Sitosolik siRNA teslim için Nötrsel olarak şarj edilmiş, pH duyarlı polimerik nanopartiküller hazırlanması

AraştırmacılarSs siRNA yüklü nano tanecikleri üretmek için izin verir, çünkü mevcut protokol önemlidir, ve yeterli sonraki çalışmalardan önce hayvanlara uygulanması için uygunluk sağlamak için bu nano tanecikleri karakterize etmek. Bu yaklaşımın avantajı, siRNA'nın biyoyararlanımını artıran nano partiküller üretmek ve nötra yüklü ve böylece sistemik uygulama için uygun olan nano tanecikleri üretmektir. SiRNA nano tanecikleri diğerleri arasında kanser, kardiyovasküler hastalık ve otoimmün bozukluklar da dahil olmak üzere sistemik yönetimi gerektiren hastalıkların sayısız tedavisinde uygulanabilir, çünkü bu teknik etkilidir.

Başlamak için, mililitre başına 33.3 miligram konsantrasyonda etanol polimer çözünür ve çözünme sağlamak için karıştırın. Sonra mililitre başına 3,33 miligram konsantrasyonulaşmak için 10 milimolar sitrik asit tampon polimer çözeltiaktarmak için bir pipet kullanın. 50 mikromolar konsantrasyonu elde etmek için küçük müdahale RNA içeren bir tüp içine distile su ekleyin.

Polimer ve küçük müdahale civarı RNA çözeltilerini bir boru içinde iyice karıştırarak 10 fosfat oranına azot elde edin. Tüpü ortam sıcaklığında 30 dakika yerleştirin. Daha sonra mililitre başına 0,28 miligram konsantrasyon elde etmek için pH 8'de 10 milimolar fosfat tamponunun bir mililitresini tüpe ekleyin ve boruyu boruyla veya ters çevirerek hafifçe karıştırın.

Son pH'ın nötr olduğunu doğrulamak için, yaklaşık 7,2 ila 7,5, pipet 10 mikrolitre küçük müdahale eden RNA nano tanecikleri çözeltisi pH test şeritleri üzerine. İlk olarak, bir mililitre küçük müdahale eden RNA nano partiküllerini mililitrelik bir mililitreyi mililitrelik bir milimetrelik konsantrasyonda mililitrelik bir milimetrelik gözenek boyutuşırve 0,45 mikrometrelik gözenek boyutuşırşırşfiltrelerini kare kuvarsveya polistiren çivisine filtreleyerek hazırlayın. Daha sonra üreticinin özelliklerine göre dinamik bir ışık saçılma aleti kullanarak boyut ve yüzey şarj ölçümleri kaydedin.

İletim elektron mikroskobu kullanarak küçük müdahale eden RNA nano partiküllerinin boyutunu ve morfolojisini doğrulamak için ilk olarak her TEM şebekesine mililitre başına 0,28 miligram da filtrelenmiş küçük müdahaleci RNA nanopartikül çözeltisi beş mikrolitre ekleyin. Izgaraları ortam sıcaklığına 60 saniye yerleştirin. Üç saniye boyunca filtre kağıdı ile kuru lekeler.

Daha sonra, her ızgara için% 3 uranyl asetat çözeltisi beş mikrolitre ekleyin ve 20 saniye kuluçka. Leke üç saniye kuru. Daha sonra iletim elektron mikroskobu altında görüntüleme önce bir gecede kurulamak için bir kurulaştırıcı ızgaraları yerleştirin.

Agarose jel geriliği gerçekleştirmek için, ilk 100 mililitre 1X Tris-asetat-EDTA tampon için elektroforez dereceli agarose tozu iki gram ekleyin pH sekiz bir kabın% 2 agarose jel üretmek için. Agarose askıya almak için karıştırın. Tüm agarose çözülene kadar bir ila üç dakika ısıtmak için bir mikrodalga içinde ortaya çıkarılan kabı yerleştirin.

Soğuduktan sonra, kabın içine mililitre başına 10 miligram konsantrasyonda beş mikrolitre ethidyum bromür ekleyin ve iyice karıştırın. Sonra bir jel tepsiye agarose dökün ve kuyu üretmek için tarak yerleştirin. Jel30 dakika kuru.

Yükleme kuyularını geride bırakmak için taramayı dikkatlice çıkarın ve maksimum dolgu hattına doldurmak için jel tepsisine 1X Tris-asetat-EDTA tamponu dökün. Daha sonra, fosfat oranlarına göre farklı azotta her küçük müdahale eden RNA nanopartikül formülasyonu için parafin filmine SDS olmadan veya çözücü ajanlarla iki mikrolitre boya yerleştirin. Pipet parafin film yükleme boya ile küçük müdahale RNA nanopartikül çözeltisi 10 mikrolitre karıştırmak için.

Agarose jel kuyularına karışımı ekleyin. Elektroforez sistemini bir güç kaynağına takın ve 100 voltluk voltaj kaynağını 35 dakika boyunca veya numuneler jel uzunluğunun %80'ini geçene kadar çalıştırın. Jeli tepsiden UV transilluminator'a aktarın ve UV transilluminator'daki küçük müdahale eden RNA bantlarını üreticinin özelliklerine göre görselleştirin.

Jelin altındaki küçük müdahale eden RNA bantlarının kaybolmasına bağlı olarak fosfat oranına optimum nitrojeni belirleyin. Model gen luciferase yıkmak için, ilk tohum luciferase ifade hücreleri 96-iyi siyah duvarlı plaka DMEM ile 10% FBS bir yoğunlukta 2, 000 hücre başına. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için bir gece boyunca bir kuvöz içine plaka yerleştirin.

Sabah ları ortam kaldırın ve 100 nanomolar son küçük müdahale RNA konsantrasyonu için tam serum ortamiçine seyreltilmiş küçük müdahale RNA nano tanecikleri kuyu başına 10 mikrolitre ekleyin. Küçük müdahale eden RNA nano tanecikleri ile hücreleri tedavi etmek için 24 saat boyunca kuvözkuyular dönün. Ertesi gün, mililitre D-luciferin başına 150 mikrogram içeren tam serum media ile medya değiştirin.

Bir plaka okuyucu üzerinde parlaklık ölçmeden önce beş dakika oda sıcaklığında hücreleri kuluçka. Daha sonra d-luciferin içermeyen taze tam serum media ile iki kez medya ferahlık tekrarlayın, 24 saat kuluçka takip. Ortamı mililitre D-luciferin başına 150 miligram içeren tam serum media ile değiştirin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.

48 saatlik zaman noktasında parlaklığı ölçün. Uzunlamasına çalışmalar için, steril koşullar altında hücreleri korumak ve taze tam medya ile luciferin içeren medya yerine sonra kuluçka devam etmek için biyogüvenlik kabine dışında zaman kuyu plaka üstüne kapak bırakın. Dinamik ışık saçılma ölçümleri küçük müdahaleci RNA nanopartikül ünün ortalama çapının 35 nanometre olduğunu göstermektedir.

Dar tepe genişliğine sahip tek bir tepenin varlığı tek modal dağılım ve düşük polidispersitliği gösterir. TEM ölçümleri, dinamik ışık saçılımından elde edilen boyut ölçümlerinin, küçük müdahaleci RNA nano partiküllerinin tek tip popülasyonunun varlığını gösterdiğini ve küçük müdahaleci RNA nano partiküllerinin küresel morfolojisini ortaya çıkarmasını sağlar. Hazırlık adımında polimerin çok yüksek konsantrasyonu, 200 nanometreden daha fazla istenmeyen çapta küçük müdahale rna nanopartikül iki, multimodal ve polidispersed popülasyon ve farklı parçacık morfolojisi oluşturan çözeltideki agregalar için sonuçlandı.

Her iki küçük müdahale RNA nano tanecikleri bir ve iki ekran nötr yüzey yükü sıfıra yakın ortalama zeta potansiyel değerleri ile gösterilir. Agarose jel geriliği töz, jel insanın altındaki küçük müdahale cihetindeki Küçük müdahaleci RNA bantlarının kayboluşunu gösterir ve bu da küçük müdahale cihetinin polimere karmaşıklaşmasını gösterir. Polimer karmaşık küçük müdahale RNA jel yoluyla göç edemiyor ve böylece yükleme kuyuları yakın jel üst kısmında görselleştirilmiş.

Azot-fosfat oranı arttıkça jel alt kısmında küçük müdahale RNA bandının yoğunluğuazalmış olarak belirtildiği gibi küçük müdahale RNA karmaşıklığı artar. Biyoaktif luciferase küçük interferans RNA nanopartikül bir önemli ölçüde karışık kontrol ile karşılaştırıldığında azalmış luciferase aktivitesi sergiler. Buna karşılık, luciferase küçük interferans RNA nanopartikül iki biyoaktif olarak kabul edilmez.

İstenilen fizyokimyasal özelliklere sahip tutarlı siRNA nano partikülleri üretmek için, uygun konsantrasyonlarda polimer çözeltileri kullanmalı ve protokolün her adımında tampon çözeltilerinin pH'ını doğrulamalıdır. Araştırmamızda bu yöntemleri kullanarak daha önce ilaçlandırılmaz kansere neden olan genler için siRNA nanopartikül bazlı tedaviler üretebildik ve bu tedavilerin etkinliğini meme kanserinin klinik öncesi modellerinde test ettik.