Name: Dev veziküller Içinde tek hücreli seviyede bakteriyel hücre kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Keşfedin dev veziküller içinde tek hücreli seviyede bakteriyel hücre kültürü yöntemini. Damla transferi tekniği ile hazırlanan veziküller, bakteri büyümesinin doğrudan gözlemlenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Japonya 'nın eğitim, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT) Bakanlığından mükemmel genç araştırmacılar (lıder, No. 16812285) için önde gelen bir girişim tarafından destekleniyordu (No. 18K18157, 16K21034) genç bilim adamı araştırmaları için hibe-in-Aid Japonya 'dan m. ' ye bilim (JSPS) tanıtımı için ve MEXT 'den K.K. 'ye (No. 17H06417, 17H06413) Grant-ın-Aid.

1. droplet transfer yöntemi ile bakteriyel hücreler Içeren GVs hazırlanması
<ol><li>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-gliserin-3-fosfokolin lipid stok çözümleri hazırlayın (POPC, 10 mM, 1 mL) ve 1, 2-distearoyl-sn-gliserol-3-fosfoetolin-N-[biotinyl (polileneglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) kloroform/ Metanol çözeltisi (2/1, v/v) ve stokları-20 °C ' de saklayın.</li>
	<li>Lipid içeren yağ çözeltisi hazırlanması
	<ol>
<li>20 μL POPC çözeltisi ve 4 μL biotin-PEG-DSPE solüsyonu bir cam tüpüne dökün (Şekil 1B (ı)).</li>
		<li>Bir lipid filmi oluşturmak ve organik çözücüyü tamamen Buharlaştırıcı 1 h için bir kurutucu içine film yerleştirmek için hava akışı ile organik çözücü Buharlık (Şekil 1B (ii)). Not: Bir duman kaputu içinde organik çözücü Buharlık gerekir.</li>
		<li>Cam şişeye 200 μL mineral yağı (0,84 g/mL, malzeme tablosu) ekleyin (Şekil 1B (iii)).</li>
		<li>Cam şişenin açılış parçasını film ile sarın ve ultrasonik banyoda (120 W) en az 1 h (Şekil 1B (iii)) olarak sonlayın. POPC ve biotin-PEG-DSPE son konsantrasyonları sırasıyla 1 mM ve 0,002 mM vardır.</li>
	</ol></li>
	<li>Bakteriyel hücrelerin öncesi kültür
	<ol>
<li>E. coli IÇINE 1x lb Orta (1 g maya ekstresi, 2 g Bacto Tripton, ve 2 g sodyum klorür 200 ml deiyonize su) bir lb plaka ve inkübe Içinde 37 °c için 12 – 14 h (gece).</li>
		<li>Kuluçk sonra, 20 μL kültür çözümü toplamak ve 1,98 mL taze 1x LB orta transfer ve kültür hücreleri 2 h için tekrar.</li>
		<li>600 Nm (OD600) ön kültür çözeltisi (adım 1.3.2 ' de hazırlanmış) cinsinden optik yoğunluğu kontrol edin. OD600 = 1,0 – 1.5 öncesi kültür çözümü kullanılmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>GVs 'nin dış ve iç sulu çözeltileri hazırlanması
	<ol>
<li>GVs bir dış sulu çözeltisi hazırlamak için 1x LB orta glikoz çözülür. 20 mL 'lik bir stok glikoz çözeltisi hazırlayın (500 mM).</li>
		<li>200 mM (Tablo 1) 1x lb orta ile stok glikoz çözeltisi seyreltilebilir.</li>
		<li>GVs bir iç sulu çözeltisi hazırlamak için 1x LB orta sukroz çözülür. 20 mL 'lik bir stok sukroz çözeltisi hazırlayın (500 mM).</li>
		<li>Kültür öncesi çözümü (OD600 = 1.0 – 1.5), sakaroz çözeltisi (500 mm) ve 1x lb Orta (Tablo 1) karıştırın. Kültür çözümün son OD600 değeri 0.01 – 0.015 olmalıdır ve son sukroz konsantrasyonu 200 mm olmalıdır. Not: Osrotik basıncını önlemek için dikkat alın. İç ve dış sulu solüsyon arasındaki konsantrasyonu dengelemek gerekir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bakteriyel hücreler içeren su içinde yağ (W/O) damlacıkları hazırlanması
	<ol>
<li>0,6 mL 'Lik bir plastik tüpte (Şekil 1B (IV)), lipidler (popc ve BIOTIN-Peg-DSPE ile maden yağı) içeren yağ çözeltisi Ile 50 μL arasında (adım 1.4.4 ' de hazırlanmış) GVS 'nin iç sulu çözeltisi 2 μL ekleyin.</li>
		<li>Tüp elle dokunarak plastik tüpteki iki bileşeni emulsify (Şekil 1B (v)).</li>
	</ol></li>
	<li>Bakteriyel hücreler içeren GVs oluşumu
	<ol>
<li>1,5 mL delikli plastik tüpte (adım 1.4.2 ' de hazırlanan) GVs 'nin dış sulu çözeltisi 50 μL ekleyin (Şekil 1B (VI)) ve lipidler (popc ve BIOTIN-Peg-DSPE ile mineral yağı) içeren yağ çözeltisi ile hafif bir şekilde katman 150 μL dış sulu (Şekil 1B (vii)). Bu numuneyi oda sıcaklığında (RT, 25 °C) 10 – 15 dk. yağ ve sulu solüsyonların arayüzünün düz olduğundan emin olmak için kontrol edin.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak yağ ve sulu çözeltinin arayüzünde (1.5.2 adımda hazırlanmış) W/O damlacık çözeltisi 50 μL ekleyin (Şekil 1B (viii)).</li>
		<li>1,5 mL 'Lik plastik tüpü (adım 1.6.2) bir masaüstü santrifüjünde RT 'de 1.600 x g 'de 10 dakika boyunca santrifüjle (Şekil 1B (ix)). Santrifüjden sonra, 1,5-ml kapaklı plastik tüpten yağ (üst tabaka) bir pipet kullanarak Aspire ve bakteriyel hücreler içeren GV 'leri toplar (Şekil 1B (x)).</li>
	</ol></li>
</ol>2. GV gözlem sisteminin hazırlanması (bakteriyel hücre kültürü sistemi)
<ol><li>
Dolapları için küçük veziküller (SVS) hazırlanması ng a desteklenen fosfolipid membran
	<ol>
<li>20 μL POPC çözeltisi ve 4 μL biotin-PEG-DSPE solüsyonu bir cam tüpüne dökün (1,1 adımda GV hazırlama için kullanılan aynı lipid bileşimi kullanılarak).</li>
		<li>Bir lipid filmi oluşturmak için hava akışı ile organik çözücüyü Buharlaştırıcı ve 1 h için bir kurutucu içinde bu örnek yer tamamen organik çözücü Buharlık.</li>
		<li>200 mM glikoz 200 μL 1x LB Orta (GVs dış sulu solüsyon) cam şişeye ekleyin.</li>
		<li>Cam şişenin açılış parçasını film ile sarın ve ultrasonik banyoda (120 W) en az 1 saat boyunca sonlayın.</li>
		<li>100 Nm gözenek boyutu ile mini Extruder ve polikarbonat membran kullanarak ekstrüzyon yöntemi21 Ile SVS hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
El yapımı bir odanın hazırlanması
	<ol>
<li>Çift yüzlü mühür (10 mm x 10 mm x 1 mm) üzerinde boş bir yumruk ile 7 mm delik matkap.</li>
		<li>Çift yüzlü mührü bir kapak camı üzerindeki delikle (30 mm x 40 mm, kalınlık 0,25 – 0.35 mm) yapıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Odanın delikteki kapak camında desteklenen bir fosfolipid membranın hazırlanması
	<ol>
<li>Oda delikine (2,2 bölümünde hazırlanmış) SV çözeltisi 30 μL ekleyin ve 30 dakika boyunca RT 'de inküye yapın.</li>
		<li>200 mM glikoz içeren 20 μL 1x LB orta ile deliği iki kez yavaşça yıkayın (GVs 'nin dış sulu çözeltisi) pipetleme ile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Üzerinde GVs Immobilizasyon odanın delikteki kapak camında desteklenen fosfolipid membran
	<ol>
<li>10 μL neutravidin (1 mg/mL) deliğe GVs dış sulu çözeltisi ile tanıtmak ve RT 15 dakika boyunca inkübe.</li>
		<li>200 mM glikoz içeren 20 μL 1x LB orta ile deliği iki kez yavaşça yıkayın (GVs 'nin dış sulu çözeltisi) pipetleme ile.</li>
		<li>GVs (adım 1.6.3) içeren tüm çözümleri, kapak camı (18 mm x 18 mm, kalınlık 0.13 – 0.17 mm) (Şekil 2B) ile odanın deliğe ve mührüne ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
GVs içinde bakteriyel hücre büyümesini mikroskobik gözlem
	<ol>
<li>Uzun çalışma mesafesi (Şekil 2B) ile 40X/0.6 sayısal DIYAFRAM (na) objektif lens ile donatılmış ters mikroskop ile mikroskobik Isıtma aşaması sistemi ayarlayın.</li>
		<li>Odası mikroskobik Isıtma aşaması sistemine yerleştirin (Şekil 2B). 37 °C ' de 6 h için statik bir durumda odada bakteriyel hücreler içeren GV 'leri inkük etmek.</li>
		<li>Bir bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarıiletken (sCMOS) kamera kullanarak her 30 dakika içinde GVs içinde bakteriyel hücre büyümesi mikroskop görüntüleri yakalama ve kayıt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li>
<li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li>
<li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li>
<li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+cell-to-cell+communication+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li>
<li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li>
<li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+the+uncultured%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li>
<li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li>
<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+From+concept+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li>
<li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesizing+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
<li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells%2C+proteins%2C+and+microbeads+in+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li>
<li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li>
<li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles%3A+a+novel+tool+for+bacterial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution%2C+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li>
<li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li>
<li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li>
<li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li>
<li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li>
<li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li>
<li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li>
<li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024(2018).</li>
<li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564(2018).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Burada, biz GVs içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu basit yöntem, damlacık Transfer yöntemini kullanarak tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler içeren GVs oluşturma içerir. Bakteriyel hücreler içeren GVs almak için diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, bu yöntem iki avantajı vardır: (i) geliştirmek kolaydır, ve (ii) örnek çözümün küçük bir hacmi (2 μL) GVs hazırlamak için gereklidir. Bakteriyel hücreler içeren GVS hazırlamak için damlacık transfer yöntemi<sup c...

Tek hücreli düzeyde bakteriyel hücrelerin kültürü artan ilgi aldı. Sınırlı bir alan içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreleri kültür fenotip değişkenlik1,2,3,4, hücre davranışı5gibi bakteriyel fonksiyonları aydınlatmak olabilir, 6 , 7 , 8 , 9ve antibiyotik direnci10,11. Kültür tekniklerindeki son gelişmeler nedeniyle, tek bakterilerin kültürü, bir iyi çip4,7,8, jel damlacık12,13 gibi kapalı bir alanda elde edilebilir ve yağ içinde su (W/O) damlacık5,11. Tek bakteriyel hücrelerin anlayış veya kullanımını teşvik etmek için, yetiştirme tekniklerinin daha fazla teknik gelişimi gereklidir.
Biyolojik hücre membranı taklit eden veziküller, amphiphilik moleküllerden oluşan küresel bölmeler olup çeşitli materyalleri tutabilir. Veziküller boyutuna göre sınıflandırılır ve küçük veziküller (SVs, çapı < 100 Nm), büyük veziküller (LVs, < 1 μm) ve dev veziküller (GVs, > 1 μm) içerir. SVs veya LVs yaygın olarak biyolojik hücre membranı14için kendi yakınlık nedeniyle uyuşturucu taşıyıcıları olarak kullanılır. GVS Ayrıca belirleyebiliyorlar15 veya suni hücreler16inşası için bir reaktör sistemi olarak kullanılmıştır. Biyolojik hücrelerin GVS içine kapsülleme,17,18bildirilmiştir ve böylece reaktör sistemi ile kombine edildiğinde bir hücre kültürü sistemi olarak potansiyel GVS göstermek.
Burada, deneysel prosedürler bir video ile birlikte, biz nasıl GVs yeni hücre kültürü gemiler olarak kullanılabilir tarif19. Bakteriler içeren GVs damlacık transfer yöntemi20 tarafından yapılmıştır ve daha sonra bir kapak camında desteklenen bir membran üzerinde immobilize edildi. Bu sistemi, gerçek zamanlı olarak GVs içindeki tek hücreli seviyede bakteriyel büyümesini gözlemlemek için kullandık.

<table><tbody><tr><td>Bactotryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Wako Saf Kimyasallar</td><td>032-21921</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı (18 ve kez; 18 mm)</td><td>Matsunami Cam Ind.</td><td>C018181</td><td>kalınlığı 0.13&ndash; 0,17 mm</td></tr><tr><td>Kapak camı (30 > 40 mm)</td><td>Matsunami Cam Ind.</td><td>Özel sipariş</td><td>kalınlığı 0.25&ndash; 0.35 mm</td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüj</td><td>Hi-Tech Co.</td><td>ATT101</td><td>salıncak rotor tipi</td></tr><tr><td>Çift yüzlü conta (10 & kez; 10 & kez; 1 mm)</td> <td>Nitoms</td><td>T4613</td><td></td></tr><tr><td>Cam şişe</td><td>BİR GİBİ</td><td>6-306-01</td><td>Durham fermantasyon tüpü</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Wako Saf Kimyasallar</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako Saf Kimyasallar</td><td>133-16771</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobik ısıtma kademesi sistemi</td><td>TOKAI HIT</td><td>TP-110R-100</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Nacalai Tesque</td><td>23334-85</td><td></td></tr><tr><td>Mini ekstrüder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Objektif lens</td><td>Olympus</td><td>LUCPLFLN 40&kez;/0.6 NA</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat membranlar</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>610005</td><td>gözenek boyutu 100 nm</td></tr><tr><td>sCMOS kamera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 plus</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Wako Saf Kimyasallar</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Wako Saf Kimyasallar</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik banyo</td><td>AS ONE</td><td>ASU-3D</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>0.6 mL kapaklı plastik tüp</td><td>Watson</td><td>130-806C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL kapaklı plastik tüp</td><td>Sumitomo Bakalit Co.</td><td>MS4265-M</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850457P</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1,2-distearoil-snglycero-3-fosfoetanolamin-N-[biyotinil (polietilenglikol)-2000]</td> <td>Avanti Polar Lipidler</td><td>880129P</td><td>Biotin-PEG-DSPE</td></tr></tbody></table>

dev veziküller içinde tek hücreli seviyede bakteriyel hücre kültürü

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Biz dev veziküller (GVs) içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler kültür için bir yöntem geliştirdik. Bakteriyel hücre kültürü, doğal ortamda bakteriyel hücrelerin fonksiyonunu anlamak için önemlidir. Teknolojik gelişmeler nedeniyle, çeşitli bakteriyel hücre fonksiyonları sınırlı bir alan içinde tek hücreli düzeyde ortaya olabilir. GVs, amphiphilik lipid moleküllerinden oluşan küresel mikro boyutlu bölmeler ve hücreler de dahil olmak üzere çeşitli malzemeler tutabilir. Bu çalışmada, tek bir bakteriyel hücre, damlacık transfer yöntemi ile 10 – 30 μm GVs içine kapsüllenmiş ve bakteriyel hücreler içeren GVs cam substrat üzerinde desteklenen bir membran üzerinde immobilize edildi. Bizim yöntemi GVs içinde tek bakterilerin gerçek zamanlı büyüme gözlem için yararlıdır. Biz GVs içinde bir model olarak Escherichia coli (E. coli) hücreleri kültürlü, ama bu yöntem diğer hücre türlerine adapte edilebilir. Bizim yöntemi Mikrobiyoloji, biyoloji, biyoteknoloji ve sentetik biyoloji bilim ve sanayi alanlarında kullanılabilir.

Damlacık Transfer yöntemini kullanarak tek bakteriyel hücreler içeren GVs oluşturmak için basit bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1). Şekil 1a bakteri Içeren GVS yağışında bir şematik görüntü gösterir. Bakteri içeren W/O damlacıkları yağ-su (lipid monolayer) arayüzünde santrifüjleme ile GVs oluşturmak için aktarılır. Sakaroz (iç sulu solüsyon) ve glikoz (dış sulu solüsyon) arasındaki yoğunlukta fark, W/O damlacıkları yağ su arayüzünün ...

Biz dev veziküller (GVs) içinde bakteri tek hücreli kültürü göstermektedir. Bakteriyel hücreler içeren GVs damlacık transfer yöntemi ile hazırlanmıştır ve bakteriyel büyüme doğrudan gözlem için bir cam substrat üzerinde desteklenen bir membran immobilize edildi. Bu yaklaşım, diğer hücrelere de uyarlanabilir.

Dev veziküller Içinde tek hücreli seviyede bakteriyel hücre kültürü

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Bu protokol, dev veziküllerin içindeki tek hücreli seviyede bakteri hücrelerinin kültüre sayılmaması için bir araç sağlar. Dev vezikülleri geliştirmek kolaydır ve vezikülleri hazırlamak için çok küçük bir numune çözeltisi gereklidir. Prosedürü gösteren Yuri Ota, bizim laboratuvar bir doktora adayı olacaktır.Bir cam şişeye 20 mikrolitre taze hazırlanmış POPC çözeltisi ve dört mikrolitre taze hazırlanmış biotin-PEG-DSPE çözeltisi ekleyerek başlayın. Bir lipid film oluşana kadar hava akımı ile organik çözücü buharlaştırmak. Tamamen organik çözücü buharlaştırmak için bir saat için bir kurutucu film yerleştirin.Sonra şişeye 200 mikrolitre mineral yağ ekleyin. Plastik parafin film ile şişe nin açılış kapağı ve en az bir saat boyunca 120 watt bir ultrasonik banyoda şişe içeriğini sonicate. Küçük bir vezikül hazırlığı için, bir lipid film oluşturmak, sadece gösterildiği gibi, ve filme LB orta 200 milimetre lik glikoz 200 mikrolitre ekleyin.Daha sonra filmi en az bir saat boyunca 120 watt'ta sonicate, ardından ortaya çıkan dev veziküllerin mini ekstrüzyon ve 100 nanometre lik gözenek boyutuna sahip polikarbonat membran kullanarak küçük veziküllere ekstrüzyonu. Bakteri hücresi öncesi kültür için, 37 santigrat derece bir gecede kültür için LB orta mililitre içine bir LB plaka E.coli aşılamak. Ertesi sabah, kültürün süpernatant 20 mikrolitre aktarın 1.98 taze LB orta ek iki saat için.Kuluçka sonunda, optik yoğunluğu nu spektrofotometredeki kültür öncesi çözeltinin 600 nanometre veya OD 600 değerinde kontrol edin. 1 ile 1,5 arasında OD 600 ile kültür öncesi çözüm kullanılmalıdır. Daha sonra birinci masaya göre, kültür öncesi solüsyonu taze hazırlanmış sakaroz solüsyonu ve taze LB ortamı ile karıştırın.Dev vezikül oluşumu için, 1,5 mililitre kapaklı plastik tüp için dev veziküllerin taze hazırlanmış dış sulu çözelti50 mikrolitre ekleyin. Yavaşça dev veziküllerin dış sulu çözeltisi üzerinde lipid içeren yağ çözeltisi 150 mikrolitre katman. Yağ ve sulu çözeltilerin arabiriminin düz olduğundan emin olmak için kontrol etmeden önce, ortaya çıkan çözeltiyi oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın.Damlacık oluşumu içeren su ve yağ bakteri hücresi için, 0,6 mililitrelik kapaklı plastik tüpte sonicated lipid içeren yağ çözeltisinin 50 mikrolitresine, dev veziküllerin taze hazırlanmış iç sulu çözeltisinin iki mikrolitresini ekleyin. Ardından, iki bileşeni emülgatörlük için tüpe dokunun. Daha sonra, yağ ve sulu çözelti arayüzüne 50 mikrolitre su ve yağ damlacık çözeltisi eklemek için bir pipet kullanın ve santrifüj ile bakteri hücresi içeren dev vezikülleri tortulayın.Sonra üst yağ tabakası aspire ve dev veziküller toplamak. El yapımı bir hazne hazırlamak için, 10'a 10'a 10'luk çift yüzlü bir mührü delin ve çift yüzlü mührü 30'a 40 milimetrelik kapak camı üzerine yapıştırın. Desteklenen bir iki katmanlı membran hazırlamak için, el yapımı oda deliğine küçük vezikül çözeltisi 30 mikrolitre ekleyin.Vezikülleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, 200 milimiller glikoz ile desteklenen 20 mikrolitre LB orta ile deliği iki kez hafifçe yıkayın. Destekçi iki katmanlı membran üzerinde dev veziküller hareketsizleştirmek için, oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka için deliğe dış sulu dev vezikül çözeltisi neutravidin 10 mikrolitre tanıtmak.Kuluçka sonunda, yavaşça LB orta 20 mikrolitre ile iki kez delik yıkayın, 200 milimiller glikoz ile takviye, ve odasında deliğe dev vezikül çözeltisi tüm hacmi ekleyin. Sonra 18 tarafından 18 milimetrelik kapak camı ile delik mühür. Dev veziküller içindeki bakteri üremesini izlemek için ters mikroskoptaki 40X hedefini seçin ve odayı mikroskop ısıtma sahne sistemine yerleştirin.Daha sonra 37 santigrat derece statik koşullar altında oda içinde bakteri hücre içeren dev veziküller kuluçka, yakalama ve her 30 dakikada bir bakteri hücre büyüme görüntüleri kayıt, bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken kamera ile. Bakteri hücreleri içeren dev veziküllerin boyutları genellikle 10 ila 30 mikrometre arasında değişir. Dev veziküllerin her iki boyutu için, E.coli hücreleri uzama ve bölünme süreçlerinden geçer, bazı E.coli hücreleri altı saatlik gözlem süresi boyunca çok sayıda hücreye büyürler.Tek hücre lisenini içeren dev veziküllerin göreceli sıklığı elde edilen dev veziküllerin yaklaşık %10'udur ve tek hücre düzeyinde kapsüllenmiş dev veziküller bakteri hücreleri içeren dev veziküllerin yaklaşık %50'sikadardır. Yağ-su arabiriminin stabilitesi bakteri hücreleri içeren dev veziküller elde etmek için önemlidir. Dev vezikül düzeltme önce dikkatle yağ aspire dikkat edin.Bu videoyu izledikten sonra, tek tek dev veziküller içinde tek hücre düzeyinde bakteri hücreleri kültür nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bakteri kültürü yöntemimiz, mikrobiyolojide bilinmeyen çevresel bakterilerin metabolik ürünlerini elde etmek veya analiz etmek için yeni bir araçtır.

bacterial-cell-culture-at-the-single-cell-level-inside-giant-vesicles

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Watson, DC, et.al. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, genetiği değiştirilmiş bakterilerin dış zarından türetilen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonunu ve konsantrasyonunu göstermektedir. İşlem, EV'leri serbest bırakmak için bakterilerin kültürlenmesini, ardından hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için sıralı santrifüjleme ve filtreleme adımlarını içerir. Son olarak,...

Dış Zar Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Bakterilerden İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Kaynak: Morita, M., ve diğerleri. Dev Veziküllerin İçinde Tek Hücre Düzeyinde Bakteriyel Hücre Kültürü. J. Vis. Uzm. (2019).Bu video, desteklenen bir lipid çift tabakasına sabitlenmiş dev veziküller içinde kapsüllenmiş tek tek bakteri hücrelerinin kültürlenmesi ve gözlemlenmesi için bir yöntem göstermektedir. Sistem, sınırlı, fizyolojik olarak ilgili bir mikro ortamda tek hücreli büyüme dinamiklerinin kararlı, uzun süreli görüntülenmesini sağlar.

Dev Veziküller İçinde Tek Hücreli Bakteri Kültürü

Kaynak: Cabeen, M. T. ve diğerleri. Bacillus subtilis'in Tek Hücreli Mikrofluidik Analizi. J. Vis. Exp. (2018)Video, tek hücre düzeyinde bakteri büyümesini gözlemlemek için mikrofluidik bir cihazın kullanıldığını gösteriyor. Mikro ölçekli hendeklerde hapsedilmiş hareketsiz bakteriyel hücrelerin sürekli olarak floresan mikroskobu altında nasıl görüntülendiğini ve beslendiğini gösteriyor. Bu kurulum, hücre bölünmesi ve soy takibinin birden fazla nesil boyunca gerçek zamanlı görselleştirilmesini...

Mikrofluidik bir sistemde tek hücre çözünürlüğünde bakteri büyümesini takip etmek

Bu protokolde, prokaryotik mikroorganizmaların tek hücreli analizi için bir mikroakışkan pikolitre biyoreaktörün (PLBR) üretimi, kurulumu ve temel çalışması tanıtılmaktadır. Endüstriyel olarak ilgili mikroorganizmalar, geleneksel yöntemlerle neredeyse imkansız olan, belirli zaman dilimlerinde büyüme hızı, morfoloji ve fenotipik heterojenlik hakkında bilgi sahibi olmaya izin veren ilke kanıtı olarak analiz edildi.

Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

Yüksek oranda paketlenmiş mikrometre boyutunda bileşenler içeren dev kesecikler kullanışlı hücre modelleridir. Yağda su emülsiyonu santrifüjleme yöntemi, kapsüllenmiş malzemelerle dev veziküllerin hazırlanması için basit ve güçlü bir araçtır.

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

Biz örnek olarak Bacillus subtilis kullanarak bireysel bakteri hücre soy mikrosıvısal çözümlenmesi için bir yöntem mevcut. Yöntemi gözlem, hücre nesiller sıkı bir şekilde kontrol edilebilir ve düzgün büyüme koşullar altında yüzlerce izin vererek Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelir.

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

Burada, enfekte amiplerin ayrılması için tek bir hücreli mikro-aspirasyon yöntemini tanımlıyoruz. Faustovirüsler ve bilinmeyen dev virüsler tarafından enfekte Vermamoeba vermiformis viral alt popülasyonları ayırmak için, aşağıda ayrıntılı protokolü geliştirdi ve iki düşük bolluk yeni dev virüs ayırma yeteneğini gösterdi.

Dev Virüs Karışım Ayırma için Floresan-Aktive Hücre Sıralama alternatif bir strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Mevcut protokol, siyanobakteriyel kültürlerden hücre dışı veziküllerin izolasyonu, konsantrasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı açıklamalar sunmaktadır. Vezikülleri farklı ölçeklerdeki kültürlerden arındırmaya yönelik yaklaşımlar, metodolojiler arasındaki ödünleşimler ve saha örnekleriyle çalışmak için dikkat edilmesi gerekenler de tartışılmaktadır.

Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu

Bu protokol, bir model membran proteininin lipid çift tabakasına sentezinin ve dahil edilmesinin araştırılması için dev bir unilamellar vezikül (GUV) içinde bir hücresiz ekspresyon (CFE) sistemini kapsüllemek için kullanılan ters emülsiyon yöntemini tanımlar.

Bakteriyel Glutamat Reseptör Kanalının, Hücresiz Bir Ekspresyon Sisteminin Kapsüllenmesi ile Sulandırılması

Bu makale, iç, halka ve dış bölgelerde özelleştirilmiş elektriksel iletkenliğe sahip, vezikül içinde vezikül yapısına sahip bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin (cGUV'ler) hazırlanması için bir yöntem sunar. Elektroformasyon, ozmotik şok yoluyla stomatositlere ve cGUV'lara dönüştürülen basit GUV'leri sentezler ve çekirdekli hücrelerin biyofiziğini incelemek için değerli bir model sağlar.

Bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin Sentezi: Çekirdek Hücrelerin Biyomimetik Bir Modeli

Keşfedin dev veziküller içinde tek hücreli seviyede bakteriyel hücre kültürü yöntemini. Damla transferi tekniği ile hazırlanan veziküller, bakteri büyümesinin doğrudan gözlemlenmesini sağlar.

Dev veziküller Içinde tek hücreli seviyede bakteriyel hücre kültürü

Daha fazla video keşfet