Name: Murine Kardiyak Perisitlerin İzolasyon ve Safifikasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Öğrenin, fare modellerinden kardiyak perisit izolasyon ve saflaştırma yöntemini. FACS ile hücre saflığı sağlanır ve kardiyovasküler biyoloji araştırmalarına katkı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar florofor panel tasarımı, sorun giderme ve hücre sıralama ile ilgili yardım için Amgen Akış Sitometri Çekirdek teşekkür etmek istiyorum.

Tüm hayvanlar, Laboratuvar Hayvan Bakımı Uluslararası (AAALAC) akredite tesisi Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği'nde barındırılan ve kullanılan ve tüm hayvan çalışmaları uygun veteriner gözetimi altında ve Kurumsal Hayvan altında yapılmıştır Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Amgen A.Ş. protokolünü onayladı.
1. Araç ve Kültür Medyasının Hazırlanması
<ol><li>Otoklav cerrahi 9 cm düz ucu ince nokta makası ve 10 cm açılı tırtıklı forceps.</li>
	<li>500 mL kalsiyum magnezyum içermeyen Dulbecco'nun fosfat-tamponlu salinine (CMF-DPBS) 25 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mL %1 penisilin streptomisin (P/S) ekleyin. Kullanım sırasında soğuk olmasını sağlamak için çözeltiyi bir buz banyosuna yerleştirin. Aliquot 50 mL kalp izolasyonu için 50 mL konik tüp içine. 50 mL aliquot içine 250 adet/mL heparin sodyum çözeltisi ekleyin. Buna heparinize CMF-DPBS olarak anılacaktır.</li>
	<li>500 mL'lik yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye kartal ortamına (DMEM) %20 FBS (100 mL) ve %1 P/S (5 mL) ekleyin. Bu enzimsiz kültür medya olarak anılacaktır. Aliquot 20 mL DMEM + %20 FBS + %1 P/S ve kollajenaz B 500 μg/mL ekleyin. Bu enzim çözeltisi olarak anılacaktır. Hem enzimiçermeyen kültür ortamını hem de enzim çözeltisini 37 °C'de bir kuvözde veya su banyosunda sıcak tutun.</li>
</ol>2. Hayvan Ve Kardiyak Doku Temini Hazırlanması
<ol><li>İntraperitoneally 31 G iğne şırınga ile 250 adet heparin sodyum çözeltisi ile bir fare enjekte. Ardından fare ev kafesinde aktif kalırken 10−15 dk bekleyin. NOT: Bu çalışmada 4 aylık erkek C57BL/6 fareden elde edilen temsili veriler elde edilebildi. Ancak, bu protokol ne olursa olsun gerginlik, yaş, cinsiyet, ağırlık, vb herhangi bir fare üzerinde kullanılabilir.</li>
	<li>% 5 izoflurane ile fare anestezik. Çimdik refleksi ile farenin anestezi derinliğini kontrol edin.</li>
	<li>Anestezili fareyi supine pozisyonunda yerleştirin ve ön ayaklarını bantlayın. Göğüs boşluğunu dikkatlice açın ve 25 G kelebek iğnesi kullanarak alçalan aortu kanüle edin.</li>
	<li>Sağ atriyumda bir çentik yapın ve 2 mL/dk'da en az 20 mL 250 birim/mL heparinize CMF-DPBS ile kalbe değişken akışlı peristaltik pompa saptan. PBS sağ atria temiz çıktığında, perfüzyon tamamlanır.</li>
	<li>Kalbi aorttan kesin ve buz gibi CMF-DPBS'ye yerleştirin.</li>
</ol>3. Kalp Dokusunun Dissociasyonu
<ol><li>Kalbi 15 cm x 15 cm Petri kabına aktarın. Kalbi, yay makası ve ince nokta forsepslerini kullanarak parçaları (10−15 mL) kaplayacak kadar enzim çözeltisi kullanarak küçük parçalara (1 mm/adet) kesin.</li>
	<li>Parçaları ve çözeltiyi 50 mL konik bir tüpe aktarın, parafin plastik filmle mühürleyin ve 37 °C'de 120 rpm'de 75 dakika boyunca bir orbital shaker'da kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Enzim çözeltisi ile kollajenaz sindirim sonra, yeni bir 50 mL tüp içine 100 μm hücresüz ile sıvı decant ama parçaları kurumasını sağlamak için yeterli çözüm bırakın.</li>
	<li>İnce nokta forceps kullanarak, tüp ten doku çıkarmak ve bir mikroskop slayt üzerine birkaç parça yerleştirin. Sonra iki mikroskop slaytlar arasında doku kırmak için doku eziyet. Yeni bir 50 mL konik tüp içine enzimsiz kültür medya ile slaytlar durulayın.</li>
	<li>Tüm doku parçaları ayrıştırılıncaya kadar adım 3.4 tekrarlayın.</li>
	<li>3.3−3.5 adımlarından gelen çözümleri tek bir tüpte birleştirin. Ortaya çıkan süspansiyonu 100 m hücreli süzgeçten yeni bir 50 mL konik tüpe zorlayın.</li>
	<li>Santrifüj 220 x g, 4 °C, 5 dk. Önceki çözelti kapalı aspire ve taze enzimiçermeyen kültür medya hücre pelet yavaşça askıya.</li>
	<li>Hücreleri sayın ve hücre sayacı kullanarak canlılığı kontrol edin. 500 mL DPBS ve 10−25 mL 2−5% büyükbaş hayvan serum albumini (BSA) içeren soğuk FACS boyama tamponu ile hücreleri 1 x 10 6/mL'ye seyreltin. Hücreler lekelenmeye ve sıraya girmeye hazırdır.</li>
</ol>4. Facs kullanarak Ham Hücre Karışımından Perisitar
<ol><li>Tüm kontroller ve hücre örnekleri için 5 mL FACS tüpleri hazırlayın ve etiketleyin. Lekesiz bir örnek için hücreleri (tüp başına 1 mL) aliquot, floresan eksi bir (FMO) kontrolleri ve isotip uyumlu kontroller için. Sıralama için kalan hücreleri kullanın. Tüm kontroller ve numuneler aynı anda hazırlanabilir ve elde edilebilir. Not:0,5 x 10'da toplam 13 mL6hücreleri/mL'si tek kalpten temsili sıralama için kullanılmıştır. Ancak, hacim araştırmacı onların izolasyon elde kaç hücre bağlıdır, kaç kalp kullanmak, ve ne kadar iyi kalp dokusu sindirilir; her kalbin boyutu da hacmi ni değiştirebilecek bir değişkendir.<ol><li>Floresan telafikontrollerini optimize etmek için tazminat boncukları (Malzeme Tablosu) kullanın. 5 mL FACS etiketli bir tüpte deneydeki her florokrom için bir telafi kontrolü hazırlayın. Bu deney için toplam 9 telafi kontrolü hazırlayın — 2 çeşit lekesiz boncuk artı NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 ve hücre canlılığı-APC-Cy7 dahil olmak üzere işaret panelinden 7 farklı florokrom ( Malzeme Tablosu).<ol>
<li>Sıkma şişesinden her tüpe bir damla tazminat boncukları (~ 50°L) ekleyin. Daha sonra boncuklara 1 μL antikor ekleyin. Marker panelinden her antikor için tekrarlayın. Darbe girdapları ile şiddetle karıştırın. Oda sıcaklığında ışıktan korunan hücre canlılığı boncukları dışında 4 °C'de 30 dakika boyunca ışıktan korunur.</li>
			<li>Daha sonra, her tüpe 3 mL FACS boyama tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dk için 300 x g'de santrifüj ekleyin. Çözeltiyi aspire edin ve her boncuk peletini 400 μL FACS boyama tamponunda yeniden askıya alın. Telafi denetimleri kullanıma hazırdır. Buzda kal.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Spektral çakışma nedeniyle arka plan boyama optimize etmek için FMO kontrolleri kullanın.<ol>
<li>5 mL FACS tüpünde bölüm 4.1'den alınan 1 mL hücre yi kullanarak ve 1:100 seyreltmede adım 4.1.1'de tanımlanan marker panelinden tüm antikorları ekleyerek ancak bir antikor hariç olmak üzere FMO kontrollerini hazırlayın. Örneğin, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, hücre canlılığı boya sıcabilir boya değil, NG2-AF488 antikor için antikorlar ekleyerek bir NG2-AF488 FMO hazırlayın. Darbe girdap tarafından yavaşça karıştırın. Her antikor için toplam 7 kontrol için tekrarlayın. 4 °C'de 30 dk boyunca ışıktan korunan kuluçka.</li>
			<li>Daha sonra, her tüpe 3 mL FACS boyama tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dk için 300 x g'de santrifüj ekleyin. Çözeltiyi aspire edin ve her hücre peletini 400 μL FACS boyama tamponunda yeniden askıya alın. FMO kontrolleri kullanıma hazırdır. Buzda kal.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nonspesifik boyama için isotipuyumlu kontrol antikorları (Malzeme Tablosu) kullanın.<ol>
<li>Her biri 5 mL FACS tüpte 1:100 seyreltme de bölüm 4.1'den hazırlanan hücre örneğinin 1 mL'sine isotip uyumlu kontrol antikoru (MalzemeTablosu)ekleyerek isotip kontrolleri hazırlayın. Darbe girdap tarafından yavaşça karıştırın. 4 °C'de 30 dk boyunca ışıktan korunan kuluçka.</li>
			<li>Daha sonra, her tüpe 3 mL FACS boyama tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dk için 300 x g'de santrifüj ekleyin. Çözeltiyi aspire edin ve her hücre peletini 400 μL FACS boyama tamponunda yeniden askıya alın. Isotip denetimleri kullanıma hazırdır. Buzda kal.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Taze izole hücrelere antikor kokteylekleyerek sıralanacak hücreleri hazırlayın.<ol>
<li>Bölüm 4.1'den hücre örneğini fare karşıtı NG2-AF488, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7'yi 1:100 seyreltme de ve hücre canlılığını 1:100 000 seyreltme de içeren bir antikor kokteyline ekleyerek hazırlayın. Yavaşça girdap karıştırmak için. Işıktan korunan 30 dk için 4 °C'de kuluçka numuneleri.</li>
			<li>Boyama dan sonra, 5 dk 4 °C için 300 x g santrifüj ile FACS boyama tampon ile hücreleri yıkayın. Çözeltiyi aspire edin ve FACS boyama tamponundaki hücre peletini 0,5 x 106 hücre/mL'ye yeniden askıya alın.</li>
			<li>35 μm filtre üstleri, pipet lekeli hücre örnekleri kapakları ve yerçekimi filtrasyon üzerine tek hücresüspansiyonlar elde etmek için yeni FACS tüpleri kullanarak. Buzda kal.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreleri arındırmak için bir hücre ayırıcısı kullanın.
	<ol>
<li>Gerilimleri ayarlamak ve arka plan sinyalini düzeltmek için hücre ayırıcısındaki lekesiz hücreleri çalıştırın (örneğin, ileri dağılım için 490−560 ve yan dağılım için 180−250' ye ayarlayın).</li>
		<li>Her kanal için voltajları ayarlamak ve pozitif sinyal için kapıları ayarlamak için her tek renkli kompanzasyon boncuk örneğini teker teker çalıştırın. Veri toplayın. Kompanse matrisini hesaplayarak spektral çakışmayı hesaplamak için yazılımı kullanın. Tüm voltajlar hazır ve ayarlanmış.</li>
		<li>Her izotip denetimini birer birer çalıştırın ve varsa belirli olmayan bağlama için kapıları ayarlamak için bu veriler kullanılabilir.</li>
		<li>Her FMO örneğini birer birer çalıştırın ve çok renkli bir panel sayesinde spektral kanamayı düzeltmek için her kanalın voltajlarını ayarlayın.</li>
		<li>Lekeli hücre örneklerini hücre ayırıcısında çalıştırın ve 15 mL konik toplama tüpünde 10 mL enzimsiz kültür medyasında (DMEM + %20 FBS + %1 P/S) hücre toplayın. Aşağıdaki gating stratejisini kullanın: tek hücreler için kapı, canlı hücreler için kapı, CD45 negatif hücreler için kapı, CD34 ve CD31 negatif hücreler için kapı, NG2 pozitif hücreler için kapı ve son olarak CD146 ve CD140b pozitif hücreler için kapı.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Perisit lerin Culturing
<ol><li>5 dk için %0,2 jelatin içeren 24 kuyulu bir plakayı kaplayın ve jelatin çözeltisini aspire edin. Tohum taze elde edilen hücreler 4.2.5 adım dmem + 20% FBS + 1% P / S kadar 2 x 104 hücreleri /cm2. Bir hücre kuluçka makinesindeki kültür hücreleri 37 °C, %5 CO2 ve %95 O2olarak ayarlanır.</li>
	<li>Perisitlerin geçişi</li>
	<li>Hücreler %95 konakıcı olduktan sonra hücreleri sıcak 1x DPBS ile yıkayın ve 3−5 dk oda sıcaklığında her kuyuda 200 μL 0,1 tripsin ile hücreleri kaldırın.</li>
	<li>Hücreleri gevşetmek için tabağa hafifçe dokunun.</li>
	<li>Tripsini 3,5 x kültür ortamı miktarı (700 μL DMEM + %20 FBS + %1 P/S) ve tohum geçişi iki (P2) hücreyi 2 x 104 hücre/cm 2'ye kadar kaplamasız 6 kuyulu bir tabağa yerleştirin.</li>
	<li>Her kuyu, ne zaman confluent, sonra 1:6 oranında bölünebilir P3 hücreleri olarak tek bir T-75 şişesine taşınabilir.</li>
</ol>6. Perisitlerin Karakterizasyonu
<ol><li>
Akış sitometri analizi
	<ol>
<li>Bölüm 4'te daha önce açıklandığı gibi aynı FACS boyama protokolünü ve gating stratejisini kullanın.</li>
		<li>Akış sitometresi üzerinde kontrolleri ve lekeli örnekleri çalıştırın. Analiz yazılımını kullanarak veri toplamakve verileri analiz etmek (Malzeme Tablosu).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Parlak alan görüntülerini toplamak için, 37 °C, %5 CO2 ve %95 O2olarak belirlenen bir hücre kuluçka makinesindeki bir şişedeki hücreleri büyütün. Hücreler yüzeye bağlandıktan sonra görüntüleri mikroskopta yakalayın.</li>
	<li>
İmmünositokimya
	<ol>
<li>Hücreleri %90'a kadar 96 kuyuluk bir tabakta büyütün. Hücreleri sıcak 1x DPBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile düzeltin.</li>
		<li>Hücreleri 1x DPBS ile 3x yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0,1 deterjanla permeabilize edin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 1 saat boyunca tampon engelleme ile inkübül hücreleri. Bloke sonra, birincil antikorlar ekleyin (kuyu başına bir antikor) 1:100 tampon engelleme ve 4 ° C gecede kuluçka seyreltilmiş. Primer antikorlar şunlardır: anti-NG2, anti-CD140b, anti-CD31, anti-vimentin, anti-desmin, ve anti-alfa düz kas aktin.</li>
		<li>Ertesi gün, yıkama tampon (TabloMalzemeler)ile hücreleri 3x yıkayın. İkincil antikor 1:1.000 bloke tampon ve karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat kuluçka seyreltilmiş ekleyin. İkincil antikor FITC'ye konjuge bir anti-tavşandır.</li>
		<li>Yıkama tampon ile hücreleri 3x yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika için 1:1.000 seyreltilmiş 300 μM nükleer leke ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri 1x DPBS ile 3 x yıkayın ve montaj lı ortamla monte edin.</li>
		<li>Konfokal mikroskoplu görüntü hücreleri.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2Fpericyte+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li>
<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Sengillo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+mural+vascular+cells+coincides+with+blood-brain+barrier+disruption+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Deficiency in mural vascular cells coincides with blood-brain barrier disruption in Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 23 (3), 303-310 (2013).</li>
<li>Avolio, E., Madeddu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+cardiac+pericyte+biology%3A+From+physiopathological+mechanisms+to+potential+therapeutic+applications+in+ischemic+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Discovering cardiac pericyte biology: From physiopathological mechanisms to potential therapeutic applications in ischemic heart disease.</a> Vascular Pharmacology. 86, 53-63 (2016).</li>
<li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cerebral+microvascular+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cerebral microvascular pericytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 89, 375-382 (2003).</li>
<li>Bryan, B. A., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+isolation+and+use+in+endothelial%2Fpericyte+coculture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Pericyte isolation and use in endothelial/pericyte coculture models.</a> Methods in Enzymology. 443, 315-331 (2008).</li>
<li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+outgrowth%2C+propagation+and+characterization+of+human+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Explant outgrowth, propagation and characterization of human pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li>
<li>Crisan, M., Corselli, M., Chen, W. C., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perivascular cells for regenerative medicine.</a> Journal of Cellular Molecular Medicine. 16 (12), 2851-2860 (2012).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+long-term+culture+of+multipotent+progenitor+cells+affiliated+with+the+walls+of+human+blood+vessels%3A+myoendothelial+cells+and+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes.</a> Methods in Cellular Biology. 86, 295-309 (2008).</li>
<li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+bulk+cultivation%2C+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes%3A+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li>
<li>Avolio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+characterization+of+neonatal+cardiac+pericytes+provides+a+novel+cellular+option+for+tissue+engineering+in+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Expansion and characterization of neonatal cardiac pericytes provides a novel cellular option for tissue engineering in congenital heart disease.</a> Journal of the American Heart Association. 4 (6), e002043(2015).</li>
<li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myocardial+pericytes%3A+multipotent+mesodermal+precursors+exhibiting+cardiac+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity.</a> Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).</li>
<li>Baily, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Perivascular+Multipotent+Precursor+Cell+Populations+from+Human+Cardiac+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54252(2016).</li>
<li>Murray, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+and+cardiac+muscle+pericytes%3A+Functions+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Skeletal and cardiac muscle pericytes: Functions and therapeutic potential.</a> Pharmacology & Therapeutics. 171, 65-74 (2017).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Development%22%5BJournal%5D)">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Development. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Kardiyak perisitler üzerinde yapılan çalışmalar nispeten yeni olduğundan, perisitlerin kardiyovasküler fizyoloji ve patofizyolojideki rolü henüz tanımlanmamıştır. Diğer organlarda, onlar damar homeostaz ve perfüzyon önemli rol oynadığı gösterilmiştir1,2. Beyin gibi diğer organlardan perisit lerin literatürü ile karşılaştırıldığında, kardiyak perisitler üzerinde önemli ölçüde daha az yayın vardır. Kardiyak perisitlerin izolasyonu fonksiyonel özelliklerinin ve sinyal mekanizmalarının anlaşılması açısından çok önemlidir. Bu nedenle, bu protokol araştırmacılara kardiyak perisitlere daha kolay ulaşılabilen bir doku kaynağından erişmeleri ve biyolojileri üzerine çalışmaları desteklemeleri için daha kolay bir yol sağlayacaktır. Kardiyak perisitlerin kardiyak homeostaz ve patofizyolojiye nasıl katkıda bulunduklarına ilişkin soruların yanıtlatınyanı, terapötik potansiyellerinin araştırılmasına yardımcı olacaktır.
Murine kalpten izole edilen ve CD31-CD34-CD45-CD140b + NG2+CD146+ ile karakterize perisit popülasyonu birden çok kez (P12'ye kadar ve hala güçlü gidiyordu) geçilmiştir, ki bu da canlılık azalması ve hızlı bir şekilde yayılır (Ek Şekil 2). Hücreler de kriyodondurulmuş ve en az% 95 canlılık ile kurtarıldı edilmiştir. Ancak, deneylerimiz için P7 veya daha genç hücreleri kullanmayı tercih ediyoruz. Perisitlerimizin parlak alan görüntülerini insan beyni perisitleriyle karşılaştıran iki hücre çizgisi, düz kas hücrelerinden morfolojide farklılık gösterirken, benzer hücre morfolojisi (Şekil4A)sahiptir (Şekil 4A). P7 hücrelerimiz perisit belirteçleri için immünosit kimyası ile, bazıları FACS panelimizden (NG2 ve CD140b) ve panelde olmayan birkaç ı (vimentin, desmin, αSMA) ile karakterize edildi ve hücrelerin perisit belirteçlerini homojen olarak ifade ettiğini bulduk (Şekil4B). Ayrıca, P7 hücrelerimiz yine aynı marker paneli ile akış sitometrisi ile analiz edilerek, geçiş nedeniyle marker ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirmek için herhangi bir değişiklik olmadığını tespit ettik (Şekil4C). Bu nedenle, hem fenotipik hem de morfolojik olarak hücrelerimiz perisittir.
Nees ve ark.10, Avolio ve ark.11, Chen ve ark.12ve Baily ve ark.13 tarafından yapılan çalışmalar da başarılı kardiyak perisit izolasyonları göstermiştir. Ancak, Nees ve ark.10 tarafından mikrogemilerden perisitayırmak için bir şirket içinde özel inşa ekipman kullanımı onlar gibi çoğaltmak zordu bir örgü ağ yığını ile ileri geri proteaz çözeltisi perfüzyon pompaları ile iki oda dahil aparatın şematik ve/veya resmini ve nasıl inşa edildiğini sağlamadı. Nees ve ark.10 birçok türden başarılı bir şekilde izole edilmiş kardiyak perisitler olmasına rağmen, onların yöntemini asla üretemedik. Protokolümüzdeki perisit kopma adımımız, tüm laboratuvarlarda olmasa bile, tüm laboratuvarlarda bulunan bir orbital shaker (tüm hücreleri ayırmak için) kullanır ve konik bir tüpteki doku ve enzim çözeltisi ve ardından mekanik bir ayrışma adımı kullanır. Özel bir aparat gerekmez. İkinci olarak, kalan protokoller insan dokularının kullanımını içerir ve böylece insan dokusunun temini müfettişler için sınırlayıcıdır. Protokolümüz, fare modelleri (vahşi tip, genetiği değiştirilmiş, hastalıklı) ve tüm araştırmacıların kullanımına hazır malzemeler kullanılarak mevcut protokollerin9,12'de değiştirilmesi ve optimizasyonudur.
Genel olarak perivasküler hücreler hassas olduğundan, hücrelerin canlılığı iyi bir verim elde etmek için önemlidir. Kardiyak dokunun temini ve hücrelerin boyanması sırasında, doku/hücrelerin buz soğuk tutulması gerekir. İkincisi, doku enzimatik sindirim bireysel olarak optimizasyon gerektirebilir. Enzimlerin kişinin şişeleri üzerinde aktivite birimlerine bağlı olarak, konsantrasyon ve sindirim süresi optimize edilmesi gerekebilir. Enzimatik çözeltinin her seferinde taze olarak hazırlandıklısa, aksi takdirde verim azalır. Üçüncü olarak, ham karışım hücrelerin bir sürü içerir, bazı ölü ve / veya ölüyor, bu boyama tampon% 5'ten% 2 FBS konsantrasyonu düşürmek için en iyisidir. Sıralama sırasında meme tıkanan hücreler ile sorun yaşıyorsanız, ölü bir hücre kaldırma kiti kullanarak ilk hücreleri zenginleştirin. Hücre kümelenmesini önlemek için hücre öncesi sıralamaya EDTA/HEPES tamponu veya DNase tedavisi de ekleyebilirsiniz. Son olarak, antikor lar bizim panel oldukça büyük ve birçok floroforkullanır, fmo kontrolleri ve kompanzasyon kontrolleri doğru yapılır emin olun.
Bu yöntemin bir sınırlama kalp başına elde edilebilir kardiyak perisit miktarıdır. Bizim durumumuzda, bir fare kalp bizim ham karışımı sadece% 1.1 insan kalp izolasyonları yüzde karşılaştırılabilir perisitler vardı, ama hücre sayısı önemli ölçüde daha az kalp dokusu miktarı nedeniyle bir fare sağlar. Facs'tan sonra başlangıç hücre sayısı çok düşük olduğundan, aynı anda birden fazla kalpten izole etmek daha iyi olacaktır. Ancak, bununla ilgili sorun, bir gün içinde sıralamanız gereken hücrelerin sayısıdır. Eğer 30 milyondan fazla hücre varsa, hücrelerin canlılığını etkilemeden sıralama yoluyla almak zor olacaktır. Eğer araştırmacının birden fazla hücre ayırıcısı olsaydı, bir günde birden fazla kalpten izole etmek mümkün olurdu. Başka bir sınırlama biz iskelet kası 15 gibi kalpte perisit alt popülasyonları olupolmadığını bilmiyorum çünkü, biz bizim gating stratejisinde bir alt tip ortadan kaldırarak olup olmadığını bilmiyorum. Kardiyak perisitlerimizi karakterize etme sürecindeyiz ve şimdiye kadar yayınlanmamış verilerimizde, bunlar işlevsel olarak literatürdeki diğer perisitler gibidir.
Protokolümüz, araştırmacıların kardiyak perisit özellikleri, özellikleri, işlevselliği ve kardiyak homeostaz ve hemodinamik katkılarının tanımlanmasına yardımcı olacak diğer yönleri hakkındaki soruları yanıtlamalarını sağlayacaktır. Bu hücreler, biyolojileri daha iyi anlaşıldıktan sonra kardiyovasküler hastalıklara karşı terapötik potansiyele sahip olabilirler.

Perisit olarak bilinen perivasküler hücreler vasküler ağacın mikrodamarlarını ve kılcal damarlarını çevreler1,2. Fizyolojik olarak, onlar teşvik etmek ve anjiyogenez bir rol oynamak için bilinen, endotel hücreleri ile yakın ilişki nedeniyle bariyer bütünlüğünü artırmak yanı sıra stabilize ve olgun damarlar1,2. Ayrıca, disfonksiyon ve / veya bu hücrelerin kaybı Alzheimer hastalığı 2 gibi hastalıklarda karıştığı olmuştur2,3 ve çeşitli kardiyovasküler hastalıklar4. Bu hücreler tüm vücutta bulunur, ancak hücre numaraları dokuya bağlıdır. Perisitler en önemlisi kan-beyin bariyerinin yüksek vaskülarizasyon nedeniyle beyinde çalışılmıştır1,2. Ancak, kalpte perisitlerin biyolojisi incelenmiştir.
Son zamanlarda, kardiyak perisitler için alanında artan ilgi vardır, ama şu anda biyolojien çok kullanılan araçlardan biri onların izolasyon için kullanılabilir aerodinamik protokol yoktur - fare. Beyinden perisitlerin izole ile ilgili literatürde protokoller vardır5, retina6, plasenta7, ve iskelet kası8,9; ancak, birkaç protokolleri kalpten perisit izole vardır. Kardiyak perisitleri izole eden çeşitli gruplar vardır. Nees ve ark. fare de dahil olmak üzere birden fazla tür kardiyak perisit bol miktarda izole başardık; ancak, kendi yöntemleri tekrarlanabilirlik10azaltır house dahili ekipman kullanılır. Avolio ve ark.11, Chen ve ark.12, ve Baily ve ark.13 de başarıyla insan kalp dokusundan kardiyak perisit izole, ama insan dokuları her zaman mevcut değildir ve bazı araştırmacılar için elde etmek zor. Burada, araştırmacıların biyolojilerini hazır malzemelerle daha fazla incelemeleri için fare modellerinden kardiyak perisit elde etmek için bir izolasyon yöntemi geliştirdik.
Bilinen anahtar perisit belirteçleri14ile enzimatik sindirim ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanarak, protokolümüz bize izole ve CD31 ile karakterize perisitlerin bir popülasyon arındırmak için izin verir-CD34-CD45- CD140b+NG2+CD146+ . İşaretleyiciler panelimiz hem dahil etme hem de dışlama işaretleri içerir. CD45 hematopoetik hücreleri dışlamak için bir belirteç olarak kullanılır. CD31 endotel hücrelerini dışlamak için bir belirteç olarak kullanılır. CD34 hem hematopoetik hem de endotel dölhücrelerini dışlamak için bir belirteç olarak kullanılır. CD146 perivasküler hücreler için bir belirteçtir. Son olarak, NG2 ve CD140b (ayrıca trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü beta olarak da bilinir— PDGFRβ) perisitler için kabul edilen belirteçleri 14 . Elde edilen birincil kültür, morfoloji veya marker ekspresyonunda değişiklik olmadan birden çok kez kültürlenebilir ve geçilebilir. Ayrıca, bu hücreler, etkileşimlerini incelemek ve birbirleriyle çapraz konuşmak için endotel hücreleri ile birlikte kültürlenebilir. Bu hücre izolasyon yöntemi araştırmacılar ın yabani tip, hastalık ve genetik varyant fare modellerinden kardiyak perisitlerin biyolojive patofizyolojisini incelemelerine olanak sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 Tripsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-Cl</td>,<td>% 0.1 100 & elde etmek için 1x DPBS ile seyreltin</td></tr><tr><td>; M Hücreli süzgeç</td><td>FisherSci</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon konik tüpler</td><td>BD</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>25 G kelebek iğne</td><td>FisherSci</td><td>22-253-146</td><td></td></tr><tr><td>31 G iğneli şırınga</td><td>FisherSci</td><td>B328446</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon konik tüpler</td><td>BD</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>anti-alfa düz kas aktin tavşan mAb</td><td>abcam</td><td>ab32575</td><td>ICC'de kullanılan antikor 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>anti-CD140b tavşan mAb</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>28E1</td><td>ICC'de kullanılan antikor 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>anti-CD31 tavşan pAb</td><td>abcam</td><td>ab28364</td><td>ICC'de kullanılan antikor 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>anti-desmin tavşan pAb</td><td>abcam</td><td>ab8592</td><td>ICC'de kullanılan antikor 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>anti-NG2, AF488'e konjuge edilmiş</td><td>Millipore</td><td>MAB5384A4</td><td>ICC'de kullanılan antikor, 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>anti-vimentin tavşan mAb</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>ICC'de kullanılan antikor, 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>ArC Amin Reaktif Kompanzasyon boncuk kiti</td>, <td>Invitrogen</td><td>A10346</td><td>kompanzasyon boncukları, Canlı / Ölü Yakın IR boya</td></tr><tr><td>Brightfield için Mikroskop</td><td></td><td></td><td>kamerasına bağlı</td></tr><tr><td>CD140b-PE (klon APB5)</td> <td>eBioscience</td><td>12-1402-81</td><td>FACS 1:100 seyreltmede kullanılan antikor</td></tr><tr><td>CD146-BV605 (klon ME-9F1)</td> <td>BD</td><td>740434</td><td>FACS 1:100 seyreltmede kullanılan antikor</td></tr><tr><td>CD31-APC (klon MEC 13.3)</td> <td>BD</td><td>551262</td><td>FACS 1:100 seyreltmede kullanılan antikor</td></tr><tr><td>CD34-BV421 (klon RAM 34)</td> <td>BD</td><td>56268</td><td>FACS'ta kullanılan antikor: 1:100 dilüsyon</td></tr><tr><td>CD45-PE-Cy7 (klon 30-F11)</td><td>BD</td><td>552848</td><td>FASS'ta kullanılan antikor: 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>Santrifüjü</td>, <td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Kollajenaz B</td><td>,</td><td>Roche</td><td>11088815001 0.226 U/mg lyo.</td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>4.5 g/L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat içeren nükleer leke DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Dowell makas</td><td>FST</td><td>15040-11</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Ca ve Mg İçermeyen Fosfat Tamponlu Salin (CMF-DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Dumont #5 İnce Forseps</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria hücre sıralayıcı</td><td>BD</td><td></td><td>Lazerler: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW</td></tr><tr><td>FACSAria yazılımı</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüp yuvarlak tabanlı polipropilen, 5 mL</td><td>BD</td><td>38057</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeç kapaklı şahin tüpü, 5 mL</td><td>BD</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>İnce makas</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo yazılımı</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fortessa LSR akış sitometresi</td><td>BD</td><td></td><td>Lazerler: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW</td></tr><tr><td>Jelatin bazlı kaplama</td><td>Cell Biologics</td><td>6950</td><td></td></tr><tr><td>Keçi tavşan karşıtı IgG (H+L) Çapraz Emilen İkincil antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>ICC'de kullanılan antikor 1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Graefe Forseps</td><td>FST</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodyum çözeltisi</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2720-02</td><td>10.000 USP birimi / 10 mL; domuz bağırsaklarından</td></tr><tr><td>Kuluçka makinesi</td><td></td><td></td><td>37 & derece olarak ayarlayın; C, %5 CO2, %95 O2&nbsp;</td></tr><tr><td>Live/Dead-Near IR</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>FisherSci</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>NG2-FITC</td><td>Millipore</td><td>AB5320A4</td><td>FACS'ta kullanılan antikor 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>Oribital çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td></td><td>Inside 37 &deg; C inkübatörü veya oda</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>FisherSci</td><td>50-980-487</td>% 4 Penisilin-Streptomisin Corning 30-002-CI <td>& nbsp elde etmek için 1x DPBS ile seyreltin</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>;<td></td></tr><tr><td> Petri kabı</td><td>FisherSci</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Pipet ve uçlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond</td><td>ThermoFisher</td><td>P36965</td><td>montaj ortamı</td></tr><tr><td>Propidum İyodür</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>hücre canlılığı boyası ek şekil 2</td></tr><tr><td>için Tavşan IgG FITC</td><td>eBiosciences</td><td>11-4614-80</td><td>İzotip kontrol antikoru - FITC</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a APC</td><td>Biolegend</td><td>400512</td><td>İzotip kontrol antikoru - APC</td></tr><tr><td>Rat IgG2a BV421</td><td>Biolegend</td><td>400536</td><td>İzotip kontrol antikoru - BV421</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a BV605</td><td>BD</td><td>563144</td><td>İzotip kontrol antikoru - BV605</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a PE</td><td>Biolegend</td><td>400308</td><td>İzotip kontrol antikoru - PE</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2b PE-CY7</td><td>Biyoefsane</td><td>400617</td><td>İzotip kontrolü antikor - PE-Cy7</td></tr><tr><td>SuperBlock</td><td>ThermoFisher</td><td>37515</td><td>engelleme tamponu</td></tr><tr><td>T75</td><td>ThermoFisher</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>deterjan, %0.1 UltraComp boncukları elde etmek için x DPBS ile seyreltin</td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>01-2222-42</td><td>kompanzasyon boncukları</td></tr><tr><td>Değişken Akışlı Peristaltik Pompa</td><td>FisherSci</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>ViCell Hücre sayacı</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yıkama tamponu</td><td></td><td></td><td>1x DPBS'de Superblock'un 1:10 seyreltilmesi</td></tr></tbody></table>

murine kardiyak perisitlerin İzolasyon ve safifikasyonu

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Perisitlerin, mikrodamarların ve kılcal damarların perivasküler hücreleri, anjiyogenez, damar stabilizasyonu ve endotel bariyer bütünlüğünde rol oynadığı bilinmektedir. Ancak, kalpte dokuya özgü işlevleri iyi anlaşılamamıştır. Ayrıca, kardiyak kökenli perisitleri izole etmek ve arındırmak için kolayca erişilebilen malzemeler kullanan bir protokol de bulunmamaktadır. Protokolümüz, yaygın olarak kullanılan memeli modeli fareyi hücre kaynağımız olarak kullanmaya odaklanıyor. Enzimatik sindirim ve kalp dokusunun mekanik dissociation kullanarak, daha fazla floresan aktive hücre sıralama (FACS) işaretleri bir bolluk tarafından saflaştırılmış bir ham hücre karışımı elde etti. Perisitler için tek bir kesin belirteç olmadığından, CD31 - CD34- CD45-CD140b+NG2+CD146+olan hücreler için kapılı . Arınmayı takiben, bu birincil hücreler morfoloji ve marker ekspresyonunda herhangi bir değişiklik olmaksızın birden fazla kez kültürlendi ve geçirildi. Protokolümüzü kullanarak primer minrosi kardiyak perisitleri düzenli olarak elde edebilme yeteneğiile, perisitlerin kardiyovasküler fizyolojideki rolünü ve tedavi potansiyelini daha iyi anlamayı umuyoruz.

Enzimatik sindirim ve tüm kalbin dissociation sonra ve hücrelerin FACS saflaştırma önce, hücreler kalpten birçok farklı hücre türleri içeren bir ham karışımdır (Şekil1A). FACS arınma ve kültürlenme den sonra hücreler homojendir. Onlar tek çekirdekli, oldukça düz, ve tipik perisit rhomboid morfolojisi var (Şekil 1B).
FACS kullanılarak hücreler homojenolarak saflaştırılır. Lekesiz kontrol hücresi örneği gating stratejisini göstermek için kullanılır (Şekil2). İlk olarak, enkaz ve doublets ileri ve yan dağılım dağılımları dayalı dışarı kapılı edildi. Daha sonra ölü hücreler, canlı hücrelerden daha büyük ve daha yoğun bir sinyal üreten boya ile amin reaksiyonu nedeniyle dışarı kapılandı. Canlı hücrelerden hematopoetik hücreler CD45+olarak çıkarıldı. Hematopoetik ve endotel hücrelerini daha da uzaklaştırmak için CD34+ ve CD31+ hücreler çıkarıldı. Son olarak, TIPIK perisit belirteçlerinin ekspresyonu ile perivasküler hücreler olduğu için NG2+ ve CD140b+/CD146+ hücreler seçilmiştir (Şekil 3). Marker paneli ayrıca fare koroner endotel hücrelerinde kontrol olarak test edildi (Ek Şekil 1). Ham hücre karışımının sadece %1'i sıralamadan sonra perisitlerden oluşuyordu.
Hücrelerin gerçekten perisit olduğunu doğrulamak için, daha fazla karakterizasyon için hücreleri geçitli. T-75 şişelerinde P3'e ulaştıklarında hücreler yaşlandıkça canlılıkta değişiklik olmadan hızla büyümüştir (EkŞekil 2). İnsan beyin perisitleri ile karşılaştırıldığında, hücreler benzer bir morfolojiye sahipti (Şekil4A). Fare ve insan düz kas hücreleri ile karşılaştırıldığında, hücrelerin farklı bir morfolojisi vardı (Şekil4A). Ayrıca P7'de immünosülyalı veya geçiş sonrası akış sitometri analizi nde morfoloji veya marker ekspresyonunda gözlenen bir değişiklik yoktu (Şekil 4B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig1.jpg"> Şekil 1 : Ham hücreler saflaştırılmış hücrelere karşı. (A) Ham hücre karışımının brightfield görüntüsü 14 gündür bir T25 şişesinde kültürlenmiş olan tüm kalp enzimatik sindirim ve dissosilasyon sonrası. (B) 14 gün sonra homojen bir kardiyak perisit popülasyonunun 14 gün sonra ayrıştırma ve kültürleme sonrası parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig2v2.jpg"> Şekil 2 : Lekesiz hücrelerin FACS analizinin temsili görüntüleri. Ham hücre karışımını arındırmak için kullanılan gating stratejisinin şematik gösterimi. Kapı tek hücreler için, canlı, CD45-, CD31-, CD34-, NG2+, CD146+, ve CD140b+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig3.jpg"> Şekil 3 : Ham hücrelerin FACS analizinin temsili görüntüleri. Kardiyak perisithomojen bir popülasyon elde etmek için kullanılan sıralama şematik gösterimi. Ham hücrelerin kabaca% 1 CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig4.jpg"> Şekil 4 : Primer izole kardiyak perisitlerin karakterizasyonu (A) Insan beyni (hPC) ve fare kalplerinden (mPC) kültürlü hücrelerin Brightfield görüntüleri benzer perisit hücre morfolojisi ama insan düz kas hücrelerinden farklı morfoloji hSMC) ve fare düz kas hücreleri (mSMC) göstermektedir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) P7'deki hücrelerin perisit belirteçleri için immünositokimya ile phenotipik karakterizasyonu. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) Negatif belirteçler CD31, CD34, CD45 ve pozitif belirteçler NG2, CD140b ve CD146 için geçitli oldukları P7'deki perisitlerin akış sitometrisi ile analiz. Nüfus homojen kalır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Marker paneli kullanılarak endotel hücrelerinin akış sitometri analizinin temsili görüntüleri. Bir fare koroner endotel hücre hattı belirteçleri için bağlayıcı özgüllük için kontrol olarak kullanılmıştır. Negatif bir kapı yerine CD31 için pozitif bir kapı dışında sıralamada kullanılan aynı gating stratejisini kullanarak, endotel hücreleri CD45, CD34, NG2, CD140b ve CD146 için negatifti, ancak beklendiği gibi CD31 için pozitifti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/JOVE_Suppl_Figure_1.tif" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 2: MPC'nin farklı pasajlarının akış sitometri analizinin temsili görüntüleri. Primer izole kardiyak perisitler kültürlendi ve 12. Hücreler propidium iyodür ile boyandı ve bir akış sitometre üzerinde analiz edildi. Kontrol popülasyonu ölü hücreler ve canlı hücrelerin karışımıdır. Pasajlar arasında canlı hücre sayısında anlamlı bir fark yoktu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/JOVE_Suppl_Figure_2.tif" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Temel araştırma ve biyoloji ve tedavi potansiyelini araştırmak için murine kardiyak perisitleri izole etmek ve arındırmak için bir protokol optimize ettik.

Murine Kardiyak Perisitlerin İzolasyon ve Safifikasyonu

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Protokolümüz fare modeli için optimize edilmiştir ve tüm araştırmacıların kullanımına hazır materyallerkullanmaktadır. Bu teknik sağlıklı, hastalıklı veya genetik olarak değiştirilmiş fare modellerine uygulanabilir. Protokolümüz, araştırmacıların herhangi bir fare hastalığı veya genetik varyasyon modelinden kardiyak perisit biyolojisi ile ilgili soruları yanıtlamalarını sağlayacaktır.Bu prosedür kardiyak perisit biyolojisi hakkında bilgi sağlayacak ve hem sağlık hem de hastalıkta kardiyak homeostaz ve hemodinamik katkılarının anlaşılmasına yardımcı olacaktır. Anestezili fareyi supine pozisyonuna yerleştirin ve ön ayaklarını bantlayın. Göğüs boşluğunu dikkatlice açın ve 25 kalibrelik kelebek iğnesi kullanarak alçalan aortu kanüle edin.Sağ atriyumda bir çentik yap. Daha sonra, 250 birim-başına mililitre heparinize en az 20 mililitre ile kalp perfuse, kalsiyum-magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat bir değişken akış peristaltik pompa ile dakikada iki mililitre salin tamponlu. Perfüzyon temiz PBS sağ atria çıktığında tamamlanır.Kalbi aorttan kesin ve buz gibi kalsiyum-magnezyumsuz DPBS'ye yerleştirin. Sonra kalbi 15'e 15 santimetrelik petri kabına aktar. Parçaları kapsayacak kadar enzim çözeltisi ile yay makas ve ince nokta forseps kullanarak küçük parçalar halinde kalp kesin.Şimdi, parçaları ve çözeltiyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve parafin plastik filmle kapatın. 37 derecede, yörüngesel bir çalkalayıcıyla 120 rpm'de 75 dakika kuluçkaya yat. Enzim çözeltisi ile kollajenaz sindirim sonra, yeni bir 50 mililitrelik tüp içine 100 mikron hücreli süzgeç ile sıvı decant, böylece parçalar kuruması yeterli çözüm bırakarak.İnce nokta lı forceps kullanarak, tüpten doku almak ve bir mikroskop slayt üzerine birkaç parça yerleştirin. Sonra, iki mikroskop slaytlar arasında doku kırmak için doku eziyet. Yeni bir 50 mililitrelik konik tüp içine enzimiçermeyen kültür medya ile slaytlar durulayın.Tüm doku parçaları ayrıştırılıncaya kadar bu adımı tekrarlayın. Gergin çözeltiyi ve zeminden yukarı dokuyu tek bir tüpte birleştirin. 100 mikronluk hücreli bir süzgeçten çıkan süspansiyonu yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe zorlayın.Numuneyi 220 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Önceki çözeltiyi aspire edin ve DPBS ve sığır serum albumini içeren soğuk FACS boyama tamponundaki hücre peletini nazikçe yeniden askıya alın. Hücreleri sayve hücre sayacı kullanarak canlılığı kontrol edin.DPBS ve sığır serum albumini içeren soğuk FACS boyama tamponu ile mililitre başına bir milyon hücreye hücreleri seyreltin. Hücreler artık lekelenmeye ve sıraya girmeye hazır. Tüm kontroller ve hücre örnekleri için beş mililitrelik FACS tüpleri hazırlayın ve etiketleyin.Aliquot lekesiz bir örnek için tüp başına hücrelerin bir mililitre, floresan eksi bir kontrolleri, ve isotype eşleşen kontroller. Sıralama için kalan hücreleri kullanın. Tüm kontroller ve numuneler aynı anda hazırlanabilir ve elde edilebilir.Ayrıca, dokuz tazminat kontrolleri, lekesiz boncuklar iki tür artı marker panelinden yedi farklı florokromlar toplam beş mililitreLIK FACS tüpleri hazırlamak ve etiket. Floresan telafi kontrollerini optimize etmek için, sıkma şişesinden her tüpe bir damla tazminat boncukekleyin. Sonra, boncuklar antikor bir mikrolitre ekleyin.Marker panelinden her antikor için tekrarlayın. Spektral çakışma nedeniyle arka plan boyama optimize etmek için FMO kontrolleri kullanın. FMO kontrol tüpleri hücreleri için, bir-100 seyreltme marker panelinden tüm antikorlar ekleyin, ama bir antikor hariç.Her antikor için toplam yedi kontrol için tekrarlayın. Nonspesifik boyama için isotip uyumlu kontrol antikorları kullanın. İzotip uyumlu etiketli tüplerdeki hücrelere, bir ila 100 seyreltme de isotip uyumlu kontrol antikorlarını ekleyin.Daha sonra, sıralanacak hücreleri hazırlayın. Taze izole hücreleriçin, bir-100 seyreltme bir antikor kokteyl ekleyin. Ayrıca, bir-1, 000 seyreltme hücre canlılık boya ekleyin.Kuvvetle darbe girdap tarafından tazminat kontrolleri karıştırın. Dört santigrat derecede 30 dakika kuluçka, ışıktan korunmuş, hücre canlılığı boncuklar hariç, hangi oda sıcaklığında bırakılabilir, ışıktan korunmaktadır. FMO kontrollerini, izotip uyumlu kontrolleri ve darbe girdaplarına göre sıralanacak hücreleri nazikçe karıştırın.Işıktan korunan, 4 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat. Her bir telafi kontrolü, FMO kontrolü ve isotip kontrolüne üç mililitre FACS boyama tamponu ekleyin. Tüpleri 300 kez g'de beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin.Çözeltiyi aspire edin ve her peleti 400 mikrolitre FACS boyama tamponunda yeniden askıya alın. Telafi kontrolleri, FMO denetimleri ve isotip denetimleri artık kullanıma hazır. Boyama sonrasında hücreleri, 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez g santrifüj ile FACS boyama tamponu ile yıkayın.Çözeltiyi aspire edin ve FACS boyama tamponundaki hücre peletini mililitre başına 0,5 milyon hücreye yeniden askıya alın. 35 mikron filtre üstleri olan yeni FACS tüpleri kullanarak, tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için kapaklar ve yerçekimi filtrasyon üzerine lekeli hücre örnekleri pipet. Buzda kal.Hücreleri arındırmak için bir hücre ayırıcıkullanın. Voltajları ayarlamak ve arka plan sinyalini düzeltmek için hücre ayırıcısındaki lekesiz hücreleri çalıştırın. Her kanal için voltajları ayarlamak ve pozitif sinyal için kapıları ayarlamak için her tek renkli kompanzasyon boncuk örneğini teker teker çalıştırın.Verileri toplayın. Kompanse matrisini hesaplayarak spektral çakışmayı hesaplamak için yazılımı kullanın. Tüm voltajlar hazır ve ayarlanmış.Her isotype denetimini teker teker çalıştırın. Bu veriler, varsa belirli olmayan bağlama için kapıları ayarlamak için kullanılabilir. Her FMO örneğini aynı anda çalıştırın.Çok renkli bir panel sayesinde spektral kanamayı düzeltmek için her kanalın voltajlarını ayarlayın. Lekeli hücre örneklerini hücre ayırıcısında çalıştırın. 15 mililitrelik konik toplama tüpünde 10 mililitrelik enzimsiz kültür medyasında hücreleri toplayın.Aşağıdaki gating stratejisini kullanın. İlk olarak, tek hücre kapısı. Sonra, canlı hücreler için kapı.Sonra, CD45-negatif hücreler için kapı. CD34 ve CD31-negatif hücreler için kapı. Sonra, NG2-pozitif hücreler için kapı.Ve son olarak, CD146 ve CD140b-pozitif hücreler için kapı. Kültür perisitleri için, 24 kuyulu bir tabakta enzimsiz kültür medyasında taze elde edilen hücreleri tohumlayın. Kültür bir hücre kuluçka hücreleri 37 santigrat derece, 5% karbondioksit ve% 95 oksijen olarak ayarlayın.Enzimatik sindirim ve tüm kalbin dissociation sonra ve hücrelerin FACS arıtma önce, hücreler kalpten birçok farklı hücre türleri içeren kaba bir karışımdır. FACS arınma ve kültürlenme den sonra hücreler homojendir. Onlar tek çekirdekli, oldukça düz, ve tipik perisit rhomboid morfolojisi var.FACS kullanılarak hücreler homojenolarak saflaştırılır. İlk olarak, enkaz ve doublets ileri ve yan dağılım dağılımları dayalı dışarı kapılı edildi. Daha sonra, ölü hücreler boya ile amin reaksiyonu nedeniyle dışarı kapılı edildi, hangi canlı hücrelerden daha büyük ve daha yoğun bir sinyal üretir.Canlı hücrelerden hematopoetik hücreler CD45-pozitif olarak çıkarıldı. Hematopoetik ve endotel hücrelerini daha da uzaklaştırmak için CD34-pozitif ve CD31-pozitif hücreler çıkarıldı. Son olarak, tipik perisit belirteçleri ekspresyonu ile perivasküler hücreler olduğu için NG2-pozitif ve CD140b/CD146-pozitif hücreler seçildi.İnsan beyin perisitleri ile karşılaştırıldığında, hücreler benzer bir morfolojiye sahipti. Fare ve insan düz kas hücreleri ile karşılaştırıldığında, hücreler perisit belirteçleri için immünositokimya ile yedinci geçitte hücrelerin farklı morfoloji Sinotik karakterizasyonu vardı morfoloji veya marker ekspresyonu gözlenen bir değişiklik gösterdi. Benzer şekilde, yedinci geçitteki perisitlerin akış sitometrisi ile yapılan analizler popülasyonun homojen kaldığını doğrulamıştır.Hücre canlılığı iyi bir verim elde etmek için önemlidir. Satın alma sırasında doku soğuk tutun ve hücre boyama sırasında hücreleri soğuk tutun. Ayrıca, enzimatik çözeltinin her seferinde taze olarak hazırlandıklısun.Doku sonrası doğru hücrelerin izolasyonu sağlamak için, akış sitometrisi ve immünofloresan boyama ile karakterize edin. Bu hücreler fonksiyonel bariyer çalışmaları için endotel hücreleri ile coculture deneylerde kullanılabilir, hem de biyolojik ve fizyolojik fonksiyon ve özelliklerini incelemek için tahliller. Kardiyak perisitler vasküler bütünlük ve stabilitede temel bir rol oynarlar ve disfonksiyonları küresel kardiyak fonksiyona bağlıdır.Bizim tekniği ile, araştırmacılar kardiyak perisitlerin terapötik potansiyelini keşfedebilirsiniz.

isolation-and-purification-of-murine-cardiac-pericytes

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada, fare pulmoner endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mekanik ve enzimatik akciğer dokusunda ayrılma yanı sıra anti-PECAM-1 ve çoğunlukla mikrovasküler kökenli saf bir endotel hücre popülasyonu üreten manyetik boncuk, konjuge anti-ICAM-2 antikorları kullanarak 2-aşamalı bir arınma süreci kapsar.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Bu video, bir fare beyninden serebral perisitleri izole etmek için bir yöntemi göstermektedir. İzole edilen hücreler, perisit proliferasyonunu teşvik etmek için perisite özgü ortamda kültürlenir.

Fare Serebral Perisitlerinin İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Bu protokolün amacı, koroner dolaşımdan fare primer vasküler düz kas hücrelerinin izolasyonu ve kültür teknikleri (VSMC) göstermektir. VSMC'Ier izole edildikten sonra, pek çok standart kültür teknikleri için kullanılabilir.

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

İnsan kalp dokusu miyokardiyal rejenerasyonu için uygun multipotent perivasküler öncü hücre popülasyonlarının barındırır. Perisitler ve CD34 + CD146 - - adventisya hücreleri, insan miyokard burada tarif edilen teknik, yerli kan damarları, örneğin CD146 + CD34 ile ilgili iki multipotent stromal hücre popülasyonlarının eş zamanlı izolasyonu ve saflaştırılması mümkün kılar.

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

Bir fare kalpten farklı kardiyak hücre tiplerinin izolasyonu için çeşitli protokoller geliştirilmiş ve açıklanmıştır. Burada, yüksek kaliteli ana kardiyak hücre tiplerinin (kardiyomiyosit, endotel hücreleri ve fibroblastların) tek bir preparasyondan izole edilmesini sağlayan deneysel maliyetleri düşüren optimize edilmiş bir protokol tarif edilmiştir.

Bir Yetişkin Sıçan Kalpten Yüksek Kalitede Kardiyomiyosit, Endotel Hücresi ve Fibroblastların Eşzamanlı İzolasyonu

Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna olanak tanıyan bir FACS tabanlı protokolü açıklamaktadır.

Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu

Mikrovasküler endotel hücreleri iskelet kas (MMEC) kas kılcal iç duvar şekil ve her ikisi de, düzenleyen sıvıları/molekülleri ve geçiş (bağışıklık) hücre arasında kas doku ve kan değişimi. Birincil fare MMEC, yalıtım burada açıklandığı gibi kapsamlı tüp bebek araştırmalar "myovascular birimi" sağlar.

Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

Biz murine serebral perisit lerin çıkarılması için bir protokol sıyoruz. Antibiyotiksiz zenginleştirme odaklı perisit çıkarma dayanarak, bu protokol, böylece kullanılan deneysel hayvan sayısını azaltarak, yüksek saflık ve yüksek verim sağlayan in vitro çalışmalar için değerli bir araçtır.

Serebral Perisitleri Fareden Ayırmak Için Yüksek Çıkış Yöntemi

Kardiyolojide hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için altın standart kardiyomiyositlerdir. Bu makalede, fare kardiyomiyositlerini izole etmek için Langendorff dışı tekniğe yapılan uyarlamalar açıklanmaktadır.

Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

ScRNA-seq gereksinimlerini karşılayan fare beyni kortikal perisitlerini elde etmek için, CD13⁺/CD31⁻ seçimine dayalı kritik optimize edilmiş bir FACS protokolü sunuyoruz. Ana iyileştirmelerimiz, hücre canlılığını ve RNA bütünlüğünü önemli ölçüde artırır ve güvenilir transkriptomik profilleme imkanı sağlar.

Fare Kortikal Dokusundan Perisitlerin Tek Hücreli Dizileme için FACS Kullanılarak İzolasyonu

Öğrenin, fare modellerinden kardiyak perisit izolasyon ve saflaştırma yöntemini. FACS ile hücre saflığı sağlanır ve kardiyovasküler biyoloji araştırmalarına katkı sunar.

Murine Kardiyak Perisitlerin İzolasyon ve Safifikasyonu

Daha fazla video keşfet