Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken
10 Nisan 2019
Bu iletişim kuralı bir hücre tanıma ve mikrobiyal enfeksiyonlar Gümrükleme ölçmek için yetişkin Drosophila melanogaster içinde vivo fagositoz tahlil açıklar.
Bu in vivo fagositoz tahlili, araştırmacıların yetişkin kan hücrelerinde fagositozdüzenleyen yeni genleri belirlemek için genetik ekranlar ve genom çapında ilişki çalışmaları yürütmek için izin verir. Bu deney niceldir, gerçekleşebilir ve patojen tanıma, alım ve temizliği etkileyen konak faktörleri için canlı hayvanların taranmasına uygulanabilir. Bir iğne çekmeceile ince duvarcam kılcal paralar çektikten sonra, bir mikrometre bir mikroskop altında iğne tutmak için bir mikrometre kullanın ve 100 mikrometre ucu çapı ucu kırmak için beş numara, ince nokta, paslanmaz çelik cımbız kullanın.
Her sinek içine enjekte edilecek sıvı hacmini ölçmek için, PBS steril% 5 gıda boyama ile bir kılcal iğne yük ve 0.01 milimetrelik sahne mikrometre mineral yağ bir damla üzerine sıvı dışarı atmak. Mililitre parçacıkbaşına 10 mikrolitrelik 1.6 miligramı Parafilm'in küçük bir karesine dağıtın ve sıvıyı iğnenin içine çekin. İğneyi enjektör başlığına yerleştirin ve anesteziye dayalı sinekleri sineklikte belirlenen alan boyunca, havalandırma tarafını yukarı, kafaları yastığın önüne doğru yönlendirerek hizaya getirin.
Şişeleri banktaki ilgili alanlara yerleştirin ve toplam 10 nanolitre partikül sağlamak için karının üst köşesindeki sinekleri beş, 100 milisaniyelik sıvı pompalarıyla enjekte edin. Her sinek enjekte edilir gibi uygun şişe içine transfer, şişe üzerinde zaman belirterek. Daha sonra, %0,4 Trypan Blue çözeltisi ile yeni bir iğne yükleyin ve pnömatik enjektörü, sıvıyı iğneden dışarı itmek için sabit bir hava akışını sağlamak için kapılı olarak ayarlayın.
İlk enjeksiyondan 30 dakika sonra, karınlar dolana ve şişmiş olana kadar her sinek karnına Trypan Mavisi enjekte edin. Sinekleri elektrik bandı ile mikroskop kaydıraklarına monte edin, ventral tarafı aşağı, kanatları sineğin kenarına iterek onları banta sabitleyin. Daha sonra, sineğin hareket etmeyeceğine emin olmak için başı yavaşça teybin içine itin.
Hemen sonra tüm sinekler güvenli, görüntü böcekler, birer birer, bir dijital kamera ve bilgisayara bağlı ters floresan mikroskobu üzerinde 25 veya 32 kez büyütme, dijital kamera için bilgisayar yazılımı kullanarak her sinek sırt gemisi odaklanarak. Ardından, pozlama süresini ve deneyler arasındaki büyütmeyi kaydedin. Floresan ölçmek için uygun bir görüntüleme analiz programı açın ve bir görüntü açın.
Sırt damarının floresan yoğunluğunu ölçmek için, sırt damarının etrafına bir poligon çizin ve poligon içindeki floresan yoğunluğunu kaydetmek için Ölçü'ü seçin. Arka plan floresan yoğunluğunu belirlemek için, ilk çokgenkopyalayın ve her sinek sırt damarı bitişik bir alana taşıyın. Ardından, Ölçü'ü seçin ve arka plan alanının floresan yoğunluğunu kaydedin.
Sırt damarı floresansını arka plan floresansı ile normalleştirmek için, sineklerin geri kalanının floresan yoğunluklarını ölçtükten sonra, sırt damarı floresansını arka plan floresansına bölün ve tüm sineklerin ortalama normalleştirilmiş sırt damarı floresan yoğunluğunu tek bir süzme içinde hesaplayın. Bir elektrik bandının üzerine ventral tarafı aşağı monte edildikten sonra, dorsal damarın bulunduğu karının ilk iki bölümü açıkça görülebilir. Deneysel hatanın temel kaynakları prosedürün enjeksiyon ve görüntüleme adımlarında ortaya çıkar.
Birden fazla sinek enjekte etmek için aynı iğneyi kullanmak, sinek dokusu veya parçacıkları ile tıkanmasına neden olabilir. Tüm karın boyunca parlak bir şekilde yeterli Trypan Mavi floresan almayan sinekler, sırt damarının arka plan floresanlarına oranını azaltarak hayvanın gerçek floresan yoğunluk oranını düşürür. Aktif olarak hareket eden sinekler ölçülemeyen bulanık görüntüler ürettiği için, sinekler karbondioksit tarafından hareketsiz hale getirilirken fotoğraflanmalıdır.
Etil metansülfonat ile tedavi sineklerin Zuker koleksiyonundan bir mutant hattı gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerfagositoz ve in vivo fagositoz testi neredeyse hiç dorsal damar floresan görüntüler, izojenik arka plan Zuker suşu ve başka bir ortak laboratuvar kontrol suş eşleştirilmiş. Sineklerin görüntülendiğinde patojen tanıma ve alımının karşılaştırılabilir aşamalarında olduğundan emin olmak için sineklerin enjekte edildiği zamanı ve sırayı takip edin. Fagositik defektlerin altında yatan moleküler mekanizmalar konfokal mikroskopi ile tek hemositler incelenerek veya floresan aktive hücre ayrıştırması sonrası veya erişkin hemositlerin manyetik boncuk izolasyonu ile belirlenebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, mikrobiyal enfeksiyonların fagositi tarafından tanınmasını ve temizlenmesini nicelleştirmek için yetişkin Drosophila melanogaster'de gerçekleştirilen bir in vivo fagositoz analizini tanımlamaktadır. Bu deney niceldir, uygulanması kolaydır ve patojen tanınmasını, alımını ve temizlenmesini etkileyen konak faktörlerini belirlemek amacıyla canlı hayvanların taranmasında kullanılabilir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- İmmünoloji
- Genetik
Arka Plan
- Fagositoz, kritik bir bağışıklık tepkisidir.
- Drosophila melanogaster model bir organizma olarak hizmet eder.
- Fagosit fonksiyonunun anlaşılması, bağışıklık düzenlemesine dair bilgiler sağlayabilir.
- Bu analiz, ilgili genlerin belirlenmesi için genetik taramaları kolaylaştırır.
Çalışmanın Amacı
- Mikrobiyal enfeksiyonlara yanıt olarak fagosit aktivitesini nicelleştirmek.
- Fagositozu düzenleyen yeni genleri tanımlamak.
- Konak-patojen etkileşimleri hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Enjeksiyon için ince duvarlı cam kapillerlerin hazırlanması.
- Sıvı ölçümü için PBS içinde steril gıda boyasının kullanımı.
- Sineklerin içine enjekte edilmek üzere partiküllerin Parafilm üzerine yerleştirilmesi.
- Hassas enjeksiyon için anestezi uygulanmış sineklerin konumlandırılması.
Ana Sonuçlar
- Fagositoz tanıma ve temizleme süreçlerinin başarılı şekilde nicelleştirilmesi.
- Fagositozu etkileyen genetik faktörlerin belirlenmesi.
- Deneyin canlı hayvanlar üzerindeki uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
- İmmün yanıtlar üzerine yapılacak ileri araştırmaların kolaylaştırılması.
Sonuçlar
- In vivo fagositoz testi, araştırmacılar için değerli bir araçtır.
- İmmün fonksiyon üzerindeki genetik etkilerin araştırılmasına olanak tanır.
- Gelecekteki çalışmalar, immünoloji araştırmalarını geliştirmek için bu bulguların üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel İlişkisi
Drosophila melanogaster üzerinde gerçekleştirilen bu in vivo fagositoz testi, konakçı-patojen etkileşimlerini değerlendirmek ve hücresel immünitenin genetik düzenleyicilerini belirlemek için genetik olarak yönetilebilir bir sistem sunar. Nicel ve tekrarlanabilir sonuçları, immünoloji odaklı keşif programlarında erken aşama hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma süreçlerine olanak tanır. Bu test, doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonunda öngörülebilir bir güvenle terapötik hedefleri önceliklendiren tarama çalışmalarını destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Canlı hayvanlarda partikül alımını ve yıkımını nicelendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fagositozu etkileyen yeni genleri tanımlamak için genetik taramalar yoluyla biyolojik risk azaltmayı kolaylaştırır.
- Tahminleyici Değer: Hemosit aktivitesini patojen tanıma ve temizleme mekanizmalarıyla ilişkilendirerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Genetik arka planlar genelinde fagositik etkinliğin standardize edilmiş değerlendirmesine olanak tanıyan kantitatif floresan ölçümleri sağlar.
- Operasyonel Değer: Konak faktörleri için canlı hayvan taramasıyla uyumlu, ölçeklenebilir ve uygulanması kolay bir iş akışı sunar.
- Tekrarlanabilirlik Değeri: Kontrollü partikül dozlaması ve normalize edilmiş dorsal damar floresan yoğunluğu yoluyla tutarlı sonuçlar sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Translasyonel biyobelirteç uyumu ile korunmuş doğal bağışıklık mekanizmalarını incelemek için hastalıkla ilişkili bir sistem sağlar.
- Operasyonel Değer: Fagositoz kusurlarını mutant fenotiplerle ilişkilendirerek risk ayarlı ilerleme kararlarına olanak tanır.
- öngörücü Değer: Patojen alımı ve temizliğini modüle eden genetik faktörleri tanımlayarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz, immünolojide hipotez testlerini ve yolak netleştirmelerini desteklemek amacıyla erken keşif aşamasına konumlandırılmış olup, mikrobiyal klirensi etkileyen konak faktörlerinin genetik taraması yoluyla aday bileşiklerin belirlenmesinde doğrudan fayda sağlamaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Kontrollü koşullar altında Drosophila hemositlerinde partikül alımını ölçerek fagositoz mekanizmalarının hipotez testlerini mümkün kılar.
- Tarama: Patojen tanıma ve alımını etkileyen genetik varyantların değerlendirilmesi için analiz hazırlığı ve kantitatif çıktılar sağlar.
- Analitik: Deney koşulları arasında fagositik aktivitenin karşılaştırılmasına olanak tanıyan normalize edilmiş floresan yoğunluğu okumaları üretir.
- Translasyonel Araştırma: Omurgasızlar ve memeliler arasındaki evrimsel olarak korunmuş immün yolaklardan yararlanarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Genetik olarak işlenebilirliği ve kantitatif tasarımı sayesinde immünoloji hedefleri için yeniden kullanılabilir bir tarama platformu olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hücresel immün yanıtlardaki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamada öngörücü güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Hassas partikül enjeksiyonu ve floresan kantifikasyonu yoluyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: Mutant suşlardaki fagositoz kusurlarının erken tespitini sağlayarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Patojen temizleme verimliliği üzerindeki etkilerine dayanarak hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Drosophila bakımı, mikroenjeksiyon ve floresan mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- Tutarlı partikül iletimi ve tespiti için pnömatik enjektörlere, kapiler iğnelere ve görüntüleme sistemlerine bağımlıdır.
- Tekrarlanabilir görüntüleme sağlamak için sinek immobilizasyonu ve ventral montaj için standartlaştırılmış protokoller gereklidir.
- Deneyin farklı partikül türlerine veya enfeksiyon modellerine genişletilmesi durumunda adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Pratik kısıtlamalar arasında sinek dokusundan kaynaklanan iğne tıkanmaları ve arka plan floresansını etkileyen Trypan Blue enjeksiyonundaki değişkenlikler yer alır.
