Name: Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster'da in vivo fagositoz analizi ile hücresel bağışıklık yanıtını değerlendirmeyi. Bu yöntem mikrop tanıma ve temizleme süreçlerini nicel olarak ölçer ve genetik taramalar için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr Beth Gonzalez ve Dr Aprajita Garg içinde vivo fagositoz deneyleri yürüten destek için teşekkür ederiz. Bir UBV UMD önceden tohum Grant ve UMD NIH T32 eğitim hibeler, hücre ve moleküler biyoloji (SPK) ve ana bilgisayar-patojen etkileşimleri (HPI), bu eser finanse edilmektedir.

1. floresein parçacıklar enjeksiyon için hazırlayın
<ol><li>Piyasada bulunan, ısı-öldürüldü bakterilerin 10 mg sulandırmak floresein ile etiketli parçacıklar ( Tablo malzemelerigörmek) 990 µL steril 1 x PBS ve 10 µL 50 mM sodyum azid ekleyerek 10 mg/mL stok bir konsantrasyon için. Girdap karıştırmak için.<ol>
<li>Tek kullanımlık 8 µL aliquots 0.2 mL tüpler içine bölmek ve 4 ° C'de ışık ilişkili hassasiyeti en aza indirmek için karanlık bir kutu içinde saklayın. Not: Sodyum azid koruyucu isteğe bağlıdır ve 10 mg/mL hisse senetleri 1 mL steril 1 x PBS ile yapılırsa atlanabilir bölünmemeli ve saklı-20 ° C'de</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 mL solüsyon 500 µL filtre şırınga yeşil gıda renklendirme ve 9.5 mL steril 1 x PBS karıştırarak 1 x PBS boyama %5 yiyeceklerin olun.</li>
	<li>Parçacıklar enjeksiyon sodyum azid kaldırmak için önce yıkayın. Mix 42 µL steril 1 x PBS ve 10 mg/ml 1.7 mL tüp içinde 8 µL. Oda sıcaklığında 2.5 min için maksimum hızda santrifüj kapasitesi.<ol>
<li>Süpernatant kaldırmak, oda sıcaklığında 2.5 min için maksimum hızda 50 µL 1 x PBS ve santrifüj ekleyin.</li>
		<li>1.3 1.3.1 aygıtlarından 3 yıkama olmak üzere toplam 2 x.</li>
		<li>Son yıkama sonra süpernatant atın ve parçacıklar 1.6 mg/ml 1 x PBS boyama % 5 yiyecek 50 µL yeniden askıya.</li>
		<li>Tüp ışıktan korumak için alüminyum folyo şal. 4 ° C'de depolayın, 1 hafta sonra atın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. istasyonu ve sinekler hazırlamak
<ol><li>Enjeksiyon pad hazırlayın. Aynı zamanda, bir dikdörtgen CO2 sinek bölmek için kullanım laboratuvar bant Sineklerin Tanrısı 4 genotip 4 bölüme yastık kadar enjekte için. Mikroskop yakındaki bankta bir kez sinekler panelindeki (bir yastık her köşesinde) dizilmiş şişeleri yer alanları belirleyin.</li>
	<li>Şişeleri yaş eşlemeli, 4-7 gün hazırlamak-enjeksiyon için eski, sinekler. Test edilecek her zorlanma için 5 ve 5 erkek hazır sinek gıda taze, etiketli şişe aktarmak ve 25 ° C'de tutmak</li>
	<li>Pnömatik enjektör hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) araç 100 ms (kısa patlamaları sınırdışı sub-nanoliter birimleri teslimini sağlayan sıvı-gaz basıncı) zamanlı moduna ayarlayarak.</li>
	<li>Mikroskop slaytlar hazırlayın. Elektrik bandı 1.5-inç şeritler kesip, yapışkanlı yüzü bir döngü içine katlayın ve etiketli mikroskop slayt yerleştirin.</li>
</ol>3. cam kapiller iğneler hazırlayın
<ol><li>Bir iğne çektirmenin kullanarak cam iğneler (ince duvar cam kılcal) çek.<ol>
<li>İğneyi mikroskop altında bir mikrometre ile tutun ve İpucu #5 para cezası nokta paslanmaz çelik cımbız kullanma kesin. 100 µm ipuçları sinek 's kütikül yaralama en aza indirerek delmek yeterlidir.</li>
		<li>Her sinek enjekte sıvı hacmi ölçmek. İğne steril % 5 Gıda 1 x PBS boyama yükleyin ve sıvı mineral yağ 0,01 mm sahne mikrometre üzerinde bir damla üstüne çıkarmak. Not: sıvı damlacık küresel ise, picoliters birimindeki (boyut)3/1910 hesaplanır. 30 -ecek dışarı atmak bir iğne ile 100 µm çapı ~ 2 nL 100 ms.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. enjekte sinekler
<ol><li>Parafilm küçük bir kare üzerine 1.6 mg/mL parçacıkların 10 µL pipet.<ol>
<li>Sıvı iğne çekin ve mount enjektör meme ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>CO2 sinekli anestezi ve ventral tarafı yukarı ve belgili tanımlık yastık önüne doğru odaklı başkanları ile flypad üzerinde onların belirli alanda sıraya girin. Şişeleri tezgah üzerinde karşılık gelen alanlar yerleştirin.</li>
		<li>Karın üst köşesinde sinekler sıvı (~ 10 nL toplam) 5, 100 ms pompaları ile enjekte.</li>
		<li>Enjekte sinekler için uygun şişeleri aktarmak, şişe üzerinde zaman unutmayın. 25 ° C'de tutmak</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yeni bir iğne % 0,4 ile yük Trypan mavi çözüm.</li>
	<li>Pnömatik enjektör hava sıvı iğne dışarı itmek için sürekli bir akış sağlayan geçişli, ayarlayın.</li>
	<li>Onlar için 30 dk dinlenmiş sonra sinekler anestezi ve karın tam ve şişmiş olana Trypan mavi ile enjekte. Not: phagosome olgunlaşma ile pH duyarlı boya etiketli parçacıkları ile incelerken, sinekler için 1 h dinlenmek izin ve trypan montaj sinekler daha önce mavi ile enjekte değil.</li>
	<li>Mount mikroskop kaymak ile elektrik bandı, ventral taraftan uçar. Kanatları anında tarafındaki bastırın ve onları teybe güvenli. Ayrıca, anında hareket emin olmak için teyp baş yavaşça itin.</li>
	<li>Hemen adım 5'e taşıyın.</li>
</ol>5. görüntüleme uçar
<ol><li>Görüntü uçar, tek bir seferde, 25 x veya 32 x büyütme ( Tablo malzemelerigörmek) bir dijital fotoğraf makinesi ve bilgisayar bağlı bir ters floresan mikroskop kullanarak. Dijital fotoğraf makinesi için bilgisayar yazılımı kullanarak anında dorsal gemi odaklanmak.</li>
	<li>Çekim hızı ve büyütme deneyler arasında kaydedin. Not: genotip mefhumunu kaybetme bir potansiyel hata birden fazla suşları tek bir oturuşta çekerken kaynağıdır. Sinekler mislabeling önlemek için ilk ve son uç fotoğraf her genotip için görüntü sayısını not edin.</li>
</ol>6. miktarının ve floresan normalleştirme
<ol><li>Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın ve bir anda bir resim açın.<ol>
<li>Dorsal gemi Floresans yoğunluğunu ölçmek. Dorsal geminin bir çokgen çizer. Ölçü birimi seçin ve floresan yoğunluğu çokgen içinde kaydedin.</li>
		<li>Arka plan floresan yoğunluğu belirlemek. İlk çokgen kopyalama ve taşıma bir alana anında dorsal gemiye bitişik. Ölçü ve kayıt floresan yoğunluğu arka plan alanını seçin.</li>
		<li>Dorsal gemi floresan arka plan Floresans tarafından normalize: Dorsal gemi ÷ arka plan.</li>
		<li>Ortalama bir yük tüm sinekli dorsal gemi floresan yoğunluğu normalleştirilmiş hesaplayın.</li>
		<li>2 kez daha denemeyi tekrarlamak.</li>
		<li>Kullanım bir öğrenci unpaired t-test ortalama göreli Floresans yoğunluklarda kontrol uçar karşılaştırın ve test için üç deneylerden uçar. Formülü kullanarak etkisi boyutu Hesapla: Cohen'in d nerede M1 genotip 1 ortalaması ve M2 genotip 2 ortalaması (M1- M2) ÷ SDhavuza alınan, = &amp; SD havuza alınan =<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59543/59543eq1.jpg"> Burada SD1 genotip 1 standart sapmasıdır ve SD2 genotip 2 standart sapmasıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+recognition+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li>
<li>Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+host-pathogen+interactions+and+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).</li>
<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).</li>
<li>Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Immunity%3A+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).</li>
<li>De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toll+and+Imd+pathways+are+the+major+regulators+of+the+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila.</a> EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).</li>
<li>Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Toll+is+activated+by+Gram-positive+bacteria+through+a+circulating+peptidoglycan+recognition+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein.</a> Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).</li>
<li>Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+a+peptidoglycan+recognition+protein+%28PGRP%29+in+Relish+activation+and+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Science. 296 (5566), 359-362 (2002).</li>
<li>Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ird1+is+a+Vps15+homologue+important+for+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).</li>
<li>Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsoventral+regulatory+gene+cassette+spatzle%2FToll%2Fcactus+controls+the+potent+antifungal+response+in+Drosophila+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults.</a> Cell. 86 (6), 973-983 (1996).</li>
<li>Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toll+pathway+is+important+for+an+antiviral+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).</li>
<li>Lemaitre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recessive+mutation%2C+immune+deficiency+%28imd%29%2C+defines+two+distinct+control+pathways+in+the+Drosophila+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).</li>
<li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).</li>
<li>Meister, M., Lagueux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophilablood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophilablood cells.</a> Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Anderson, R. A., Sando, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+human+lysosomal+acid+lipase%2Fcholesteryl+ester+hydrolase.+Similarities+to+gastric+and+lingual+lipases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).</li>
<li>Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+cytoskeleton+association+with+CR3+and+CR4+regulates+receptor+mobility+and+phagocytosis+of+iC3b-opsonized+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).</li>
<li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10, 781-784 (2000).</li>
<li>Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Scavenger+Receptor+CI+Is+a+Pattern+Recognition+Receptor+for+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria.</a> Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).</li>
<li>Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li>
<li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309, 1251-1253 (2005).</li>
<li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).</li>
<li>Stuart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+Staphylococcus+aureus+requires+CD36-mediated+phagocytosis+triggered+by+the+COOH-terminal+cytoplasmic+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain.</a> Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).</li>
<li>Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Drosophila+gene+products+required+for+phagocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Biology. 4 (1), e4(2006).</li>
<li>Kocks, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eater%2C+a+transmembrane+protein+mediating+phagocytosis+of+bacterial+pathogens+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila.</a> Cell. 123 (2), 335-346 (2005).</li>
<li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+the+cellular+and+humoral+responses+in+the+Drosophila+host+defense+against+three+gram-positive+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections.</a> PLoS One. 6 (3), e14743(2011).</li>
<li>Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peptidoglycan+recognition+protein+PGRP-SC1a+is+essential+for+Toll+signaling+and+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).</li>
<li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li>
<li>Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glutamate-dependent+redox+system+in+blood+cells+is+integral+for+phagocytosis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).</li>
<li>Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Splicing+Factor+RNA-Binding+Fox+Protein+1+Mediates+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+%28Baltimore%2C+Md%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).</li>
<li>Guille, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuille%2C+M+%22Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+and+Zebrafish%22">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish</a>. , Springer Science & Business Media. (1999).</li>
<li>Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zuker+collection%3A+a+resource+for+the+analysis+of+autosomal+gene+function+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).</li>
<li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li>
<li>Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psidin+is+required+in+Drosophila+blood+cells+for+both+phagocytic+degradation+and+immune+activation+of+the+fat+body%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body.</a> Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).</li>
<li>Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+full-of-bacteria+gene+is+required+for+phagosome+maturation+during+immune+defense+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Piyasada bulunan, fluorescently etiketli parçacıklar fagositoz genel (0.2 µm karboksilat-modified mikroküreler) veya fagositoz mikroplar (fluorescently etiketli ısı - veya kimyasal olarak öldürdü bakteri veya Maya) değerlendirmek için kullanılır. Phagosome olgunlaşma değerlendirmek için araştırmacılar pH nötr asidik olduğu gibi phagolysosome inerse fluoresces pH duyarlı boya ile etiketli parçacıklar seçebilirsiniz. Alternatif olarak, fagositoz, patojen tanıma ve alımı ilk adımları incelemek için araştırmacıl...

Doğuştan gelen bağışıklık savunma patojenik mikroplar karşı savunma ilk satırı oluşturur. Bu yanıtları ikisi de moleküler desenleri (PAMPs) patojen ilişkili1anlamda germline kodlanmış desen tanıma reseptörleri tarafından (PRRs) aracılı humoral ve hücresel doğuştan gelen bağışıklık işlevsel olarak ayrılabilir. Memeliler ve omurgasızlar, Yuvarlak solucanlar, Caenorhabditis elegans ve meyve sineği Drosophila melanogaster2gibi birçok sinyal yollar ve doğuştan gelen bağışıklık efektör mekanizmaları korunmuş. Meyve sineği bulaşıcı mikroorganizmaların3karşı ana savunma eğitim için güçlü bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila kolay ve ucuz laboratuvarlarda, yetiştirilen genetik olarak uysal ve kısa oluşturma süresi vardır. Ayrıca, meyve sineği mikroplar, ana bilgisayar dokunulmazlık viral, bakteriyel, mantar veya parazit patojenlere karşı incelenmesi etkinleştirme bir dizi karşı son derece etkili savunma sergiler.
Drosophila immunologists tarihsel olarak ileri genetik ekranlar, böcek hücre satırları filtreleme ve doğuştan gelen bağışıklık-önde gelen incelemek için sinek mutant suşları önceden varolan genom çapında RNA-aracılı girişim (RNAi) kullanılan kimlik ve karakterizasyonu birkaç örümceklerle korunmuş humoral bağışıklık yolları4,5,6,7,8. Humoral doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, tartışmalı, en iyi meyve sinekleri bağışıklık savunma ile karakterizedir. Enfeksiyon, humoral yanıt üretim ve antimikrobiyal peptid sistemik sürümü (AMP) molekülleri içine hemolymph, kan içinde böcekler eşdeğer yol açar. Amper son derece korunmuş otoyol ve yolları sinyal IMD tarafından üretilmektedir. Toll yolu, sinyal memeli için homolog TLR/IL-1R reseptör ve IMD yolu memeli tümör nekrozis faktör-Alfa sinyal için homolog. Drosophila, otoyol sinyal gram-pozitif bakteriler, mantarlar ve Drosophila X virus6,9,10 tarafından indüklenen olduğu ve IMD sinyal Ayagin Gram-negatif bakteriler11 tarafından indüklenen ,12.
Hücresel bağışıklık, kapsülleme, melanization ve fagositoz invaziv patojenlerin oluşan özel kan hemocytes13denilen hücreler tarafından yürütülmektedir. Hemocytes meyve sineği içinde üç sınıf vardır: Kristal hücreleri, lamellocytes ve plasmatocytes13. Larva dolaşımdaki hemocytes % 5 makyaj, kristal hücrelerin patojenler ve ana bilgisayar doku yara sitelerdeki melanization önde gelen proPhenoloxidase (proPO) enzimler serbest bırakın. Normalde sağlıklı embriyo veya larva bulunmayan, Lamellocytes yabancı nesneler kapsülleyen yapisan hücrelerdir. Bu hücreler üzerine pupariation veya parasitizing arı yumurta larva yatırılan zaman indüklenir. Larva hemocytes ve tüm kalan hemocytes erişkinlerde dolaşan % 95 makyaj, fagositik plasmatocytes geliştirme sırasında remodeling doku bir rol oynamaktadır ve özellikle, Drosophila hücresel bağışıklık ana efektör hücresi olarak hizmet vermektedir.
Fagositoz bir acil ve çok önemli savunma hattı, doğuştan gelen bağışıklık; ana bilgisayar epitel bariyeri mikroplar hızlı bir şekilde sardı ve fagositik kan hücreleri tarafından elimine (hücre biyolojisi fagositoz, kapsamlı bir inceleme için bkz: başvuru 14). Germline kodlanmış örüntü tanıma reseptörleri (PRRs) hemocytes tarihinde patojen tanıması mikroplar moleküler desenleri (PAMPs) ilişkili zaman bu işlemi başlatılır. Bir kez hedeflerine bağlı, PRRs aktin sitoiskeleti remodeling aracılığıyla pseudopods oluşumu neden sinyal cascades başlatın. Pseudopods hangi daha sonra sardı ve doğmakta olan organel, phagosome içselleştirilmiş mikrop, surround. Phagosome hemocyte iç doğru insan ticareti ve etkileşimleri organellerin ile bir dizi acidifies phagosome phagosome olgunlaşma süreci uğrar gibi mikropların yok edilir. Vitro ve hücre memeli Primer hücre biyolojisi çalışmalarında ve fagositoz, memeli Fc-gama reseptör ve C3b reseptörleri15,16gibi düzenleyen faktörler karakterize vesile olmuştur. Yine de, büyük ölçekli ekranları veya içinde vivo çalışmalar yürütme yeteneğini memeli sistemlerinde sınırlıdır.
Burada içinde vivo bir tahlil için ilk David Schneider laboratuvarda 200017tarafından tanıtılan bir yordam temel fagositoz yetişkin meyve sinekleri içinde mevcut. Schneider laboratuvar sesil hemocytes karın sırt gemi kolayca kümelenmiş polistren boncuk ve bakteri phagocytose gösterdi. Fagositoz görselleştirmek için sinekler (örneğin floresein isothiocyanate ile (E. coli -FITC) etiketli E. coli ), fluorescently etiketli parçacıkları ile enjekte edilir parçacıkları, yutmak için hemocytes zaman izin vermek 30 dakika boyunca inkübe ve sonra Kuluçka döneminde değil fagosite parçacıklar Floresans quenches trypan mavi, enjekte. Sinek dorsal damarları sonra ters bir floresan mikroskop kullanarak yansıma. Seminal bu kağıt hemocytes bakteri phagocytose ve lateks boncuklar, bu bakteri fagositoz önceden enjekte edilerek inhibe olabilir gösterdi nispeten basit bir deney kullanarak lateks boncuk ile gider ve bu hem hücresel ve humoral olmadan uçar bağışıklık yanıtı bile E. coliiçin açıktır. Bu raporda sunulan tahlil içinde vivo fagositoz dorsal gemi ilişkili hemocytes tarafından yuttu parçacıklar floresan yoğunluğu ölçme ölçmek için Schneider laboratuvar çalışmalarını kurar.
Benzer şekilde yaklaşım memeli sistemlerinde alınan, Drosophila genetikçileri başlangıçta genom genelinde kullanılan tüp bebek RNAi ekranlar hücresel immün yanıt18,19için,20 gerekli genlerin tanımlamak için ,21,22,23. Ancak, Yetişkin içinde vivo fagositoz tahlil gelişimi izleme denemeleri kolayca böylece biyolojik doğrulamak için araştırmacılar içinde vitro çalışmalarda tespit faktörler rol izin tüm hayvanlarda gerçekleştirilebilmesi etkin. Böyle transmembran reseptör yiyen, ilk24 S2 kullanarak bir RNAi ekranında bakteriyel bir reseptör hücreleri olarak tanımlanan ve Escherichia coli (e.coli), enterokok arabuluculuk için daha sonra gösterilen olduğu faecalistir, ve Staphylococcus aureus (S. aureus) fagositoz yetişkin25.
Laboratuarımızın içinde vivo fagositoz tahlil ileri genetik ekranlar ve genom çapında dernek çalışmaları ( Drosophila genetik başvuru Masası (DGRP) kullanarak) Yetişkin hemocytes fagositoz düzenleyen yeni genlerin tanımlamak için istihdam. Bu çalışmalar için karakterizasyonu reseptörleri PGRP-SC1A ve PGRP-SA26, protein Rab1427, Glutamat ışınlama Polyphemus28ve RNA-bağlayıcı protein Fox-129kaçakçılığı hücre içi vezikül yol açtı.
Biz gelecekte ekranlar içinde vivo fagositoz birleşmeyle Drosophilahücresel bağışıklık yanıtında için önemli ek genler tanımlaması yol açabileceğini tahmin. DGRP veya Drosophila sentetik nüfus kaynak (DSPR), gibi tam olarak sıralı doğuştan hatlarını kullanarak ekranlar fagositoz ya da hemocyte geliştirme etkileyen doğal türevleri tanımlayabilirsiniz. Ayrıca, teknik Drosophila diğer türler içinde kabul veya olabilir ekran yeni topluluk kaynaklarına, ulusal Drosophila tür stok Merkezi (NDSSC tarafından tutulan 250 Drosophila türler topluluğu gibi kullanılan ) Cornell'de. Bu deneyler ticari olarak kullanılabilir fluorescently etiketli bakteri veya duvar mantar bioparticles kullanarak yürütülen olabilir veya bakteriyel veya mantar türleri-mikrop floresan işaretleri ifade sağlanan herhangi bir sayıda kullanarak yapılamaz .

<table><tbody><tr><td>0.2&mu; m Kırmızı Floresan Karboksilat Modifiye FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>Fagositlerin genel fagositik kapasitesini test etmek için floresan etiketli lateks boncuklar. (~580/~605 nm) PBS'de% 5 boya ile 1:20 oranında seyreltme enjekte edin.</td></tr><tr><td>5430-10 PicoNozzle Kiti</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>5430-10</td><td>1.0mm pipet</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 Suşu) için Tutucu Biyopartiküller, Alexa Fluor 488 konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>E13231</td><td>Öldürüldü E. coli Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiştir. Gram negatif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~495/~519 nm)</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 Suşu) Biyopartiküller, Alexa Fluor 594 konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>E23370</td><td>Öldürüldü E. coli Alexa Fluor 594 ile etiketlenmiştir. Gram negatif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~590/~617 nm)</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 Suşu) Biyopartiküller, Floresein konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>E2861</td><td>Öldürülmüş E. coli FITC (Floresein) ile etiketlenmiştir. Gram negatif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~494/~518 nm)</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 Suşu) Biyopartiküller, Teksas Kırmızısı konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>Öldürüldü E. coli Texas Red ile etiketlendi. Gram negatif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~595/~615 nm)</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 Suşu) Biyopartiküller, Teksas Kırmızısı konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>Öldürüldü E. coli Texas Red ile etiketlendi. Gram negatif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~595/~615 nm)</td></tr><tr><td>İğne Pipet Çektirme</td><td>David Kopf Aletleri</td><td>Model 725</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red Fagositoz için E. coli BioParticles Konjugatı</td><td>Invitrogen</td><td>P35361</td><td>Öldürüldü E. coli pHrodo Red ile etiketlenmiştir. Gram negatif bakterilerin fagosit reconition'ını, alımını ve fagozom olgunlaşmasını test etmek için kullanın. (~560/~585 nm). Trypan Blue ile söndürmeye gerek yok.</td></tr><tr><td>pHrodo Red S. aureus Fagositoz için Biyopartiküller Konjugatı</td><td>Invitrogen</td><td>A10010</td><td>Öldürüldü S. aureus pHrodo Red ile etiketlenmiştir. Gram pozitif bakterilerin fagosit reconition'ını, alımını ve fagozom olgunlaşmasını test etmek için kullanın. (~560/~585 nm). Trypan Blue ile söndürmeye gerek yok.</td></tr><tr><td>Pnömatik PicoPump PV820</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>SYS-PV820</td><td>Dünya Hassas Aletler Pnömatik PicoPump PV820, enjeksiyonlar arasında cam iğnede sıvıyı tutmak için diferansiyel basınçlar kullanır. Kullanıcı, sıvıyı dışarı atmak için kısa gaz basıncı patlamalarını manuel olarak kontrol eder &ndash; nanolitre altı hacimlerin verilmesine izin verir. Verilen sıvı miktarı iki ana değişkene bağlıdır &ndash; Cam iğne açıklığının büyüklüğü ve enjeksiyon basıncının uygulanma süresi ne kadardır. cihazı 100 ms'ye ayarlayın " ZAMANLANMIŞ" mod.</td></tr><tr><td>S. aureus (Protein A'sız Ahşap Suşu) Biyopartiküller, Alexa Fluor 488 konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>S23371</td><td>Öldürüldü S. aureus Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiştir. Gram pozitif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~495/~519 nm)</td></tr><tr><td>S. aureus (Protein A içermeyen Ahşap Suşu) Biyopartiküller, Alexa Fluor 594 konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>S23372</td><td>Öldürüldü S. aureus Alexa Fluor 594 ile etiketlenmiştir. Gram pozitif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~590/~617 nm)</td></tr><tr><td>S. aureus (Protein A'sız Ahşap Suşu) Biyopartiküller, Floresein konjugatı</td><td>Invitrogen</td><td>E2851</td><td>Öldürüldü S. aureus FITC (Floresein) ile etiketlenmiştir. Gram pozitif bakterilerin fagosit tanımayı ve alımını test etmek için kullanın. (~494/~518 nm)</td></tr><tr><td>İnce Duvar Cam Kılcal Damarlar</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>TW100F-3</td><td>Enjeksiyon için İğneler. OD = 1.0 mm</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi (% 0.4)</td> <td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Floresein, Alexa Fluor veya Texas Red etiketli parçacıkların hücre dışı floresansını söndürmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>ZEISS SteREO Mikroskop (Discovery.V8)</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Sinekleri görüntülemek için ters floresan mikroskobu. Fotoğraf çekmek için bir dijital kamera (örn.ample: AxioCam HC kamera) ve beraberindeki yazılımı (örn.ample: AxioVision 4.7 yazılımı) kullanın.</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioPartiküller, Alexa Fluor 488 konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>Z23373</td><td>Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiş öldürüldü. Fagosit tanıma ve maya alımını test etmek için kullanın. (~495/~519 nm)</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioPartiküller, Alexa Fluor 594 konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>Z23374</td><td>Alexa Fluor 594 ile etiketlenmiş öldürüldü. Fagosit tanıma ve maya alımını test etmek için kullanın. (~590/~617 nm)</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) Biyopartiküller, Floresein konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>Z2841</td><td>FITC (Fluorescein) ile etiketlenmiş olarak öldürüldü. Fagosit tanıma ve maya alımını test etmek için kullanın. (~494/~518 nm)</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioPartiküller, Texas Red</td><td>Invitrogen</td><td>Z2843</td><td>Texas Red ile etiketlenmiş olarak öldürüldü. Fagosit tanıma ve maya alımını test etmek için kullanın. (~595/~615 nm)</td></tr></tbody></table>

bir in vivo fagositoz tahlil kullanarak drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Bütün hayvanlarda doğuştan gelen bağışıklık patojenler geniş bir yelpazede karşı acil ve sağlam bir savunma sağlar. Humoral ve hücresel immün yanıt-e doğru doğuştan gelen bağışıklık ana dallar ve birçok bu yanıtları düzenleyen etkenler örümceklerle omurgasızlar ve memeliler arasında korunmuş. Fagositoz, Merkezi bileşeni hücresel doğuştan gelen bağışıklık, bağışıklık sisteminin özel kan hücreleri tarafından yapılır. Meyve sineği Drosophila melanogaster, moleküler mekanizmaları ve fagositoz bütün hayvanlarda fizyolojik etkilerini araştırmak için güçlü bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Burada parçacık alımı ve imha Drosophila kan hücreleri, hemocytes tarafından ölçmek için bir enjeksiyon tabanlı içinde vivo fagositoz tahlil göstermektedir. Yordamı araştırmacılar tam parçacık konsantrasyonu ve doz, son derece tekrarlanabilir sonuçlar kısa bir miktarda elde etmek mümkün hale kontrolü sağlar. Deneme nicel, gerçekleştirmek, kolay ve ana faktörler için ekran o etkisi patojen tanıma, alımı ve izni için uygulanabilir.

Fluoresein etiketli parçacıkları kullanma içinde vivo fagositoz testin bir şematik şekil 1Aile gösterilir. Sinekler takılı ventral yan aşağı Elektrik bandı bir parçası üzerinde ve dorsal gemi konumlandırıldığı, karın, ilk iki kesimi açıkça görülebilir (şekil 1B). Anahtar kaynakları deneysel hata enjeksiyon ve yordamın (şekil 1 c) adımını Imaging ortaya. Birden çok sinekler enjekte etmek için aynı iğn...

Bu iletişim kuralı bir hücre tanıma ve mikrobiyal enfeksiyonlar Gümrükleme ölçmek için yetişkin Drosophila melanogaster içinde vivo fagositoz tahlil açıklar.

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Bu in vivo fagositoz tahlili, araştırmacıların yetişkin kan hücrelerinde fagositozdüzenleyen yeni genleri belirlemek için genetik ekranlar ve genom çapında ilişki çalışmaları yürütmek için izin verir. Bu deney niceldir, gerçekleşebilir ve patojen tanıma, alım ve temizliği etkileyen konak faktörleri için canlı hayvanların taranmasına uygulanabilir. Bir iğne çekmeceile ince duvarcam kılcal paralar çektikten sonra, bir mikrometre bir mikroskop altında iğne tutmak için bir mikrometre kullanın ve 100 mikrometre ucu çapı ucu kırmak için beş numara, ince nokta, paslanmaz çelik cımbız kullanın.Her sinek içine enjekte edilecek sıvı hacmini ölçmek için, PBS steril% 5 gıda boyama ile bir kılcal iğne yük ve 0.01 milimetrelik sahne mikrometre mineral yağ bir damla üzerine sıvı dışarı atmak. Mililitre parçacıkbaşına 10 mikrolitrelik 1.6 miligramı Parafilm'in küçük bir karesine dağıtın ve sıvıyı iğnenin içine çekin. İğneyi enjektör başlığına yerleştirin ve anesteziye dayalı sinekleri sineklikte belirlenen alan boyunca, havalandırma tarafını yukarı, kafaları yastığın önüne doğru yönlendirerek hizaya getirin.Şişeleri banktaki ilgili alanlara yerleştirin ve toplam 10 nanolitre partikül sağlamak için karının üst köşesindeki sinekleri beş, 100 milisaniyelik sıvı pompalarıyla enjekte edin. Her sinek enjekte edilir gibi uygun şişe içine transfer, şişe üzerinde zaman belirterek. Daha sonra, %0,4 Trypan Blue çözeltisi ile yeni bir iğne yükleyin ve pnömatik enjektörü, sıvıyı iğneden dışarı itmek için sabit bir hava akışını sağlamak için kapılı olarak ayarlayın.İlk enjeksiyondan 30 dakika sonra, karınlar dolana ve şişmiş olana kadar her sinek karnına Trypan Mavisi enjekte edin. Sinekleri elektrik bandı ile mikroskop kaydıraklarına monte edin, ventral tarafı aşağı, kanatları sineğin kenarına iterek onları banta sabitleyin. Daha sonra, sineğin hareket etmeyeceğine emin olmak için başı yavaşça teybin içine itin.Hemen sonra tüm sinekler güvenli, görüntü böcekler, birer birer, bir dijital kamera ve bilgisayara bağlı ters floresan mikroskobu üzerinde 25 veya 32 kez büyütme, dijital kamera için bilgisayar yazılımı kullanarak her sinek sırt gemisi odaklanarak. Ardından, pozlama süresini ve deneyler arasındaki büyütmeyi kaydedin. Floresan ölçmek için uygun bir görüntüleme analiz programı açın ve bir görüntü açın.Sırt damarının floresan yoğunluğunu ölçmek için, sırt damarının etrafına bir poligon çizin ve poligon içindeki floresan yoğunluğunu kaydetmek için Ölçü'ü seçin. Arka plan floresan yoğunluğunu belirlemek için, ilk çokgenkopyalayın ve her sinek sırt damarı bitişik bir alana taşıyın. Ardından, Ölçü'ü seçin ve arka plan alanının floresan yoğunluğunu kaydedin.Sırt damarı floresansını arka plan floresansı ile normalleştirmek için, sineklerin geri kalanının floresan yoğunluklarını ölçtükten sonra, sırt damarı floresansını arka plan floresansına bölün ve tüm sineklerin ortalama normalleştirilmiş sırt damarı floresan yoğunluğunu tek bir süzme içinde hesaplayın. Bir elektrik bandının üzerine ventral tarafı aşağı monte edildikten sonra, dorsal damarın bulunduğu karının ilk iki bölümü açıkça görülebilir. Deneysel hatanın temel kaynakları prosedürün enjeksiyon ve görüntüleme adımlarında ortaya çıkar.Birden fazla sinek enjekte etmek için aynı iğneyi kullanmak, sinek dokusu veya parçacıkları ile tıkanmasına neden olabilir. Tüm karın boyunca parlak bir şekilde yeterli Trypan Mavi floresan almayan sinekler, sırt damarının arka plan floresanlarına oranını azaltarak hayvanın gerçek floresan yoğunluk oranını düşürür. Aktif olarak hareket eden sinekler ölçülemeyen bulanık görüntüler ürettiği için, sinekler karbondioksit tarafından hareketsiz hale getirilirken fotoğraflanmalıdır.Etil metansülfonat ile tedavi sineklerin Zuker koleksiyonundan bir mutant hattı gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerfagositoz ve in vivo fagositoz testi neredeyse hiç dorsal damar floresan görüntüler, izojenik arka plan Zuker suşu ve başka bir ortak laboratuvar kontrol suş eşleştirilmiş. Sineklerin görüntülendiğinde patojen tanıma ve alımının karşılaştırılabilir aşamalarında olduğundan emin olmak için sineklerin enjekte edildiği zamanı ve sırayı takip edin. Fagositik defektlerin altında yatan moleküler mekanizmalar konfokal mikroskopi ile tek hemositler incelenerek veya floresan aktive hücre ayrıştırması sonrası veya erişkin hemositlerin manyetik boncuk izolasyonu ile belirlenebilir.

assessing-cellular-immune-response-fruit-fly-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Immün yanıt ve davranış arasındaki bağlantıyı anlamak için, lokomotor davranışları ölçmek için bir yöntem...

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

Bu video, canlı yetişkin sineklerin enjeksiyonunun nasıl gerçekleştirileceğini açıklar ve fagositozu test etmek için etiketli parçacıkların ve tripan mavisinin sinek karınlarına enjekte edildiği örnek bir protokol içerir.

Yetişkin Drosophila Sineklerinin Enjeksiyonu: Bir Bileşik veya Etiket Dağıtım Yöntemi

Bu video, Drosophila melanogaster'in homojenize embriyonik hücrelerinde apoptotik hücre yutulmasını görselleştirmek için bir immün boyama tekniğini göstermektedir. Bu yöntem, apoptotik hücre yutulmasının derecesini belirleyerek hücresel fizyoloji hakkında bilgi sağlar.

Fagositoz Testi: Drosophila melanogaster'in Embriyonik Hücrelerinde Apoptotik Hücre Yutulmasını Görselleştirmek İçin Bir İmmün Boyama Tekniği

Bu video, yetişkin Drosophila sineklerinde bakteriyel fagositozu ölçmek için tasarlanmış bir in vivo testi göstermektedir. Floresan işaretli bakterilerin yetişkin sineklerin karnına enjekte edilmesini takiben, sırt damarı ile ilişkili hemositler fagositoza girer. Tripan mavisi boyanın eklenmesi, hücre dışı, fagositozlu olmayan bakteriler tarafından yayılan floresanı söndürmeye hizmet eder. Bu su verme işlemi, bir floresan mikroskobu altında gözlemlendiğinde fagositozlu bakterilerin...

Yetişkin Drosophila Sineklerinde Bakteriyel Fagositozu Ölçmek için İn Vivo Bir Test

Drosophila melanogaster, doğuştan gelen bağışıklık sistemlerini ve enfeksiyon ve hastalığın fizyolojik sonuçlarını incelemek için olağanüstü bir model organizmadır. Bu protokol, D. melanogaster'e sağlam ve kantitatif olarak tekrarlanabilir bakteriyel enfeksiyonların nasıl sağlanacağını ve daha sonra enfeksiyon şiddetinin nasıl ölçüleceğini ve konak immün yanıtının nasıl ölçüleceğini açıklar.

Sistemik Bakteriyel Enfeksiyon ve Bağışıklık Savunma FENOTİPİ içinde<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila kan hücreleri veya hemositler, yerleşik bölgeler ve dolaşım arasında döngü yapar.  Larvada, yerleşik (sapsız) hemositler indüktif mikro ortamlara, Hematopoetik Ceplere lokalize olurken, dolaşımdaki hemositler hemolenf içinde serbestçe hareket eder. Bu protokolün amacı, davranışsal olarak farklı ancak birbirini değiştiren bu iki hemosit popülasyonunun standartlaştırılmış izolasyonu ve miktarının belirlenmesidir.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

CApillary FEeder (CAFE) testi, gıda alımının altında yatan mekanizmaları araştırmak için basit, bütçe dostu, son derece güvenilir bir yöntemdir. Çok yönlü genetik model organizma Drosophila melanogaster ile birlikte kullanıldığında, gıda alımının düzenleyici mekanizmaları hakkında yeni bilgiler edinmenin güçlü bir yolunu sunar.

Kılcal Besleyici Testi Gıda Alımını içinde Tedbirler<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila'nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır.

Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi Drosophila

Bu yöntem, patojen işgali üç boyutlu (3D) modelleri ile böcek hücreye görselleştirmek gösterilmiştir. Hemocytes Drosophila larvaları üzerinden viral veya bakteriyel patojenler, ex vivo veya vivo içindeile bulaşmış. Virüslü hemocytes daha sonra sabit ve görüntüleme için bir confocal mikroskop ve sonraki 3D hücresel yeniden yapılanma ile lekeli.

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

Bu protokol, genç ve yaşlı Drosophila melanogaster hemositlerin fagositoz bakterilere yeteneğini değerlendirmek ve ölçmek için kullanılan fagositozun in vivo testinitanımlar.

Erişkin Drosophila melanogaster Hemositlerin Yaşa Özgü Fagositik Yeteneğinin In Vivo Fagositoz Islımı Ile Değerlendirilmesi

Bu protokol, kimyasal toksik maddelerin yetişkin Drosophila melanogaster'in yaşayabilirliği üzerindeki etkilerini değerlendirmek için sıvı ortam kullanan verimli ve ucuz bir yöntemi tanımlamaktadır.

Erişkin Drosophila Melanogaster'de Kimyasal Toksisitenin Değerlendirilmesi

Öğrenin Drosophila melanogaster'da in vivo fagositoz analizi ile hücresel bağışıklık yanıtını değerlendirmeyi. Bu yöntem mikrop tanıma ve temizleme süreçlerini nicel olarak ölçer ve genetik taramalar için uygundur.

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

Daha fazla video keşfet