Sekonder Bakteriyel Pnömoni Murine Modelleri için Hassas Patojen Dağıtım ve Kurtarma Sistemi

Bu işlemin genel amacı, alt solunum yolu içine bakteriyel aşılama basit ve noninvaziv bir rota sağlayarak ikincil bakteriyel pnömoni çalışmaları geliştirmek ve transkript analizi için RNA bakteriyel kurtarma ve arınma takip etmektir. Bu ilk derinbir fare anestezi ve dikey maksiller kesici dişlerden askıya alınmış bir farenin trakea içine önceden yüklenmiş künt uçlu bükülmüş iğne takarak yapılacaktır. İkinci olarak, başarılı bir enfeksiyon dan sonra, bakteri kolonisi oluşturan birimler eksizyon ve akciğerlerin homojenizasyonu ile geri kazanılır.

Ortaya çıkan akciğer homojenate seri seyreltilmiş ve koloni oluşturan birimleri sayısallamak için besin agar üzerine kaplanır. Son olarak, RNA akciğer homojen saflaştırılır. Bu işlemin avantajları, doğrudan alt solunum yolu içine kontrollü bir doğum sağlar olmasıdır.

Bu da patojenin hastalığın sonucuna hem kombinatoryal hem de bireysel katkılarına bakmamızı sağlar. Bu alandaki son gelişmeler, bakteriyel gen regülasyonunun enfeksiyonun sonucunu belirlemede büyük rol olabileceğini göstermiştir. Bu teknik, hem bakteriyel CPU'ları hem de RNA'yı kurtarma yeteneğinden yararlanır.

RNA izole olduktan sonra, spesifik virülans genlerinin enfeksiyona olan katkılarını değerlendirebiliriz. Buna ek olarak, bu teknik cerrahi olmayan olmanın yararları. Bu, bu işlem de kullanılan herhangi bir hayvan üzerinde en az stres yerleştirilmesini sağlar ve onları hemen iyileşme sağlar.

Bu prosedür, herhangi bir kanül, kılavuz tel veya fiber optik kablo kullanmadan ortak laboratuvar ekipmanı kullanmaktan yararlanır. Bu teknik yeni bireyler trakea ile gerçek kurulum ile ilk başta mücadele edebilir. Bu teknik kavramsallaştırıldıktan sonra, bir murine konak içinde ikincil bakteriyel pnömoni sorgulamak için basit ve etkili bir prosedür haline gelir.

İşleme başlamadan önce, çalışma alanını aşağıdaki malzemelerle hazırlayın: entübasyon platformu, steril bir mL şırınga, steril künt uçlu büşnör, steril 21-gauge künt uçlu iğne ve şırınga ve forceps saklamak için iki konik tüp. Patojen inokülleri hazırlayarak, istenilen son konsantrasyonun 50 mikrolitrelik bir hacimde elde edilebilmektedir. Daha sonra, steril eldiven kullanarak yaklaşık 35 derecelik bir açıya bükerek bir ila 1,5 inç 21-gauge-blunt uçlu iğne hazırlamak.

İğneyi şırıngaya sabitledikten sonra, 100 mikrolitrelik bir hava yastığı çizin ve ardından 50 mikrolitre enfeksiyöz madde yi deneyin. 100 mikrolitrelik hava yastığı, şırınga depresyona girdiğinde patojen yükünün tam olarak teslim edilmesini sağlar. Yüklü iğne ve şırıngayı baskın eltarafından kolayca erişilebilen bir yere yerleştirin.

Fareyi anestezi odasından çıkarın ve anestezi edin ve maksiller kesici dişlerden entübasyon platformundaki fareyi askıya alın. Künt uçlu forceps kullanarak, yavaşça kavramak ve dil uzatmak. Dili forsepsten baskın olmayan elin başparmak ve işaret parmağına aktarın.

Dili baskın olmayan elde tutarak tutun ve önceden yüklenmiş şırıngayı alın. İğnenin bükülmüş ucunu vücuttan uzaklaştırın. İğneyi ağız boşluğuna yerleştirin.

Dilin tabanında hafifçe açı bilek uzak vücuttan iğne hafif bir itme neden olur. Bu eylem, iğnenin yemek borusuna değil, nefes borusuna yerleştirilmesini sağlar. İğneyi yavaşça nefes borusuna doğru yönlendirin.

İğne ses kıvrımından geçerken genellikle hafif bir kene hissedilir. İğne karina ile karşılaştığında hafif bir direnç hissedene kadar iğneyi trakeadan geçirin. Hafifçe karina üzerinde iğne askıya almak için yukarı yönde iğne kaldırın.

Bu birincil bronşiçine teslim sağlar. Enfeksiyöz yükü sağlamak için şırınga pistonuna tamamen bastırın. İğneyi nefes borusundan çıkarın ve atın.

Kauçuk bandı bastırarak fareyi entübasyon platformundan çıkarın, ancak fareyi dik konumda tutmayı koruyun. Doğrudan nares üzerine bir parmak yerleştirerek burun hava yollarını engelleyin. Yaklaşık bir dakika veya birkaç derin nefes gözlenene kadar bu pozisyonda tutun.

Bu son adım, toplam inokül hacminin alt solunum yolu içine teslim edilmesini sağlar. Hayvanı kafesine geri getirin ve anesteziden çabuk iyileştiğinden emin olun. Seçilen zaman noktalarında enfeksiyon sonrası enfekte akciğerler, sekonder bakteriyel pnömoni ile ilişkili artan morbiditelere bakteriyel katkıları ölçmek ve değerlendirmek için eksised edilebilir.

Aşağıdaki öğelerle bir çalışma alanı hazırlayın: ölçek ve steril tartı teknesi, diseksiyon platformu, makas ve keten ler içeren bir diseksiyon kiti ve steril gazlı bez. Bu gösterinin amaçları için akciğerlerin eksizyonu bir bank ın üzerinde yapılacaktır. Ancak bu işlem boyunca kısırlığı korumak için akciğer eksizyonunun laminar akış kaputu içinde yapılması tavsiye edilir.

Enfekte olmuş bir fareyi CO2 veya benzer IACUC onaylı ötanazi yöntemiyle ötenazi. Enfekte fareyi diseksiyon platformuna yerleştirin ve sabittutun. Çalışma yüzeylerinde kısırlığı korumak için fareyi etanolle püskürtün.

Göbek başlayarak, cildi kaldırmak ve gırtlak doğru bir kesi yapmak için bir çift forseps kullanın. İlk kesinin her iki tarafındaki deriyi kavrayarak, deriyi vücuttan uzaklaştırın ve doku bağlantılarını keser. Bu torasik bölgenin daha ortaya çıkarmak için cilt boyunca lateral kesim yapmak yararlı olabilir.

Ksifoid işleminin tabanından başlayarak, diyafram delinme niyeti ile küçük bir kesi yapmak. Bu da göğüs boşluğundaki basınç artışıyla sonuçlanır ve akciğerlerin geri çekilmesine neden olur. Akciğerler geri çekilirken diyaframı serbest etmek için kesite devam edin.

Her iki tarafta bir kesi yaparak kaburga çıkarın. Bu göğüs boşluğunu ve akciğerleri ortaya çıkaracak. Akciğerleri çıkarmak için forseps ile kalbin tabanını kavramak ve yukarı kaldırın.

Akciğerlerin arkasına makas yerleştirin ve yukarı kalp kaldırmaya devam ederken doku bağlantıları ile küçük kesiler yapmaya başlar. Akciğerler çıkarıldıktan sonra, steril bir gazlı bez üzerine yerleştirin ve akciğerlerden kaldırarak ve kalan doku bağlantıları keserek kalbi çıkarın. Akciğerleri önceden taranmış tartı teknesine aktarın ve kütleyi kaydedin.

Akciğerler tartıldıktan sonra akciğerleri steril fosfat tamponlu saline aktarın ve geçici olarak buzüzerinde saklayın. Akciğerler inmiş ve tartıldığına göre, bakteriler patogeneziye karşı rollerini belirlemek için kurtarılabilirler. Bakteriyel iyileşme için hazırlık olarak, aşağıdaki malzemeleri gerekli olacaktır: bir doku öğütücü, steril RNase-free PBS, tampon RLT beta-merkaptoetanol ile desteklenen, ve 1.5 mL RNase-free mikrosantrifüj tüpler.

İlk olarak doku öğütücüye bir mL steril RNase içermeyen PBS ekleyerek başlayın. Doldurulduğunda, doku öğütücüsi buz üzerinde saklayın. Daha sonra, enfekte akciğerlerden elde edilen bakteri yükünü ölçmek için bir dizi steril RNase içermeyen seri seyreltme tüpü hazırlayın.

Akciğerleri hazırlanan doku öğütücüse aktarın ve dönerken kaideye bastırarak dokuyu iyice homojenize edin. Hazırlanan seri seyreltme tüplerinin ilkine homojenize numunenin doku öğütücüsünü ve 100 mikrolitresini açın. Koloni oluşturan birimleri sayısallandırmak için besin agarı üzerindeki numuneleri ve plakayı seri olarak seyreltin.

CPU'lar, akciğer dokusunun miligramı başına mL veya mL başına CPU olarak kaydedilebilir. 100 mikrolitre aliquot kaldırıldıktan sonra, taşlama kaidesini değiştirin ve numuneyi 4,000 rpm'de 4 derece santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Santrifüj tamamlandığında, peletli örnekten supernatant çıkarın.

Supernatant kaydedilebilir ve daha sonraki bir tarihte daha fazla analiz için eksi 80 santigrat derece saklanabilir. 700 mikrolitre RLT beta-mercaptoetanoldeki homojenize doku peletini yeniden askıya alın ve numuneyi steril RNase içermeyen 1,5 mL santrifüj tüpe aktarın. Bu noktada örnek eksi 80 derecede saklanabilir.

RNA, numuneyi 1 milimetre lik silika boncukiçeren iki mL mikrosantrifüj tüpe yükleyerek rlt akciğer homojen bulamacından arındırılabilir ve saniyede altı metre de 20 saniye boyunca bir boncuk çırpıcı ile işlenebilir. RNA sonra hemen Voyich, ve ark bildirilen RNeasy yönteminin bir adaptasyon kullanılarak saflaştırılır. Moleküler Biyoloji yöntemleri"2008 ve bu video eşlik el yazması nda açıklanmıştır.

Saflaştırma sonrasında, RNA verimi bir spektrofotometre kullanılarak ölçülebilir. Bir kez sayısallaştırılmış, mikrolitre başına 50 nanogram birkaç aliquots içine ortaya çıkan RNA seyreltmek için yararlıdır. Bu, numunedeki RNA'nın birden fazla donma-çözülme döngüsüne tabi tutulmadan birden fazla analiz için kullanılmasını sağlar.

Bu tekniğin kullanımı, kontrollü bir patojen yükün doğrudan alt solunum yolu içine yerleştirilmesine olanak sağlar. Bu dağıtım sisteminin verimliliği% 1 Coomassie parlak mavi çözüm kurulumu ile gösterilebilir. Üst sıra bir kontrol olarak hizmet etmek için enfekte olmayan akciğerler bir çift görüntüler, alt satır bir intratrakeal kurulum yoluyla% 1 Coomassie parlak mavi boya 50 mikrolitre almış akciğerlerin bir çift görüntüler.

Bu boyanın kullanımı intratrakeal kurulum un patojen yükünün sol ve sağ akciğerlere eşit dağılımını sağladığını göstermektedir. Enfekte olduktan sonra, patojen yükü akciğer dokusunun eksizyonu ve homojenizasyonu ile intratrakeal kurulum sonrası çeşitli zaman noktalarında kurtarılabilir ve analiz edilebilir. Bu kurtarma tekniğinin etkinliğini göstermek için her biri üç fare içeren iki gruba düşük ve yüksek dozda Staphylococcus aureus büründü.

Bakteriyel girdi, Cpu'ları oyalamak için besin agarı üzerine kaplandı. İntratrakeal kurulumdan bir saat sonra fareler ötenaziye alındı, akciğerler çıkarıldı ve doku öğütücüse homojenize edildi. Homojenleştirilmiş doku seri seyreltilmiş ve CUS'ları oyalamak için besin agar üzerine kaplandı.

Homojenize akciğer dokusundan izole edilen RNA ters transkriptaz PCR ile incelenebilir ve hedef genlerin göreceli transkript bolluğunu ölçmek için kullanılabilir. En az arka plan DNA kontaminasyonu sağlamak için ters transkriptaz ilavesi olmadan bir PCR reaksiyonunun herhangi bir qRT-PCR reaksiyonu ile birlikte çalıştırılması önerilir. Bakteriyel yüklere ek olarak, bu teknik viral yüklerin kurulumu ve izolasyonu için genişletilebilir.

Akciğer dokusunun homojenizasyonunu takiben, viral RNA izole edilebilir ve viral genlerin transkript bolluğunu ölçmek veya viral niceleme için standart bir eğri oluşturmak için kullanılabilir. Bu sistemin kullanımı sekonder bakteriyel pnömoni çalışması için son derece verimli ve tekrarlanabilir bir sistem sağlar. Bir kez hakim, bu yordam büyük ölçekli deneylerde kullanılabilir.

Fareleri ötenazi yapmak için gruplar halinde çalışan intratrakeal kurulum fare başına 30 saniye içinde oluşabilir. Bu tamamlandıktan sonra, akciğerlerin eksizyonu üzerine hareket, bu fare başına yaklaşık 2-3 dakika içinde tamamlanabilir. Burada tartışılan yöntemler ikincil bir bakteriyel enfeksiyon bağlamında olsa da, bir inokül kontrollü bir doğum ve kurtarma gerekli olduğu herhangi bir prosedür doğru uzatılabilir.

Burada açıklanan yöntemlere ek olarak, bu işlem akciğerlerin eksizyonu önce bir bronkoalveoler lavaj eklenmesi ile desteklenebilir. Bu genellikle patojen yükünün azalmış bir iyileşme ile sonuçlanırken, sitokin analizi, laktat dehidrogenaz aktivitesi ve farklı hücresel popülasyonların belirlenmesi gibi verilerin elde edilmesinden yararlanır. Hastalık patogenezini daha tam olarak anlamak için hem konak hem de patojenin hastalığa katkılarını sorgulamak önemli hale gelir.

Bu videonun amacı bir murine konak içinde ikincil bakteriyel pnömoni keşfetmek için basit ve etkili bir yöntem sağlamaktı.