).</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR ürünlerinin boyutunu ve varlığını/yokluğunda belirlemek için agaroz jel elektroforezi çalıştırın. PCR ürünlerinin beklenen boyutuna bağlı olarak agaroz jel elektroforezinin (örn. agaroz jel yüzdesi, V/cm ve süre) durumunu ayarlayın.</li>
	<li>Her ameliyat sonrası embriyo için bir genotip atamak için PCR ürünlerinin boyutu ve varlığı/yokluğunda ilgili PCR sonuçlarını kullanın. Örneğin, farklı boyutlarda PCR ürünleri üretmek için başka bir Allen bekleniyorsanız, her embriyo için genotip atamak için boyut bilgilerini kullanın. ALLELE özel astar kullanıldığında, PCR ürünlerinin varlığı/yokluğunda veri her embriyo bir genotip atamak için kullanılmalıdır.</li>
	<li>Embriyoları genottipe göre sıralayın.</li>
</ol>

<ol><li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li>
<li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cambrian+Conundrum%3A+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li>
<li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li>
<li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li>
<li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742(2018).</li>
<li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377(2018).</li>
<li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486(2014).</li>
<li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development%2C+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li>
<li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694(2016).</li>
<li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li>
<li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian%2C+Nematostella+vectensis%2C+is+mediated+by+Dishevelled%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li>
<li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li>
<li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734(2018).</li>
<li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555(2018).</li>
</ol>

Yazarın ifşa etmesi gereken bir şey yok.

Burada tanımlanan bir PCR tabanlı protokol genotip tek bir deniz anemone embriyo hayvan ödün vermeden. Yumurtlama ve de-jellying takiben, döllenmiş yumurtaların gastrulae içine gelişmesine izin verilir. Her gastrula embriyo aboral bölge cerrahi olarak kaldırılır ve izole aboral doku sonraki genomik DNA ekstraksiyon için kullanılır, kalan cerrahi sonrası embriyolar iyileşmek ve gelişmeye devam ederken. GDNA ekstraları daha sonra her embriyonun genotipini belirlemek için bir PCR tahlil için kullanılır. Bu yöntem,<sup class...

Cnidarians denizanası, mercanlar ve deniz anemonlar içeren hayvanların çeşitli bir grup temsil eder. Bunlar, ekstrasellüler matris (mesoglea) ile ayrılan ektoderm ve endoderm 'den oluşan diploblastlar. Cnidaria, Drosophila ve mus gibi geleneksel hayvan modellerinin1' e ait olduğu Bilateria için bir kardeş grubudur. Ayrıca, Cnidaria-Bilateria sapma pre-Cambrian döneminde oluştuğu düşünülmektedir2. Bu nedenle, cnidarians ve bilatyalılar karşılaştırmalı çalışmalar en son ortak atalarının biyoloji içine anlayış kazanmak için önemlidir. Son zamanlarda, karşılaştırmalı genomikler, cnidarians ve bilatozların notch ve bhlh gibi birçok gelişimsel araç genlerini paylaşımının, ortak atalarının zaten bu genler olduğunu ima ettiğini açıkladı3. Ancak, Cnidaria ve Bilateria 'nın son ortak atalarında bu gelişimsel araç genlerinin rolü göreceli olarak daha az iyi anlaşılmaktadır. Bu sorunu gidermek için, cnidarians içinde bu derinden uyumlu genlerin nasıl işledik çalışması önemlidir.
Gelişen Genus genetik modellerinden biri anthozoan nematostella vectensis 'dir. Genomu3sıralanmıştır ve morpholino-aracılı gen taklası, meganuclease-aracılı Transgenesis ve Crispr-Cas9-aracılı gen tokmağı ve knockouts dahil olmak üzere çeşitli genetik araçlar, şimdi bu hayvanın kullanımı için kullanılabilir. Buna ek olarak, Nematostella gelişimi nispeten iyi anlaşılır. Embriyogenyon sırasında, gastrasyon invaginasyon tarafından oluşur4, ve embriyo serbest yüzme Planula larva içine gelişir. Planula daha sonra bir ağız ve circumoral dokunacles ile bir sapsız polip dönüşür. Polip sonra büyür ve cinsel olgunluğa ulaşır.
Crispr-Cas9-aracılı hedeflenen Mutagenezi artık rutin olarak nematostella vectensis5,6,7,8,9' da gen fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Nematostella'da nakavt mutantlar oluşturmak için, Locus 'a özgü tek kılavuzluk Rnas ve endonükleaz Cas9 proteini içeren bir kokteyl, ilk olarak gösteren F0 kurucusu hayvanları üretmek için döllenmez veya döllenmiş yumurtalara enjekte edilir Mozaik. F0 hayvanlar daha sonra cinsel olgunluğa yükseltilmiş ve bir F1 nüfus üretmek için birbirleri ile geçti, bir alt kümesi hangi nakavt mutantlar6olabilir. Alternatif olarak, cinsel olgun F0 hayvanlar F1 heterozigot hayvanlar oluşturmak için vahşi tip hayvanlar ile geçilebilir ve faiz Locus içinde bir nakavt allel taşımak F1 heterozigotlar daha sonra F2 yavru üretmek için birbirleri ile kesişebilir, bir çeyrek Hangi nakavt mutantlar5bekleniyor. Her iki yaklaşım da genetik heterojen bir nüfusun nakavt mutantları tanımlamak için bir yöntem gerektirir. Polyp tentacles Genotipleme için genomik DNA ayıklamak için kullanılabilir6,7. Bununla birlikte, ilgi geninin gelişimsel fonksiyonunun incelendiği ve mutant embriyoların polip aşamasına ulaşamayacağı durumlarda (yani, mutasyona bağlı larva saflığı nedeniyle), nakavt mutantların ontojende erken tespit edilmesi gerekir. Burada açıklandığı gibi, hayvan ödün vermeden gastrula aşamasında genotip bireysel hayvanlar için PCR tabanlı bir protokoldür, bu embriyo genetiği heterojen bir nüfusun nakavt mutantların tanımlanması sağlar. Tüm Genotipleme sürecinin süresi, taramalı embriyo sayısına bağlıdır, ancak minimal 4-5 h gerektirir.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Peltier Soğutmalı Kuluçka</td><td>Makinesi Shellab</td><td>SRI6PF</td><td>Yumurtlama indüksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Anında okyanus deniz tuzu</td><td>Anında okyanus</td><td>138510</td><td></td></tr><tr><td>Salamura karides kistleri</td><td>Aquatic Eco-Systems, Inc.</td><td>BS90</td><td></td></tr><tr><td>L-Sistein Hidroklorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Standart Orbital Çalkalayıcı, Model 3500</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCl, 1M, pH8.0</td><td>KALİTE BİYOLOJİK</td><td>351-007-01</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>VWR</td><td>BDH9258</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M pH8</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40 İkame</td><td>ABD Biyolojik</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K çözeltisi (20 mg / mL), RNA sınıfı</td><td>ThermoFisher</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>VWR</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Diseksiyon iğnesi tutucusu</td><td>Roboz</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten diseksiyon iğnesi</td><td>Roboz</td><td>RS-6063</td><td></td></tr><tr><td>PCR Eppendorf Mastercycler Termal Döngüleyiciler</td><td>Eppendorf</td><td>E6336000024</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Yüksek Sadakatli DNA polimeraz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>GLWamid üniversal ileri astar</td><td></td><td></td><td>5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3'</td></tr><tr><td>glw-a</td><td></td><td></td><td>5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3'e</td> özel ters astar</tr><tr><td>glw-c </td><td></td><td></td><td>5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'e</td> özel ters astar</tr></tbody></table>

erken gelişim sırasında deniz anemon genotipleme

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Burada açıklanan, hayvan hayatından ödün vermeden anthozoan Genus nematostella vectensis gastrula sahne embriyo genotip için PCR tabanlı bir protokoldür. İn vitro fertilizasyon ve de-jellying takipte, zygotların erken-orta gastrula aşamasına ulaşmak için oda sıcaklığında 24 saat gelişmesine izin verilir. Gastrula embriyoları daha sonra deniz suyu içeren bir petri çanak agaroz jel yatağa yerleştirilir. Diseksiyon mikroskop altında, bir tungsten iğne cerrahi olarak her embriyonun bir aboral doku parçası ayırmak için kullanılır. Cerrahi sonrası embriyolar daha sonra iyileşmeye ve gelişmeye devam etmesine izin verilir. Genomik DNA izole doku parçasından çıkarılır ve Locus özel PCR için bir şablon olarak kullanılır. Genotip, PCR ürünlerinin boyutuna göre veya ALLELE özel PCR ürünlerinin varlığı/yokluğunda tespit edilebilir. Cerrahi sonrası embriyolar daha sonra genottipe göre sıralanır. Tüm Genotipleme sürecinin süresi, taramalı embriyo sayısına bağlıdır, ancak minimal 4 – 5 h gerektirir. Bu yöntem embriyoların genetik olarak heterojen bir nüfusundan nakavt mutantları tanımlamak için kullanılabilir ve gelişim sırasında fenotiplerin analizlerini sağlar.

Nematostella genomunun, Nörofobide glwamıde için bir preürot proteini kodlayan tek bir Locası vardır. Bu Locus 'ta üç Knockout mutant alelleri (GLW-a, GLW-bve GLW-c) daha önce5bildirildi. Glwamide Locus (Genotype: +/GLW-c) ile vahşi tip allel (+) ve nakavt allel GLW-ctaşıyan dört heterozigot erkek, vahşi tip allel ve farklı nakavt taşıyan bir heterozigot dişi ile geç...

Bu protokolün amacı, embriyo ödün vermeden gastrasyon sırasında deniz anemone nematostella vectensis genotip etmektir.

Erken gelişim sırasında deniz anemon Genotipleme

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Bu protokol, bir araştırmacının erken embriyogenez sırasında mutant deniz anemonları tespit etmesini sağlar, böylece post-embriyonik gelişimsel fenotip analiz edilebilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hayvanın hayatından ödün vermeden tek tek deniz anemonları genotipli olarak ontojenin erken dönemlerinde kullanılabilmesidir. Bu prosedürü gösteren Miguel Silva, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.Indüksiyon yumurtlamadan bir gün önce, anemon nematostella vectensis'i sıcaklık ve ışık kontrollü bir kuluçka makinesine yerleştirin, böylece hayvanlar 25 santigrat derecede sekiz saatlik ışığa maruz kalmıştır. Ertesi gün, kuvöz hayvanları çıkarın ve aşağıdaki bir buçuk ila iki saat içinde meydana gelecek yumurtlama izin vermek için ışık açık oda sıcaklığında bir bank üst üzerinde bırakın. İpucu bir transfer pipet kullanın bir sperm içeren erkek konteyner içine kadın konteyner yumurta paketleri yerleştirmek için açılış büyütmek için kesilir ve döllenme için izin vermek için en az 15 dakika erkek kabında bırakın.Döllenmeden sonra, yumurta paketlerini dejelly için, bir cam Petri kabına % 3 sistein içeren deniz suyuna yerleştirin ve hafifçe 12 dakika çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Sonra plastik bir pipet ile kümeleri kırmak ve tamamen dejellied kadar başka bir 2-3 dakika boyunca ajitasyon devam. Döllenmiş yumurtaları aynı çanakta 16 derecede veya oda sıcaklığında saklayın.Ertesi gün, el yazmasıaçıklandığı gibi DNA çıkarma tamponu hazırlayın, girdap ile iyice karıştırın ve her tüpe 20 mikrolitre ekleyerek PCR tüpleri içine aliquot. Deniz suyunda % 1 agarose çözün, alt kapsayacak şekilde bir Petri kabına dökün, ve bir jel yatak yapmak için bir tezgah üst üzerinde serin. Jel yatağını tatlı deniz suyuyla kaplayın.24 saatlik döllenme sonrası embriyoları bir pipet kullanarak agarose jel yatak içeren Petri kabına aktarın. Bir ihtiyaç tutucu içine bir tungsten iğne takın ve alkol onun ucunu daldırma ve alkol yakmak için alev yerleştirerek sterilize. Bir diseksiyon mikroskop altında, manipüle edilecek bir embriyo büyüklüğünde yüzey agarose bir parça kaldırmak için tungsten iğne kullanarak agarose bir depresyon yapmak.Sonra, tungsten iğne kullanarak, mikrocerrahi için embriyo hareketini kısıtlamak için aşağı bakan lateral tarafı ile depresyon içine embriyo yerleştirin. Başarılı bir ameliyat yapabilmek için embriyonun hareketini kısıtlamak çok önemlidir. Tungsten iğne ile, cerrahi oral aboral ekseni boyunca aboral doku bir parça kaldırmak, oral blastoporal açılış karşısında bulunan.P20 pipetile izole aboral dokuyu 20 mikrolitre DNA ekstraksiyon tamponu içeren bir PCR tüpüne aktarın. Ameliyat sonrası embriyoyu en az 500 mikrolitre tatlı deniz suyu içeren 24 kuyuluk bir kuyuya aktarın. Ve ameliyat sonrası embriyoiçeren plakayı genotipleme tamamlanana kadar 16 derecede bir kuvöze yerleştirin.Tek embriyolardan genomik DNA elde etmek için, ilk olarak dna çıkarma tamponu ve izole embriyonik dokuları içeren PCR tüplerini mini bir santrifüj kullanarak aşağı doğru döndürün. Daha sonra tüpleri 55 derecede üç saat kuluçkaya yatırın ve hücre kümelerinin dağılmasıve hücre liklerinin arttırılması için her 30 dakikada bir 30 saniye girdap atın. Proteinaz K'yi 4 dakika boyunca 95 santigrat derecede etkisiz hale getirmekten sonra, çıkarı alan çekirgeyi güçlendirmek için şablon olarak çıkarılan genomik DNA'yı kullanarak bir PCR reaksiyonu ayarlayın.Tasarım el yazması açıklandığı gibi astar lar. 20 mikrolitre PCR reaksiyonu ayarlayın. PCR tamamlandıktan sonra, PCR ürünlerinin boyutunu ve varlığını veya yokluğunu belirlemek için agarose jel elektroforezçalıştırın, PCR ürünlerinin beklenen boyutuna bağlı olarak agarose jel elektroforezdurumunu ayarlamak için emin olun.Her ameliyat sonrası embriyoya bir genotip atamak ve embriyoları genotiplerine göre sıralamak için boyutu ve varlığı veya yokluğu veya PCR ürünleri yle ilgili PCR sonuçlarını kullanın. Nematostella genomunda nöropeptid, GLWamide için öncüprotein kodlayan tek bir lokus vardır. Locus'ta üç nakavt mutant alel daha önce bildirilmiştir.A nakavt alel taşıyan heterozigot bir kadın ile C nakavt alel taşıyan heterozigot erkekler arasında f1 çaprazının soyundan gelen rastgele örneklenmiş embriyolardan elde edilen PCR sonuçları farklı genotipler gösterir. Embriyolar bir ve iki a nakavt alel beklenen boyutu karşılık gelen tek bir PCR bant göstermektedir. Embriyolar üç ve altı nakavt aleller A ve C.Embriyolar dört, yedi ve sekiz için beklenen boyutlarda iki PCR bantları göstermek tek bir PCR bant C nakavt alel beklenen boyutuna karşılık gelen gösterir.Embriyo 5 hiçbir bant gösterir, astar bağlama eksikliği düşündüren. Genomik DNA çıkarma arızası olasılığını ekarte etmek için, başka bir PCR vahşi tip diziye bağlanabilen bir ters astar kullanılarak çalıştırıldı. Beklenen boyutta bir PCR ürünü tespit edildiği yerde genomik DNA ekstraksiyonu başarılı oldu.Oysa hiçbir ürün çıkarma da bir hata önerdi. Bu protokol deniz anemon embriyoları için tasarlanmış olsa da, bu yöntemi genomik bilgi ve embriyoların erişebildiği mercanlar ve denizanaları gibi diğer cnidarians'a uygulamak mümkün olabilir. Bu prosedürütaki gelişimsel fenotipi değerlendirmek için tanımlanan mutantlar kullanılır.Örneğin, immünboyama gibi histolojik teknikler morfolojideki kusurları değerlendirmek için kullanılabilirken, yerinde hibridizasyonda, gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR ve RNA-seq gen ekspresyonundaki kusurları değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, canlı görüntüleme larvalar veya erken polipler gibi post-embriyonik gelişim sırasında davranış kusurları değerlendirmek için kullanılabilir.

genotyping-of-sea-anemone-during-early-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Mikroenjeksiyon yumurtalar, embriyo ve çeşitli türlerin hücrelerine DNA yapıları, mRNA, morfolino antisens oligonükleotidler veya diğer tedaviler sunmak için kullanılan bir tekniktir.

Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Amphipod Parhyale hawaiensis kabuklu embriyoloji ve karşılaştırmalı eklembacaklı gelişim ve evrim çalışmaları için umut verici bir model organizmadır. Bu protokol Parhyale erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerin elle çıkarılması için bir yöntem tarif eder.

Amphipod Crustacean Sekiz hücreli embriyolardan Tek Hücre Ablasyon<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Morphant embriyolar üretme yöntemleri gelişim düzenleyici mekanizmalarının ve gen ağları incelemek için gereklidir. Deniz yıldızı Patiria miniata bu çalışmalar için gelişmekte olan bir model sistem. Burada bir embriyo kültürleri, gamet elde üretmek için protokol ve bu türlerden zigot hızlı mikroenjeksiyon sunuyoruz.

Mikroenjeksiyonu Bir Yöntem Patiria Minata Zigotların

Bu protokolün amacı, kullanıcılara Lymnaea stagnalis embriyolarının ve larvalarının yüksek verimli dekapsülasyonu için bir dizi yöntem sağlamaktır.

A Whole Dağı<em&gt; In Situ</emGastropoda yumuşakça için&gt; Hibridizasyon Yöntemi<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

Burada, bir model cnidarian anthozoan olan Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis'te rejenerasyonun nasıl indükleneceğini ve izleneceğini gösteriyoruz.  Morfolojik bir evreleme sistemi kullanarak rejenerasyonun nasıl ampute edileceğini ve kategorize edileceğini gösteriyoruz ve bu sistemi polip yapılarının yenilenmesinde otofaji gereksinimini ortaya çıkarmak için kullanıyoruz.

Starlet Deniz Anemone Aboral physa Tam Polip Regeneration uyaran Nematostella vectensis

Bu video makalede sistematik ve verimli birçok omurgasız embriyolar karmaşık sinyal yolları ve düzenleyici ağları bileşenleri karakterize etmek için kullanılabilir in vivo metodolojisi basit ayrıntıları.

Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar<em&gt; Vivo</em&gt; Karmaşık Hücre-hücre Sinyal Ağ Etkileşimleri incelenmesi için Gelişim Modelleri

Bu iletişim kuralı, parafin içinde gömülü ve cam slaytlar kesitli yetişkin mercan örnekleri in situ hibridizasyon gerçekleştirileceği hedeftir. Bu bir RNA Anti-anlamda prob dokulara parafin katıştırılmış uzamsal ifade görselleştirmek için kullanılan bir nitel yöntemidir.

Situ Parafin gömülü yetişkin mercan örnekleri için hibridizasyon teknikleri

Bu iletişim kuralı embriyonik Astyanax cavefish gen ifadesinde görselleştirme sağlar. Bu yaklaşım belirsiz arka plan boyama en aza indirerek gen ifade sinyal, en üst düzeye çıkarma amacı ile geliştirilmiştir.

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Burada, deniz anemonundan ham zehir ekstraktı elde etmek ve hemolitik ve fosfolipaz aktivitesini tespit etmek için bir protokol tarif ediyoruz.

Deniz Anemonlardan Elde Edilen Ham Ekstraktlarda Hemolitik ve Fosfolipaz Aktivitesinin Basit Biyotahlillerle Tanımlanması

Model organizma Exaiptasia diaphana için histon işareti H3K4me3'e karşı bir kromatin immünopresipitasyon (X-ChIP) testi sunulmuştur. Testin özgüllüğü ve etkinliği, kantitatif PCR ve yeni nesil dizileme ile doğrulanır. Bu protokol, deniz anemonu E. diaphana'daki protein-DNA etkileşimlerinin daha fazla araştırılmasını sağlar.

Cnidarian Model Sisteminde Kromatin İmmünopresipitasyon Ekzaiptazi diafanası

Öğrenin deniz anemonu Nematostella vectensis'i erken embriyonik gelişim sırasında genotipleme yöntemini. Bu teknik, embriyoları öldürmeden mutant fenotipleri belirleyerek gelişim biyolojisi araştırmalarını destekler.

Erken gelişim sırasında deniz anemon Genotipleme

Daha fazla video keşfet