Name: Organoids fare Extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Keşfedin, ekstrahepatik safra kanalından izole edilen hücrelerle fare kökenli organoid kültürü oluşturma yöntemini. Bu teknik, kolangiyosit biyolojisi ve doku rejenerasyonu çalışmaları için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser çalışma karaciğer hastalıkları Pinnacle Ödülü (için N.R.) ve ulusal sağlık enstitüleri, diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim için Amerikan Derneği ve böbrek hastalıkları (P30 DK34933 N.R., P01 DK062041 J.L.M. için Ödülleri) tarafından desteklenmiştir. Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (Michigan Üniversitesi) geliştirme Bu metodoloji ile onun yardım için teşekkür.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), The University of Michigan tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlanması fare EHBD yalıtım için malzeme ve tesisatlar
<ol><li>Tohumlama orta ve çamaşır arabellek (Tablo reçetesi) 50 mL konik tüpler hazırlamak ve kadar kullanmak 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Bir cerrahi masa (şekil 1B) kurun. Steril cerrahi aletler (şekil 1 c) hazırlayın.</li>
	<li>Steril bir 24-şey plaka önceden ısıtmak için 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesine koyun.</li>
	<li>Bir aliquot Bodrum matris Buza koyun. Sadece tamamen sıvılaşmış Bodrum matris kullanın.</li>
</ol>2. EHBD yalıtım ve safra Organoid kültür
<ol><li>
Yalıtım ve fare EHBD bir tek hücre süspansiyon hazırlanması
	<ol>
<li>Bir yetişkin fare (2 aydan daha eski) kurumsal esaslarına göre ötenazi. Fare sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Karın boşluğu bir orta hat yaklaşım kullanarak açın ve diyafram üzerinde dinlenmek için karaciğer geri çek.</li>
		<li>Hemen bir hemostat ile proksimal duodenum hafifçe çekerek karaciğer hilus bulunan ortak safra kanalını tanımlar. EHBD bir neşter bıçak kullanarak çevre dokulardan ayırın. Ortak safra kanalını proksimal sonu Forseps ile tutarak, hemen üstünde onun birleşme ile duodenum klemple incelemek, sonra karaciğer (şekil 1 d) üzerinden kanal proksimal sonu incelemek. Hemen izole EHBD (şekil 1E) arabellek yıkama soğuk yerleştirin.</li>
		<li>EHBD çamaşır arabelleğinden kaldırmak ve steril neşter bıçak kullanarak 0,5 mm bölümlere kıyma. Doku (şekil 1B) işlem sırasında buz cam tabağa yerleştirin.</li>
		<li>EHBD bölümleri 500 µL ayrılma arabelleği içeren bir tüpün içine yerleştirin. 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya Ayrılma arabellek buz gibi hücre kültür ortamının 500 µL ekleyerek etkisiz hale getirin.</li>
		<li>Yukarı ve aşağı 18 G ve 20 G iğneler, 20 kere her ilerliyor hücre süspansiyon triturate. Hücre süspansiyon 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve akışı ile 50 mL tüp içinde toplamak. Not: Süzgeç ile hücre süspansiyon geçişini kolaylaştırmak için filtre uygulanmadan önce steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 500 µL ön koşulu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EHBD organoids kuran
	<ol>
<li>Akış yoluyla adım 2.1.5 300 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın. 1 mL steril buz gibi PBS hücrelerde resuspend. Resuspension yeni bir 1,5 mL tüp içine aktarın. 2.2.1 arasındaki adımları yineleyin.</li>
		<li>Santrifüjü sonra dikkatli bir şekilde süpernatant tüp alt kısmında toplanan yıkanmış hücrelerden çıkarın. Hücre Pelet sıvılaştırılmış buz gibi Bodrum matris 120 µL içinde P200 ipuçlarını kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Not: Bodrum matris hücre Pelet resuspension buz-banyo üzerinde yapılması gerekiyor.</li>
		<li>Bir de önceden ısıtılmış bir 24-şey plaka merkezi haline Bodrum matris hücre resuspension 40 µL plaka. Not: Hava kabarcık oluşumunu önlemek için Bodrum matris manipüle süre emme kaçının.</li>
		<li>Bodrum matris için 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi 15 dk ya kadar Bodrum matris katılaşmış resuspended hücreleri ile plaka dönmek. 37 ° C'ye kadar her şey (Tablo reçetesi) için sağlanan orta 600 µL ısındı ekleyin. Plaka 37 ° C doku kültürü kuluçka için dönmek.</li>
		<li>Tohumlama orta 3 gün ve 3 günde bundan sonra taze organoid kültür orta 600 µL ile değiştirin. Organoid büyüme ters bir mikroskopla izlemek. Kullanım organoids bir aşağı akım uygulama veya bölünmüş her 7-9 gün önce intraluminal enkaz ve organoid çöküşü birikimi (şekil 2A) gözlenir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EHBD Organoid geçiş ve depolama
<ol><li>
EHBD organoids 1:3 geçit 1:4 7-9 günde için
	<ol>
<li>Orta kuyudan kaldırın ve buz gibi PBS 400 µL ekleyin. Organoids hafifçe karışım aşağı yukarı 10 kez kuyuda pipetting tarafından resuspend. Karışımı bir 1,5 mL tüp aktarın.</li>
		<li>Karışımı bir 25 G iğne ile organoids ayırmak için 4 kez geçiş. 400 x g 4 dk 4 ° C'de karisimin santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın ve Bodrum matris (1:3 1:4) (Adım 2.2.4.) daha fazla kültür için hücrelerde resuspend veya daha fazla işlem için buz soğuk PBS hücrelerle yıkayın. Not: Tipik olarak, 250-300 hücreleri içine aşağı akım uygulamaları için 24-şey levha kaplama. Verimlilik kaplama organoids sayılması ve ilk hücre sayısı onların yüzde hesaplama tarafından passaging sonra günü 3-5 ters bir mikroskop kullanarak parlak alan mikroskobu ile değerlendirilebilir. mRNA guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform ayıklama kullanan standart protokolü kullanarak PBS yıkanmış EHBDOs üzerinden ayrılmış olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EHBD organoids, uzun süreli depolama
	<ol>
<li>Orta kuyudan çıkarın ve organoids oda sıcaklığında PBS ile yıkayın. PBS Bodrum matrisi bırakma bozmadan kuyudan çıkarın.</li>
		<li>Orta-iyi buz gibi buz gibi hücrenin 500 µL ekleyin. Yavaşça sıvılaştırılmış Bodrum matris ve orta buz gibi hücre organoids resuspend ve karışımı kriyojenik şişeleri aktarın.</li>
		<li>Şişeleri-80 ° C'de 48 h. transferi için uzun süreli depolama için azot tankı şişeleri buharı aşamasında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EHBD Organoid parafin katıştırma için Pprocessing
<ol><li>EHBDOs buz gibi PBS (4 ° C) 500 µL içinde 5-10 kat yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Sıvılaştırılmış Bodrum matris bir 1,5 mL tüp resuspended EHBDO toplamak. Not: Organoids bozulmaması için alt 2-3 mm P1000 uç kesti ve süpernatant çok dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Santrifüj EHBD organoids 350 x g 5 dakika süreyle de dikkatli bir şekilde süpernatant organoid Pelet bozmadan çıkarın.</li>
	<li>Buz gibi %4 paraformaldehyde (PFA) 1 mL için organoids ekleyin ve 4 İngiltere'de yılın gecede 4 ° C'de % organoids kuluçkaya %4 kaldırmak PFA dan sonra gece kuluçka P1000 ucu kullanarak organoids.</li>
	<li>Organoids ile tüp 1000 µL Oda sıcaklık PBS ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 min için kuluçkaya. Tüp 350 x g 5 dk. tekrar de PBS içinde organoids ile bu işlemi iki kez daha santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>PBS çıkarın ve 1 mL % 30 etanol için organoids ekleyin. Dik, 5 min için kuluçkaya</li>
	<li>350 x g RT. Kaldır % 30 etanol, 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi. 1 mL % 70 etanol ekleyin ve RT., 5 min için kuluçkaya</li>
	<li>350 x g 5 dk. Kaldır % 70 etanol için de centrifugate. 1 mL % 100 etanol ekleyin ve RT., 5 min için kuluçkaya Not: Organoids, daha fazla işleme önce oda sıcaklığında en fazla 48 saat için % 100 etanol içinde tutulabilir.</li>
	<li>Isı numune işleme jel bir mikrodalga 20 s veya sıvılaştırılmış kadar. Jel organoids ile tüp içine işleme örnek 50 µL ekleyin. Jel işleme örnek katılaşmış kadar tüp Buza koyun.</li>
	<li>Jel organoids tüp ile işleme numune damla çıkarın ve doku işlemcide işlenmesi için bir kaset içinde mavi sünger pedleri arasında yerleştirin. 15 dk parafin embedder her adımda daha fazla işleme sırasında kullanmak...</li>
	<li>Bölüm organoids numune işleme içinde parafin gömülü 4 µm. devam et immunohistokimyasal yukarıda açıklanan16boyama ile jel.</li>
</ol>

<ol><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholangiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2FProgenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).</li>
<li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li>
<li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+And+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li>
<li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
<li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li>
<li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+the+Wild+West+of+Organoids%2C+Enteroids%2C+and+Mini-Guts%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113(2018).</li>
<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+Natural+Academy+Of+Science+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li>
<li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Communications%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li>
<li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+formation+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tree+stem%2Fprogenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts%3A+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li>
<li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Bu eser fare EHBD cholangiocytes bir organotypic 3 boyutlu model nesil açıklar. EHBDO kültür üretimi önemli adımlardan dahil pankreas hücresi kirlenmesini, bakteriyel ve mantar kirlenme ve sonra Santrifüjü önlemek için dikkatli işleme önlemek için steril koşulları bakımından önlemek için çok titiz EHBD diseksiyon hücresel malzeme kaybı. Açıklanan sıcaklık koşullarında yakın bir bağlılık gereklidir. Teknik bazı sınırlamalar vardır. EHBDs yetişkin fareler küçük (yaklaşık 1 mm çapı; Şekil 1E), ...

Cholangiopathies içi - ve extrahepatic safra kanalları (EHBDs)1bulunan safra hücrelerini etkiler tedavi edilemez kronik ilerici bozuklukları vardır. Birincil sklerozan kolanjit, cholangiocarcinoma, safra atrezi ve choledochal kistleri, gibi bazı cholangiopathies ağırlıklı olarak EHBDs etkiler. Cholangiopathies için tedavilerin geliştirilmesi Preklinik modellerin sınırlı kullanılabilirliğe tarafından sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, önceki çalışmalarda birlikte gruplandırılmış cholangiopathies üzerinde duruldu: karaciğer, içi- ve EHBDs. Ancak, içi - ve EHBDs ayrı bir embriyonik kökenli ve, böylece, farklı moleküler patolojiler düşünülmelidir. İntrahepatic duktal plakaları ve hepatik divertikülü kafatası parçası intrahepatic safra kanalları geliştirmek, hepatik divertikülü2Kaudal kısmından tüm EHBDs geliştirmek. Onlar farklı progenitör hücre bölmeleri yetişkin Homeostazı, intrahepatic safra kanalları ve peribiliary bezleri EHBDs2,3Hering Kanallar dahil olmak üzere için güvenirler. Hayvan modelleri kullanımını preklinik Etütler gider tarafından sınırlı ve etik nedenlerle indirilmelidir. Bu nedenle, indirgemeci, tekrarlanabilir, zaman ve maliyet-etkin tüp bebek modelleri son derece arzu edilir.
Cholangiopathies en önceki çalışmaları normal fare ya da sıçan kanser modelleri, ya da insan cholangiocarcinoma hücre satır içi - ve EHBDs4,5,6,7elde kullanılmaktadır. Ancak, bu dönüştürülmüş hücrelerin modelleri ve normal cholangiocyte Biyoloji homeostazı veya sağlıklı bir devlet özetlemek değil. Organotypic kültür modelleri gelişiminde son ilerleme 3 boyutlu yapıları gelişimi normal fare rağmen EHBDs8,9hepatobiliary dokular, dahil olmak üzere farklı doku türlerinden izin verdi, 10. Bu "organ gibi" yapılar birincil doku taklit eden amaçlı ve öz-organ özgü kök/progenitor hücreler11yenilenmesi destekleyen yapay bir niş içinde yetişir.
"Organoid" olan bir geniş terim bu en yaygın kök hücrelerden elde edilen 3 boyutlu doku modelleri açıklar. Organoids programlanmış pluripotent kök hücreler embriyonik kök hücreleri tarafından temsil ve pluripotent kök hücreler indüklenen oluşturulabilir. Bunlar da organ özgü erişkin kök hücreler12den oluşturulabilir. Bazı cholangiocyte organoid modelleri önceki araştırma çalışmalarında önerilmiştir. Böylece, insan pluripotent kök hücrelerden türetilmiş organoids bildirilen7,9,13 olmuştur ve farklı hücre tipleri aynı anda oluşturmak için olanak sağlayan değerli, zaman verimli araç sağlar. Ancak, birincil yetişkin EHBD cholangiocytes işlevselliğini ve yapısını bu pluripotent kök hücre kaynaklı organoids tam olarak yansıtmıyor.
Organoids insan9 yetişkin kök hücrelerden türetilmiş ve kedi10 karaciğer de önerdi. Kedi modelleri yaygın olarak mevcut değildir ve aracı armamentarium çalışma amacıyla sınırlı sahip. Ayrıca, bu karaciğer kaynaklı yetişkin kök hücre kaynaklı organoids extrahepatic cholangiocytes ama çok intrahepatic cholangiocytes model değil.
EHBD organoid üretimi insan normal EHBDs14 ve fare EHBD cholangiocarcinoma15bildirildi. Ancak, insan EHBD doku erişim son derece sınırlıdır ve cholangiocarcinoma15 bir genetik fare modelinden türetilmiş organoids sağlıklı cholangiocyte Biyoloji Homeostazı, temsil etmez ve genetiği değiştirilmiş hücrelerden türetilir.
Pluripotent kök hücre ve karaciğer türetilmiş cholangiocyte organoid modelleri ve insan dokulara preklinik modellerinde gerekli sınırlı erişim sınırlamaları gidermek amacıyla geliştirdiğimiz bir fare EHBD organoid model (şekil 1A). Bu el yazması bir tekniği için fare EHBD elde edilen organoids yetişkin dokusundan gelişimi anlatılmaktadır. EHBDOs adlı bu EHBD organoids EHBDs cholangiocyte homeostazı ve hastalık gibi süreçlerini cholangiopathies altında yatan mekanizmaları incelenmesi için önemli bir tüp bebek araç olacaktır.

<table><tbody><tr><td><güçlü>L-WRN hücre kültürü ortamı< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gelişmiş DMEM / F12</td><td></td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>% 1</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10437-028</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>100 U / mL</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td></tr> <tr><td>< güçlü > Yıkama tamponu< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>50 mL</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>125 U/mL</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Amfoterisin B&nbsp;</td><td>6.25 ve mikro; g/mL</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15290-018</td></tr><tr><td><güçlü>Organoid kültür ortamı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Şartlandırılmış ortam&nbsp;</td><td>1:1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM/F12</td><td>1:1</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>100 U/mL</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>N-Glutamin</td><td>10 ve mikro; l/mL</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050-061</td></tr><tr><td>N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit, HEPES</td><td>10 mM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15630-080</td></tr><tr><td>B27</td><td>10 & mikro; l / mL</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td></tr><tr><td>N2</td><td>10 ve mikro; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td><güçlü>Organoid tohumlama ortamı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Organoid kültür ortamı&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermal büyüme faktörü (EGF)</td><td>50 ng/mL</td><td>İnvitrojen</td><td>PMG8041</td></tr><tr><td>Fibroblast büyüme faktörü-10 (FGF10)</td><td>100 ng/mL</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td></tr><tr><td><güçlü>Birincil antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sitokeratin 19 (CK19) antikoru, Tavşan</td><td>1:250</td><td>Abcam</td><td>ab53119</td></tr><tr><td>Cinsiyet Belirleyici Bölge Y-Box 9 (SOX9) antikoru, Tavşan</td><td>1:200</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20095</td></tr><tr><td>Pankreatik Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antikoru, Tavşan</td><td>1:2000</td><td>DSRB</td><td>F109-D12</td></tr><tr><td>E-kaderin antikoru, Keçi</td><td>1:500</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-31020</td></tr><tr><td>Asetillenmiş &alfa;-tubulin antikoru, Fare</td><td>1:500</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td></tr><tr><td>İkincil antikorlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 etiketli anti-tavşan, Eşek IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td></tr>, <tr><td>594 etiketli anti-keçi, Eşek IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td></tr><tr><td>568 etiketli anti-fare, Keçi IgG2b</td><td>1:500</td><td>Invitrogen</td><td>A-21144</td></tr><tr><td>TopFlash Wnt muhabir tahlili</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TopFlash HEK293 hücre hattı</güçlü></td><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td></tr><tr><td>Lusiferaz Test Kiti</td><td></td><td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>%0,05 Tripsin-EDTA</td><td></td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300054</td></tr><tr><td>%0,4 Tripan Mavisi Çözeltisi</td><td></td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15250061</td></tr><tr><td><güçlü>Ek malzemeler ve reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>temel matris, fenol içermeyen Matrigel</td><td></td><td>CORNING</td><td>356237</td></tr><tr><td>Dissosiyasyon tamponu, Accutase</td><td></td><td>Gibco</td><td>A1110501</td></tr><tr><td>Hücre kültürü dondurma ortamı, Geri Kazanım</td><td></td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12648010</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci (70 & mikro; m, steril)</td><td></td> <td>Fisherbrand</td><td>22363548</td></tr><tr><td>Guanidinyum tiyosiyanat-fenol RNA ekstraksiyonu, TRIzol</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td></tr><tr><td>Numune işleme jeli, HistoGel</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td></tr><tr><td>Evrensel mikoplazma tespit kiti</td><td></td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td></tr><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td></td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7524</td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpü</td><td></td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse E800</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td></td><td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>Nekropsi tepsisi</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>13-814-61</td></tr></tbody></table>

organoids fare extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, extrahepatic safra kanalları (EHBDs) etkileyen, safra atrezi, Birincil sklerozan kolanjit ve cholangiocarcinoma içerir. Onlar etkili tedavi seçeneği var. EHBD eğitim araçları çok sınırlıdır. Bizim amacımız kolayca vahşi türü ve genetik fareler üretilen bir organ özgü, çok yönlü, Yetişkin kök hücre kaynaklı, preklinik cholangiocyte modeli geliştirmekti. Böylece, biz yetişkin fare EHBDs bir EHBD organoid (EHBDO) kültür sisteminden geliştirme roman tekniği rapor. Modelin maliyet-etkin, kolayca çözümlenmesi mümkün olduğunu ve birden çok akış yönündeki uygulama alanı vardır. Özellikle, fare EHBD yalıtım ve tek hücre ayrılma, organoid kültür başlatılması, yayma ve uzun vadeli bakım ve depolama yöntemi açıklanmaktadır. Bu makale ayrıca immünhistokimya, floresan mikroskopi ve mRNA bereket Nefelometri için gerçek zamanlı nicel ters transkripsiyon Polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) tarafından işleme EHBDO açıklar. Bu iletişim kuralının EHBD özgü organoids üreten ek olarak önemli avantajlar vardır. L-UYR hücrelerden şartına bir orta kullanımı önemli ölçüde bu model maliyetini azaltır. Fare EHBDs kullanımı insan dokusu aksine kültür üretimi için neredeyse sınırsız doku sağlar. Oluşturulan fare EHBDOs endodermal progenitör işaretleri saf nüfusuyla epitel hücresi içeren ve safra hücreleri ayrıştırılan. Kültürlü organoids birden çok pasajlar ile homojen Morfoloji korumak ve bir uzun vadeli depolama süresi sıvı azot sonra elde edilebilir. Model safra progenitör hücre çoğalması için çalışma sağlar, farmakolojik manipüle edilebilir ve genetik fareler oluşturulabilir. Gelecekteki çalışmalar Kültür koşulları kaplama verimliliği artırmak, işlevsel hücre olgunluk ve doğrudan hücre farklılaşması değerlendirmek için en iyi duruma getirmek için ihtiyaç vardır. Ortak kültür modeller ve daha biyolojik olarak tarafsız bir hücre dışı matriks geliştirilmesi de arzu vardır.

Bizim protokolünü doku özgü ve yetişkin kök hücre kaynaklı fare EHBD organoids nesil açıklar. Sonra organoids kültürlü, Kistik yapısı oluşumu 1 gün sonra EHBD yalıtım olarak erken görülebilir. Fibroblastlar ile kirlenme genellikle kültür oluşturma sırasında gözlenen değil. EHBDO verimliliği kaplama olduğunu yaklaşık %2 ne zaman yenidoğan veya yetişkin üzerinden (2 aydan daha eski) izole fare (şekil 2B). EHBD organoids verimliliğini kaplama yetişkin fareler ge...

Bu iletişim kuralı bir fare extrahepatic safra kanalını 3 boyutlu organoid sistemi üretimi açıklar. Bu safra organoids cholangiocyte Biyoloji çalışma kültüründe korunabilir. Safra organoids işaretleri hem yaratıcı hem de safra hücreleri hızlı ve polarize epitel hücrelerinin oluşmaktadır.

Organoids fare Extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Bu murine ekstrahepatik safra yolu organoid sistemi preklinik kolanjiyopati modellerive pluripotent kök hücre ve karaciğer kaynaklı kolanjiyosit organoid modellerin sınırlamaları sınırlı erişim adresi olabilir. Modelimiz erişkin dokuya özgü, indirgemeci, tekrarlanabilir, zaman ve maliyet etkindir. İnsan dokularına erişimi olmayan laboratuvarlar için özel bir fayda sağlayacaktır.Tekniğimiz doku rejenerasyonu ve hücre-hücre etkileşimleri çalışma ekstrahepatik safra yolu kolanjiyositneredeyse sınırsız sayıda kültürsağlar. Prosedürü gösteren Junya Shiota, benim laboratuvarımdan bir post-doc olacaktır. İntrahepatik safra yolu izolasyonu için yetişkin fareyi supine pozisyonda yerleştirin ve orta hat boyunca karın boşluğunu açın.Diyafram dinlenmek için karaciğer geri çekin ve yavaşça karaciğer hilum hemen altında ortak safra kanalı ortaya çıkarmak için proksimal duodenum çekmek için bir hemostat kullanın. Ekstrahepatik safra kanalını çevre dokulardan ayırmak için neşter kullanın. Forceps ile ortak safra kanalının proksimal ucunu tutarak, karaciğerden kanalın proksimal ucunu kesmeden önce duodenum ile kavşak hemen üzerinde distal kanal incelemek.İzole ekstrahepatik safra kanalını hemen buz

generation-of-organoids-from-mouse-extrahepatic-bile-ducts

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Yenidoğan farelerin ekstrahepatik safra kanallarından cholangiocytes izole etmek için bir teknik tarif edilir. Kanallar titizlikle kesilir, ve daha sonra hücreler, kalın kolojen jeller büyümesinin ile izole edilir. Bu yöntem, ekstrahepatik safra kanalı geliştirme ve patolojiyi eğitim için yararlı bir araç sağlar.

Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu

Bu protokol açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi dallı bir organ haline onların önemli genişleme, farklılaşma ve morfojenezinin dahil dağınık embriyonik fare pankreas atalarıdır, gelen pankreas gelişimini özetlediği. Bu yöntem, görüntüleme, niş fonksiyonel müdahale ve manipülasyon için uygun değildir.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğunun doğru ölçülmesini yapmak için oldukça basit ve hassas bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, genetik ve çevresel değiştiricilerin etkilerini ve biliyer hastalıklarının fare modellerinde potansiyel tedavilerin etkinliğini belirlemede yardımcı olabilir.

Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğu belirlenmesi

Biz prostat tümörü diseksiyon odaklanmak, fare prostat kanseri modellerinin otopsi ve diseksiyon için bir yöntem göstermektedir. Fare prostat tümörü organoidlerin oluşturulması için adım adım bir protokol de sunulmaktadır.

Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Üç boyutlu (3D) hücresel sistemler organogenezin araştırılması için uygun modellerdir. Safra kist üretimi ve karakterizasyonu için hidrojel bazlı bir yöntem önerilmektedir. Bu protokol, kist oluşumu verimliliğini, boyutlarını değerlendirmek ve işlevselliklerini test etmek için basit ve güvenilir bir yöntemle 3B karakterizasyonunun engellerini ortadan kaldırmaktadır.

Fonksiyonel ve Polarize Safra Epitel Kistlerinin Oluşumu ve Kantitatif Karakterizasyonu

Fare hepatatitlerinden uzun süreli ek vitro 3D organoid kültür sistemi kuruldu. Bu organoidler shRNA/ektopik yapı, siRNA transfeksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliğinin lentivirüs enfeksiyonu ile geçiş ve genetik olarak manipüle edilebilir.

Murine Hepatosit Organoidlerinin Kurulması ve Genetik Manipülasyonu

Murin neonatal safra kanalı bozukluklarının gözlenmesi için sağlam bir safra kanalı ve etkili bir hazırlık gereklidir. Bu nedenle, murin yenidoğanlarda tüm ekstrahepatik safra kanalı sisteminin izole edilmesi için safra kanalının bütünlüğünü korurken başarılı bir şekilde yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir.

Dokuz Günlük Fare Yenidoğanlarında Ekstrahepatik Safra Kanalı ve Safra Kesesi Diseksiyonu

Bu protokol, hızlı ve tekrarlanabilir endodermal hepatik organoidlerin (eHEPO'lar) oluşumunu tanımlar. Bu protokol ile eHEPO'lar 2 hafta içinde üretilebilmekte ve farklılaşma ve işlevselliklerini kaybetmeden uzun vadede (1 yıldan fazla) genişleyebilmektedir.

Fonksiyonel Endodermal Hepatik Organoidlerin Üretimi

Hasta tümörlerinden üretilen organoidler ortotopik olarak fare karaciğerine enjekte edilir. Tümör olmayan karaciğer dokusunun rezeksiyonu, tümörün bulunduğu karaciğer dokusunda rejeneratif bir ortama yol açar.

Karaciğer Rejenerasyonunun Tümör Büyümesi Üzerindeki Etkisini Araştırmak İçin Hepatosellüler Kanser Hastasından Elde Edilen Bir Organoid Ksenogreft Modeli

Bu protokol, bir sıçan modelinde optimize edilmiş iki aşamalı kollajenaz karaciğer perfüzyon tekniği sunar ve in vitro uzun süreli 3D organoid kültürü için izole hepatositlerin kullanımını gösterir.

Sıçan Karaciğer Perfüzyonu ve Primer Hepatosit İzolasyonu: Son Teknoloji 3D Organoid Kültürü İçin Çok Önemli Eski Bir Prosedür

Keşfedin, ekstrahepatik safra kanalından izole edilen hücrelerle fare kökenli organoid kültürü oluşturma yöntemini. Bu teknik, kolangiyosit biyolojisi ve doku rejenerasyonu çalışmaları için güvenilir bir model sunar.

Organoids fare Extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil

Daha fazla video keşfet