Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli
August 26th, 2019
Burada, erken doğum sonrası farelerin korteksine nakledilen kortikal internöron atalarının aktivitesini manipüle etmek için kemogenetik araçları kullanmak üzere tasarlanmış bir protokol sıyoruz.
Bu yöntemle, kortikal internöron öncüllerinin olgunlaşması üzerine içsel aktivitenin etkilerini inceleyebiliriz. Bu teknik, bilim camiasının çoğunluğu tarafından erişilebilir kortikal internöron progenitors hücresel özellikleri hedefleme ve manipüle için etkili bir yol sağlar. Bu protokol, numune lerin ve ekipmanların titizlikle işlenmesini içerir ve görsel gösteri ile en iyi şekilde takdir edilebilir.
Su geçirmez bir kalem kullanarak, altı 35 milimetrelik Petri yemekleri alt yüzeyinin alt kısmının ortası boyunca düz bir çizgi çizin. PBS'de 35 milimetrelik Petri yemeklerinin ikisine 10 mililitre sıvı %4 düşük jelleştirici agarose ekleyin ve her numune arasında üç ila beş milimetre boşluk bırakarak, düz hat boyunca her çanak başına aşağı bakan koku ampulleri ile agarose üç ila dört parçalanmış beyin gömmek. Tüm beyinler gömülü olduğunda, agarose katılaşmak ve agarose tek bir blok içine üç beyin oyma izin vermek için dört derece santigrat derece bulaşıkları yerleştirin, örneklerin kenarlarında jel yaklaşık üç milimetre bırakarak.
Bir mikrotom tabanının yüzeyinde blok tutkal ve üç bağımsız blok elde etmek için her doku örneği arasında bloğun alt tüm yol kesmek için bir cerrahi bıçak kullanın. Daha sonra, 250 mikrometre kalınlığında dilimler halinde buz soğuk Krebs çözüm blokları bölüm için bir titreşimli bıçak mikrotom kullanın, medial veya kaudal ganglionic eminences içeren sadece dilimleri toplamak için bükülmüş bir düz microspatula kullanarak. Daha sonra, bireysel polistiren merkezi iyi organ kültürü yemekleri minimal temel ortamda yüzen bireysel 13 mikrometre çapı, sekiz mikrometre gözenek boyutu filtre membranlar üzerine her bölümü yerleştirin.
Tüm bölümler elde edildiğinde, bir saat boyunca 37 santigrat derece bir karbondioksit doku kültürü kuluçka içinde bulaşıkları yerleştirin. Odak DNA enjeksiyonundan önce, buz gibi Krebs çözeltisine bir milimetre çapında, 225 milimetre uzunluğunda, iki mililitre kapasiteli cam pipetle delikli 10 milimetre uzunluğunda agarose kolonları yerleştirin. Bir cerrahi bıçak kullanarak, elektroporasyon elektrot yüzeyine sığacak şekilde agarose bir küçük parça ve odak DNA enjeksiyonları için bir üs olarak kullanılmak üzere bir büyük parça kesti.
Sonra, buz soğuk Krebs çözeltisi içine agarose blokları yerleştirin. Enjeksiyon için, her vektör için mikrolitre konsantrasyonu başına bir mikrogram da ifade ve kontrol vektör DNA karıştırın ve bir ila 10 seyreltme hızlı yeşil stok çözeltisi ekleyin. Çekilen 0,5 milimetrelik iç çapı, bir mililitrelik dış çaptaki cam mikropipeti 10 mikrolitre DNA karışımıyla doldurun ve mikropipeti pnömatik PicoPump enjektöre yükleyin.
Bir stereo mikroskop altında agarose büyük blok yerleştirin ve agarose parçası üzerine enjekte edilecek dilim yerleştirin. Daha sonra, dilimin seçilen medial ganglionik veya kaudal ganglionik saygınlık bölgesine 25 ila 50 nanolitre hacim enjekte edin. Enjeksiyondan hemen sonra, Petri çanak elektrot üzerine küçük agarose blok yerleştirin ve mobil kapak elektrot agarose sütun eklemek için düz uçlu microspatula kullanın.
Enjekte edilen dilimi destek membranı ile agarose bloğuna aktarın ve üst elektrodu agarose sütunu ile dilimin seçilen bölgesinin üzerine yerleştirin. Sonra, 125 volt, 500 milisaniye arayla iki beş milisaniyelik darbeler ile bölgeyi elektroporate. Elektroporasyondan sonra, destek membranı ile dilimi geri tutma kabına yerleştirin ve kabı doku kültürü kuluçka makinesine geri döndürün.
Bir saat sonra, birincil nöronal kültürler için uygun temel bir orta ile minimal temel orta değiştirin ve bir gecede kuvöz için dilimleri iade. Bu elektroporasyon deneylerinde, GFP pozitif nöronların yaklaşık %50'si RFP pozitif enjekte edilen proteini birlikte ifade etti ve bu nedenle GFP pozitif RFP negatif popülasyon, enjekte edilen DNA ligandlarının etkisi için bir iç kontrol görevi gösterdi. Klozapin ve oksit uygulaması bu yenidoğan koronal doku kesitlerinde aktiviteye bağımlı protein c-Fos'un ekspresyonunda gösterildiği gibi transfected RFP pozitif hücrelerin aktivitesini seçici olarak arttırır.
Klozapin ve oksit tedavisi de gfp-pozitif RFP-pozitif hücrelerin in oranında bir artış ile sonuçlanır GFP-pozitif RFP-negatif hücrelerin sayısına göre araç uygulanan çöp ler ile karşılaştırıldığında. Bu prosedür, aktivite modüle aşılı internöronların dolaşım plastisite ve konak beyin fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, erken doğum sonrası farelerde kemojenetik araçlar kullanarak kortikal internöron progenitörlerinin aktivitesini manipüle etmek için bir protokol sunar. Yöntem, araştırmacıların bu internöron öncülerinin olgunlaşması üzerindeki iç aktivitenin etkilerini keşfetmelerine olanak tanır ve kortikal fonksiyonun daha derin bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Kortikalde gelişim
- Kemojenetik
Arka Plan
- Kortikal internöronlar beyin fonksiyonunda kritik roller oynar.
- Onların olgunlaşmasının anlaşılması nörolojik araştırmalara katkıda bulunabilir.
- Kemojenetik, nöronal aktivitenin hassas kontrolünü sağlar.
- Doğum sonrası fareler, kortikal gelişimi incelemek için uygun modellerdir.
Çalışmanın Amacı
- Nakil edilen kortikal internöron progenitörlerinin aktivitesini manipüle etmek.
- Internörön olgunlaşması üzerindeki iç aktivite etkilerini incelemek.
- Araştırmacılar için yaygın olarak erişilebilir bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Manipülasyonlar için erken doğum sonrası farelerden ex vivo beyin dilimleri hazırlanmıştır.
- Biyolojik model, nakil edilen kortikal internöron progenitörlerini içermiştir.
- Kritik adımlar arasında agaroz içinde doku gömme ve hedeflenen DNA enjeksiyonu ile ardından elektroporasyon bulunmaktadır.
- Manipülasyon sonrası, dilimler kültürlenmiş ve nöron aktivite tepkileri için analiz edilmiştir.
Ana Sonuçlar
- Nöronların yaklaşık %50'si GFP ve RFP'nin eş zamanlı ekspresyonunu göstermiştir, bu da başarılı manipülasyonun bir göstergesidir.
- Klozapin ve oksit tedavileri, RFP-pozitif hücrelerin aktivitesini artırmış, bunun sonucunda c-Fos ekspresyonunda artış olmuştur.
- Bu yöntem, greftlenen internöronların konakçı beyin fonksiyonunu nasıl etkilediği hakkında bilgiler sağlar.
Sonuçlar
- Bu çalışma, internöron progenitörlerini manipüle etmek için etkili bir protokol gösterir ve kortikal plastisitedeki rollerinin daha ileri araştırılmasını sağlar.
- Aktivite ile modülasyon yapılan internöronların mekanizmalarının anlaşılması, nörobilim bilgisini ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Genetic and chemogenetic manipulation of cortical interneuron progenitors enables precise interrogation of neuronal maturation mechanisms, supporting early-stage target validation in neurodevelopmental research. This approach provides predictive confidence for understanding how intrinsic activity and environmental factors influence integration and function of inhibitory circuits. The protocol's ability to dissect gene-environment interactions in a controlled, transplantable system positions it as a valuable tool for de-risking neurobiological targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of interneuron maturation and integration in disease-relevant neural circuits.
- Supports mechanistic de-risking by isolating genetic and environmental contributions to neuronal development.
- Facilitates predictive assessment of target modulation effects on inhibitory network assembly.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for quantitative measurement of neuronal activity and gene expression in engineered progenitors.
- Enables reproducible manipulation and tracking of transplanted cell populations using fluorescent reporters.
- Supports assay standardization for evaluating chemogenetic tool efficacy and specificity in neural tissue.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in situ analysis of activity-dependent protein expression (e.g., c-Fos).
- Offers continuity from discovery to preclinical validation by modeling integration of engineered cells in host brain circuits.
- De-risks advancement decisions by providing quantitative readouts of graft function and host response.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling genetic manipulation, transplantation, and functional analysis of interneuron progenitors in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene-environment interactions in interneuron maturation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for evaluating chemogenetic modulation in neural tissue.
- Analytics: Provides molecular and cellular readouts (e.g., co-expression of fluorescent proteins, c-Fos induction) for comparative analysis.
- Translational Research: Models integration and function of engineered cells in vivo, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing diverse genetic constructs and activity modulators in neural progenitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neuronal development.
- Operational Value: Standardizes manipulation and analysis of neural progenitors for scalable, reproducible studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust, quantitative data on engineered cell integration and function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ex vivo electroporation, transplantation, and chemogenetic manipulation of neural tissue.
- Demands access to specialized instrumentation for tissue sectioning, microinjection, and fluorescence imaging.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different interneuron subtypes or host models.
- Potential limitations include variability in graft integration and chemogenetic tool specificity.
