Kas hastalığının yapısal temelini Incelemek için bir araç olarak bozulmamış Murine Iskelet kasının X-ışını kırması
18 Temmuz 2019
Biz bozulmamış fare iskelet kasları kullanarak küçük açılı X-ışını dikeslenme denemeleri gerçekleştirmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. İnsan hastalıkları için transgenik fare modellerinin geniş kullanılabilirlik ile, bu deneysel platform genetik kas hastalıklarının yapısal temeli aydınlatılmasına için yararlı bir test yatağı oluşturabilir
Fizyolojik olarak bozulmamış fare iskelet kası, fizyolojik süreçlere ışık tutturabilecek çok yapısal bilgiler içeren yüksek kaliteli X-ışını kırınım desenleri üretebilir. X-ışını kırınımı gerçek fizyolojik zamanlı olarak gerçek fizyolojik koşullar altında canlı kas dokusundan yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi edinimi sağlayan tek tekniktir. Birçok kas hastalıkları kalıtsaldır.
Genetik miyopatilerin çoğu modelini değiştirmek için artan kullanılabilirlik ile, X-ışını kırınımı hastalık mekanizmaları yapısal anlayışlar sağlayabilir ve terapötik stratejiler gösterebilir. En ekstansör digitorum longus ve soleus kasları bu amaç için özellikle uygundur. Ama küçük hayvanlarda diğer birçok kas bozulmadan kesilebilir ve benzer bir şekilde ele alınabilir.
İşleme başlamadan önce, birleşik motor kuvvet transdüserini, yüksek güçbihasik akım uyarıcısına sahip motor kuvvet transdüser denetleyicisini ve bilgisayar kontrol veri toplama kontrol sistemini açın. Daha sonra, soğuk Ringer çözeltisi ile farenin arka ekstremite deri sprey ve uyluk etrafında deri kesmek için ince diseksiyon makası kullanın. Beş numaralı kasları kullanarak, kasları ortaya çıkarmak ve arka ekstremiteyi kesmek için deriyi hızla aşağı çekin.
Oksijenli Ringer çözeltisi içeren bir elastomer kaplı diseksiyon çanak ekstremite yerleştirin ve bir dürbün diseksiyon mikroskobu altında çanak yerleştirin. Soleus kas hasat için, gastroknemius kas yukarı bakacak şekilde arka ekstremite pin. Gastroknemius/soleus kas grubunun distal tendonunu kesmek için ince makas kullanın.
Kasların yavaşça ve yavaşça kemikten uzak kalabilmesi için gastroknemius kasının her iki tarafındaki fasyayı kesin. Sonra soleus kas proksimal tendon serbest. Gastroknemius kas ve çanak distal tendon içeren kas grubu aşağı pin.
Gastroknemius kas ayırmak için proksimal tendon yoluyla hafifçe soleus kas kaldırın, soleus distal tendon mümkün olduğunca sağlam kadar bırakarak. Ekstansör digitorum longus veya EDL kas hasat için, tibialis anterior kas yukarı bakan çanak arka ekstremite pin ve tibialis anterior kas boyunca fasya kesti. Fasya açık çekmek ve tibialis ön kas distal tendonu kesmek için forceps kullanın.
Tibialis ön kas kaldırın ve EDL kas çekmeden dikkatle kesip, ve iki tendonu ortaya çıkarmak için diz yan tarafını açık kesti. Proksimal tendonu kesin, mümkün olduğunca tendonun çok hala kas bağlı ve yavaşça EDL kas kaldırmak için tendon çekin bırakarak. Sonra maruz kaldığında distal tendonu kesin.
Hasat kas monte etmek için, tendonu ile kas aşağı pin ve mümkün olduğunca ekstra yağ, fasya ve tendon kadar kırpma. Önceden bağlanmış bir düğüm içine bir tendon yerleştirin ve sütür sıkıca bağlamak için dikiş bağlama forceps kullanın. Metal kanca etrafında ikinci düğüm kravat ve tendon diğer ucunda prosedürü tekrarlayın.
Daha sonra kısa kancayı deney odasının altına, uzun kancayı da çift modlu kuvvetli transdüser motora takın. Çözeltiyi %100 oksijenle deneysel odada kabarcıklayın. Stimülasyon protokolünü ve kas uzunluğunu optimize etmek için transdüser motora bağlı mikro manipülatörleri ayarlayarak kasları germek için en iyi uyarıcı parametreleri bulmak için 15 ila 20 milinewton arasında bir temel gerilim oluşturun.
Stimülasyon voltajını 40 volta ayarlayın. Seğirme kuvvetinde ek bir artış olmayana kadar stimülasyon akımı sistematik olarak artacaktır. Optimal uzunluğu bulmak için, kas uzunluğunu artırmak ve aktif kuvvet artan durur kadar tek bir seğirme ile kas etkinleştirmek.
Montaj test etmek ve gerektiğinde optimum temel kuvvet geri kas germek için bir saniyete tetanik kontraksiyon gerçekleştirin. Sonra dijital kaliper ile milimetre kas uzunluğunu kaydedin. Işın konumunu belirlemek için, x-ışınları ve kağıt üzerinde yanık işareti ile hizalanmış bir artı işareti oluşturmak için bir video crosshair jeneratör yanıt olarak karanlık bir nokta üreten X-ışını duyarlı kağıt bir parça kullanın.
BioCAT tarafından sağlanan grafik kullanıcı arayüzünü örnek pozisyonlayıcıya kullanarak, kiriş pozisyonundaki kasları ortalayın ve numune odasını saniyede 10 ila 20 milimetre hızla salınımyapmak ve pozlama sırasında X-ışını dozunu tüm kaslara yaymak için hareket ettirin. Kollajen içeren büyük fasya bölgelerini önlemek ve seyahatinin tüm yolu boyunca ışıklı kalmasını sağlamak için numuneyi gözlemler. Dedektörü silahlandırın ve veri toplama sisteminden tetikleyiciyi bekleyin.
Sonra mekanik ve X-ışını verilerini aynı anda tetikleyin ve senkronize edin. X-ışını desenleri protokol boyunca 10 milisaniyelik pozlama süresi ve 50 milisaniyelik pozlama süresi ile sürekli olarak toplanacaktır. Bu temsili izometrik tetanik kasılma EDL kas bir saniye aktif hale getirilmeden önce 0.5 saniye istirahat tutuldu, ardından 1.5 saniyelik bir gevşeme.
Kas X-ışını kırınım deseni sarcomere içindeki yapılardan nanometre çözünürlüğü yapısal bilgi verebilir. Kalın filamentler içeren miyozin bazlı tabaka çizgileri güçlü ve dinlenmiş kas desenleri keskin, ince filamentler içeren aktin tabanlı tabaka çizgileri kas daralma desenleri daha belirgin iken. Daralma deseninden istirahat deseni çıkarılarak elde edilen fark desenleri, sağlıklı ve hastalıklı kaslarda kuvvet gelişimi sırasında yapısal değişikliklere ışık tutabilir.
Kas kasılması ve gevşemesi sırasında moleküler olayların milisaniye ölçeğinde bu yapısal değişiklikleri izleyerek, X-ışını kırınım desenleri önemli yapısal bilgiler ortaya çıkarabilir. Açık kaynak MuscleX paketinde Ekvator rutini kullanılarak yapılan bu temsili ekvatoral yansıma analizinde, ekvatoral yoğunluk oranı miyozinin istirahat kaslarında aktin eki olduğunu gösterir ve murine iskelet kasının sözleşmeli çapraz köprü sayısıile yakından ilişkilidir. İki 1, 0 yansıma arasındaki mesafe interfilament aralığı ile ters orantılıdır.
Temiz bir diseksiyon başarılı bir bozulmamış kas X-Ray deney için anahtardır, bu yüzden kas hazırlık sırasında herhangi bir mekanik hasar önlemek için deneyin. Tüm kaslar ile herhangi bir standart fizyolojik protokol bu deneylerde uygulanabilir ve hızlı mekanik geçicilik sırasında kas aktivasyonu, gevşeme ve çapraz köprü davranışı çalışma için kullanılabilir. Farelerin genetik manipülasyonu giderek daha karmaşık hale gelmektedir.
Yeni transgenik fare modelleri insan miyopatileri için yeni terapötik yönleri göstermek için daha spesifik ve anlayışlı deneylerin tasarlanmasını sağlayacaktır.
Genel Bakış
Bu makale, sağlam fare iskelet kasları üzerinde küçük açılı X-ışını kırınımı deneyleri gerçekleştirmek için protokoller sunmaktadır. Bu yöntem, transgenik fare modellerinin kullanılabilirliğinden yararlanarak, genetik kas hastalıklarının yapısal temeline dair bilgiler sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Kas Fizyolojisi
Arka Plan
- X-ışını kırınımı, canlı kas dokusundan yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler sağlar.
- Kas hastalıklarının anlaşılması, yapısal analizler yoluyla elde edilen bulgulardan fayda sağlayabilir.
- Miyopatilerin incelenmesi için transgenik fare modellerine erişim giderek artmaktadır.
- Extensor digitorum longus ve soleus gibi spesifik kaslar bu deneyler için uygundur.
Çalışmanın Amacı
- Kasın kasılma ve gevşeme sırasındaki yapısal değişikliklerini aydınlatmak.
- Kalıtımsal kas hastalıklarının mekanizmalarını incelemek için bir platform sağlamak.
- Yapısal bulgulara dayalı potansiyel terapötik stratejileri belirtmek.
Kullanılan Yöntemler
- Farelerden sağlam iskelet kaslarının toplanması.
- Fizyolojik koşullar altında X-ışını kırınımı deneylerinin kurulması.
- Kas stimülasyonu için çift modlu bir kuvvet transdüseri kullanımı.
- Nanometre ölçeğindeki yapısal değişiklikleri analiz etmek için X-ışını desenlerinin toplanması.
Ana Sonuçlar
- X-ışını kırınımı desenleri, sarkomerler hakkında yapısal bilgiler sunar.
- Dinlenme ve kasılma halindeki kaslar arasındaki desen farklılıkları, kuvvet gelişimi hakkında bilgiler sağlar.
- Yapısal değişiklikler, kas aktivitesi sırasında milisaniye ölçeğindeki zaman dilimlerinde takip edilebilir.
- Bulgular, kas fonksiyonunun ve hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sonuçlar
- Bu çalışma, kas araştırmalarında X-ışını kırınımının faydalılığını göstermektedir.
- Elde edilen bilgiler, kas hastalıkları için terapötik yaklaşımlara temel oluşturabilir.
- Bu yöntem, kas fizyolojisi ve patolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama Alanları
Skeletsel murine kas dokusunun bozulmamış haldeki X-ışını kırınımı, fizyolojik koşullar altında nanometre ölçekli yapısal analize olanak tanıyarak kas hastalığı modellerinde genotip ile fonksiyonel fenotip arasında doğrudan bir bağlantı sağlar. Bu yaklaşım, kuvvet gelişimi sırasındaki sarkomerik yapısal değişiklikleri ortaya çıkararak hedef doğrulamayı destekler ve kalıtsal miyopatilerdeki terapötik stratejiler için mekanistik risk azaltma imkanı sunar. Yöntem, filamanlar arası boşluğu ve çapraz köprü dinamiklerini milisaniye zaman ölçeklerinde nicelendirerek preklinik modellerdeki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Genetik modifikasyonları, sağlam kaslardaki sarkomerik yapısal değişikliklerle ilişkilendirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Kasılma sırasında miyozin-aktin etkileşimlerinin gerçek zamanlı yapısal okumaları aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulamasına olanak tanır.
- Bilimsel Değer: Çapraz köprü bağlanmasının ve filamentler arası boşluğun yapısal korelasyonlarını nicelendirerek öngörü güvenilirliğini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Doğal kas mimarisini ve fizyolojisini koruyarak, sonraki iş akışları için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Kontrollü stimülasyon protokolleri ve senkronize X-ışını veri toplama yoluyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Bilimsel Değer: Ekvatoriyel yoğunluk oranları ve katman çizgisi analizleri gibi kantitatif yapısal çıktılar aracılığıyla tarama hazırlığını vurgular.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Transgenik modellerdeki yapısal değişiklikleri insan miyopati mekanizmalarıyla ilişkilendirerek hastalığın ilgili olduğu durumları tartışır.
- Operasyonel Değer: Boylamsal yapısal izleme imkanı sağlayarak, keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan süreçteki sürekliliği tanımlar.
- Bilimsel Değer: Hastalık progresyonunun yapısal biyobelirteçlerini belirleyerek, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını ele alır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, fizyolojik koşullar altında kas fonksiyonunun yapısal fenotiplemesini sağlayarak, hedef doğrulamadan preklinik doğrulamaya kadar olan keşif sürekliliğine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Yöntemin, sarkomer dinamiklerinin yapısal analizi yoluyla hipotez testini, yolak aydınlatmasını ve biyolojik risk azaltmayı nasıl desteklediğini açıklar.
- Tarama: Senkronize mekanik ve X-ışını veri toplama aracılığıyla analiz hazırlığını, tekrarlanabilirliği ve kantitatif çıktıları tanımlar.
- Analitik: Ekvatoral yoğunluk oranları ve yansıma aralıkları dahil olmak üzere, ekiplerin koşulları karşılaştırmasına yardımcı olan ölçümleri, okumaları veya istatistiksel çıktıları vurgular.
- Translasyonel Araştırma: Hastalık modelleri genelindeki yapısal değişiklikleri takip ederek, yöntemi preklinik sürekliliğe veya biyobelirteç uyumuna bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standartlaştırılmış montaj ve stimülasyon protokolleri aracılığıyla yöntemi, tek seferlik bir teknikten ziyade yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçeveler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tahminsel güven, hedef doğrulama, mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Daha iyi devam/dur kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Riski ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Kas fizyolojisi, X-ışını kırınımı ve transgenik model kullanımı konularında gerekli bilimsel uzmanlık.
- Senkrotron ışın hatları, çift modlu kuvvet dönüştürücüler ve senkronize veri toplama sistemleri dahil olmak üzere enstrümantasyon ve analitik altyapı ihtiyaçları.
- Laboratuvarlar arası kas diseksiyonu, montajı ve stimülasyon protokolleri için ekipler arası standardizasyon gereksinimleri.
- Özellikle farklı fare kasları ve hastalık modelleri için model sistemler genelindeki adaptasyon değerlendirmeleri.
- Fasya kontaminasyonunu önlemek ve pozlama sırasında numune bütünlüğünü korumak için temiz diseksiyon gerekliliği gibi kaynak materyallerle desteklenen pratik sınırlamalar.
