Name: MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Öğrenin lipoprotein parçacıklarında mikroRNA zenginleştirme ve hücresel alım hızı ölçümü için kuantitatif PCR tabanlı protokol. Bu yöntemler HDL ve LDL partiküllerinin yeniden yapılandırılmasını içerir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Avusturya Bilim Fonu Projesi P29110-B21, "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien Zur Förderung der Wissenschaft" projesi H-3065/2011, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (EFRE, IWB2020), üst federal devlet tarafından destekleniyordu. Avusturya ve "Land OÖ Basisfinanzierung".

<ol><li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).</li>
<li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li>
<li>Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+Synthesis%2C+mechanism%2C+function%2C+and+recent+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).</li>
<li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li>
<li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+Translation+and+Stability+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs.</a> Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).</li>
<li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs%3A+Are+the+answers+in+sight%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight?</a> Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li>
<li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+High-Density+Lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of High-Density Lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).</li>
<li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+AFM+and+Applications+to+Biomolecular+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Patsch, J. R., Patsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonal+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Zonal ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Yamamoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Techniques+for+Observing+Dynamic+Biomolecular+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes.</a> Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).</li>
<li>Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor%2C+class+B%2C+type+I-dependent+stimulation+of+cholesterol+esterification+by+high+density+lipoproteins%2C+low+density+lipoproteins%2C+and+nonlipoprotein+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).</li>
<li>Hochberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+False+Discovery+Rate%3A+a+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biology. 10 (6), (2009).</li>
<li>Schumaker, V. N., Puppione, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%5D+Sequential+Flotation+Ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">6] Sequential Flotation Ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).</li>
<li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).</li>
<li>Meier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+chronic+kidney+disease+on+macrophage+cholesterol+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux.</a> Life Sciences. 136, 1-6 (2015).</li>
<li>Axmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+Lipoprotein+Particle+miRNA+Profile+in+Uremia+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.</a> Genes. 9 (11), 533(2018).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Burada, lipoprotein parçacık fraksiyonları insan kanı ve kendi bireysel miRNA içeriğinin belirlenmesi yalıtım adım-adım açıklanmıştır. Yalıtılmış ve sentezlenmiş miRNA işleme sırasında bir RNase-Free ortamda çalışmak için önemlidir-parçacık gömülü miRNA belli ki enzimatik bozulması korunaklı. Yerli lipoprotein parçacıklarının miRNA/parçacık oranı oldukça düşüktür, miRNA ile yapay zenginleştirme hücrelerin Holo parçacık alımı incelemek için gereklidir. Böylece, daha önce açıklandığı gibi HDL partiküllerinin yeniden oluşturulması7 Mirna iplerini birleştirmek için değiştirilir. Ayrıca, bu prosedür sırasında lipid ve protein fraksiyonu ayrılması bilim adamlarının lipoprotein parçacık19lipid ve protein ilişkili bileşenlerini incelemek için izin verir. Benzer şekilde, LDL parçacıklarının etiketleme prosedürü adapte edilir. İlginçtir, spermine ilavesi-nükleotidler doğal bir stabilizatörü-miRNA/parçacık oranını etkilemez. Bu, prensip olarak, yöntem bir lipoprotein parçacık içinde miRNA daha diğer maddelerin infolding sağlar unutulmamalıdır. Tabii ki, HDL genel boyutuna göre maddenin fiziksel boyutu ile ilgili bir sınır vardır (çap: 5-12 NM) ve LDL parçacıklar (çap: 18-25 Nm).
Reconstituted/etiketli lipoprotein parçacıklarının kalite kontrolü ile ilgili olarak HS-AFM, tek parçacık seviyesinde HDL/LDL parçacıklarını karakterize etmek için uygulanabilir bir yöntemdir. EM ile karşılaştırıldığında, daha kısa hazırlık süreleri ve yakın fizyolojik koşullar (ıslak, oda sıcaklığı) sağlar.
Doğal duyarlılığı ve amplifikasyonu nedeniyle qPCR, düşük miRNA konsantrasyonlarını algılamak için tercih edilen yöntemdir. Alternatif olarak, tek molekül duyarlı Floresan Mikroskobu, hatta bireysel molekülleri algılamak mümkün, düşük konsantrasyonları nedeniyle uygun olmayacaktır, örneğin, Parçacık başına floresan etiketli miRNA ipleri. Böylece, yerli lipoprotein parçacığın başına miRNA iplerin oranı 10-8olarak bulunmuştur. Yapay zenginleştirme, hücresel lipoprotein alımını oranının (doğal lipoprotein parçacıkları 19kullanılarak algılanmayan) tahmin edilmesini kolaylaştıran 10.000 faktörüyle oranı artar. QPCR 'nin yüksek duyarlılığı, kuluçka süresi ve miRNA/parçacık oranı sonrasında miRNA iplerin sayısını ölçerek bu alımı hızını belirlemenize olanak sağlar. Hesaplanan değerin hücresel bozulması ve Mirna 'nın serbest bırakılması yok sayar ve bu nedenle, lipoprotein parçacık alımını oranı için en az bir alt sınırı temsil ettiği belirtilmelidir.
Gelecekte, yöntem hücrelerde ilaç maddeleri (özellikle de lipophilik olanlar) aktarmak için adapte edilebilir ve hücre içi konsantrasyon (lipoprotein parçacıkları alımını oranı ile belirlenir) biyolojik etkisini ilişkilendirir.

Lipoprotein parçacıkları, kolesteril esterleri ve trigliserid yağların bir çekirdeğini kapsayan, amphiphilik lipidler ve kolesterol bir tek tabakalı oluşur. Tüm parçacık, parçacık biyolojik işlevselliğini tanımlayan membran gömülü Apolipoproteinler tarafından stabilize edilir. Lipoprotein parçacıklar kendi artan yoğunluğa göre ayırt edilebilir ve böylece, azalan boyutu, yani çok-düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL), orta yoğunluklu lipoprotein (IDL), LDL, ve HDL parçacıkları. Kan dolaşımında su çözünmez bileşenlerin taşınması rağmen, bu HDL parçacıkları Mirna1,2kodlama olmayan ipler taşımak göstermiştir. Mikro-Rnas kısa bir sınıf (genellikle iki düzine nükleotis) RNA ipleri, hangi hücre dışı tamamlayıcı mRNA iplerini düşür ve böylece, belirli proteinler ifade profilini değiştirmek3,4,5, 6' ya kadar. Ayrıca, miRNA profilinin değişimleri çeşitli hastalıklarda bulunmuştur ve böylece profil tanı ve prognoz için bir biyomarker olarak uygulanabilir. MiRNAs 'ın lipoprotein parçacıkları aracılığıyla hücreler arasında harici olarak taşınması, hücre içi mRNA seviye modülasyonu için ek bir mekanizma olarak hizmet verebilir. Biyolojik etkiyi niceciksel olarak tahmin etmek için lipoprotein parçacıklarının mutlak ve göreceli miRNA içeriğine ilişkin bilgi gereklidir.
Nicel gerçek zamanlı PCR bu bilgileri elde etmek için uygun ve nispeten hızlı bir yöntemdir. Bu nedenle, göreli kantifikasyon (RQ) değeri hesaplanabilir ve farklı örnekler ile lipoprotein fraksiyonları arasındaki göreceli farklar tahmin edilebilir. Multiwell mikrofluidik dizi kartları, bir örnekteki miRNAs 'ın göreli varlığını (RQ değerine eşittir) belirlemek için hızlı ve kolay kullanımlı bir yöntemdir. Multiwell mikrofluidik dizi kartları mikrofluidik bir cihaza gömülü bireysel qPCR reaksiyonlar için 96 veya 384 bireysel reaksiyon odaları oluşur. Her oda, tek bir miRNA için gerekli hidroliz prob ve belirli qPCR astar içerir. Avantajlar, standardizasyon, basit bir iş akışı ve daha az sayıda pipetleme adımından dolayı kısa bir kullanım zamanıdır. Dahası, gerekli numune hacmi minimize edilir. Göreli quantification aksine, mutlak miRNA içeriği miRNA iplerin bilinen mutlak sayılar standart eğrileri ile qPCR örnek sonuçları bir karşılaştırma gerektirir. Bu unutulmamalıdır ki, nispeten düşük miRNA içeriği nedeniyle, standart ve, dahası, hatta tek molekül duyarlı görüntüleme teknikleri mümkün değildir-miRNA ile lipoprotein partiküllerinin yapay zenginleştirme hücresel çalışma kaçınılmaz lipoprotein parçacık etkileşimi ve miRNA transferi. Bununla ilgili olarak, HDL parçacığın delipidation sonraki relipidation7 ile birleştirilmesi ve böylece, Mirna ipleri ile zenginleştirme sağlar izledi. MiRNA ile LDL partiküllerinin benzerliği, LDL parçacıklarının ana bileşeni olan apoB-100 proteinin hidrofobiği nedeniyle uygulanabilir değildir. Ancak, lipid membranlarına nüfuz eden Polar solvent dimetil sülfoxid (DMSO) ek olarak, LDL parçacıkları yapay olarak miRNA ipleri ile de yüklenebilir.
Yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobu (HS-AFM) subnanometer uzamsal ve subsecond temporal çözünürlük8sunan biyolojik numunelerin karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. Bu nedenle, yerel/reconstituted/etiketli lipoprotein parçacıkları gibi değiştirilmiş lipoprotein parçacıklarının kalite kontrolü için iyi uygun bir tekniktir, yakın fizyolojik bir çevre altında görüntülenmiş olabilir.
Burada, qPCR tabanlı bir protokol, lipoprotein parçacıklarının ve hücre örneklerinin mutlak/göreceli miRNA içeriğini belirlemek için adım adım sunulur ve bu da hücresel lipoprotein parçacık alımı oranının tahmin edilmesini sağlar. Dahası, miRNA ile lipoprotein parçacıklarının zenginleşmesi için bir yöntem gösterilmiştir. Bu yöntem lipoprotein içeriğinin genel manipülasyon için adapte olabilir ve bu nedenle, ilaç teslimi için hedefler olarak lipoprotein parçacıklarının uygulanabilirliğini gösterir.

<table><tbody><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Optima</td><td>L-100 XP</td><td>Lipoprotein izolasyonu</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj rotoru</td><td>Beckman</td><td>TI 55.2</td><td>Lipoprotein izolasyonu</td></tr><tr><td>Vacutainer (EDTA)</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>Lipoprotein izolasyonu</td></tr><tr><td>Kaliumbromid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2110</td><td>Lipoprotein izolasyonu</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckman</td><td>342414</td><td>Lipoprotein izolasyonu</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüp mühürleyen</td><td>Beckman</td><td>342428</td><td>Lipoprotein izolasyonu</td></tr><tr><td>Sodyumklorid</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Lipoprotein izolasyonu</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0650/50</td><td>Lipoprotein izolasyonu</td></tr><tr><td>Diyaliz tüpleri, MWCO 12 - 14k</td><td>Spectra</td><td>132700</td><td>Lipoprotein izolasyonu</td></tr><tr><td>sentetik miRNA</td><td></td> <td>mikroSynth-sentetik</td> <td>miRNA</td></tr><tr><td>TRIS tamponu pH 7</td><td>Ambion</td><td>AM9850G</td><td>sentetik miRNA</td></tr><tr><td>TRIS tamponu pH 8</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>sentetik miRNA</td></tr><tr><td>steril tüpler</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>ENE8.1</td><td>sentetik miRNA</td></tr><tr><td>Fotometre</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Biyofotometre</td><td>Bradford testi</td></tr><tr><td>Küvet</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>XK20</td><td>Bradford testi</td></tr><tr><td>Coomassie G-250 Leke</td><td>BioRad GmbH</td><td>161-0786</td><td>Bradford testi</td></tr><tr><td>Sodyumklorid</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957.1</td><td>Delipitasyon</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fluka Analitik</td><td>03690-100ML</td><td>Delipitasyon</td></tr><tr><td>TRIS tamponu pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>Delipitasyon</td></tr><tr><td>Etanol %100</td> <td>AustrAlco</td><td>Etanol Absolut %99,9</td> <td>Delipitasyon</td></tr><tr><td>Dietil eter</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3942.1</td><td>Delipitasyon</td></tr><tr><td></td><td>Santrifüjü Thermo Scientific</td><td>Multifuge X3R</td><td>Delipitasyon</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>Sulandırma</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4627.1</td><td>Sulandırma</td></tr><tr><td>Fosfatidilkolin</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>P3556-25mg</td><td>Sulandırma</td></tr><tr><td>Kolesterol oleat</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C-9253-250mg</td><td>Sulandırma</td></tr><tr><td>kolesterolü</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C8667-500mg</td><td>Sulandırma</td></tr><tr><td>cam tüpler</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K226.1</td><td>Sulandırma</td></tr><tr><td>spermi</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>S3256-1G</td><td>Sulandırma</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer comfort</td><td>Sulandırma</td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>3097-25G</td><td>Sulandırma</td></tr><tr><td>Manyetik karıştırma çubuğu</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0955.2</td><td>Sulandırma</td></tr><tr><td>100&mikro; L mikropipetler</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A762.1</td><td>Sulandırma</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9143.2</td><td>Diyaliz</td></tr><tr><td>Amberlite XAD-2 boncuklar</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>10357</td><td>Diyaliz</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer kaset (kesme 20 kDa)</td><td>Thermo Scientific</td><td>66003</td><td>Diyaliz</td></tr><tr><td>Şırıngası</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td>Diyaliz</td></tr><tr><td>Şırıngası iğne</td><td>Braun</td><td>465 76 83</td><td>Diyaliz</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3054.2</td><td>LDL partiküllerinin etiketlenmesi</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>D12345</td><td>LDL partiküllerinin etiketlenmesi</td></tr><tr><td>Atomik Kuvvet Mikroskobu</td><td>RIBM</td><td>SS-NEX</td><td>Sulandırılmış/etiketlenmiş lipoprotein partiküllerinin kalite kontrolü</td></tr><tr><td>Muskovit Mika (V-1 Sınıfı)</td><td>Christine Gr&ouml; pl</td><td>G250-1/V1</td><td>Sulandırılmış/etiketlenmiş lipoprotein partiküllerinin kalite kontrolü</td></tr><tr><td>AFM Cantilever</td><td>Nanoworld</td><td>USC-F1.2-k0.15</td><td>Sulandırılmış/etiketlenmiş lipoprotein partiküllerinin kalite kontrolü</td></tr><tr><td>Gwyddion 2.49</td><td>Çek Metroloji Enstitüsü</td><td>http://gwyddion.net</td><td>Sulandırılmış/etiketlenmiş lipoprotein partiküllerinin kalite kontrolü</td></tr><tr><td>Oda slaytları, Nunc Lab-Tek</td><td>VWR</td><td>734-2122</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9117.1</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Hücre sayacı</td><td>Omni Life Science GmbH</td><td>Casy</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217004</td><td>miRNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>miRNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>20G iğne</td><td>Braun</td><td>Sterican 465 75 19</td><td>miRNA ekstraksiyon</td></tr><tr><td>5ml şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>309050</td><td>miRNA ekstraksiyon</td></tr><tr><td>PCR kabini</td><td>Esco</td><td>PCR-3A1</td><td>Ters Transkripsiyon</td></tr><tr><td>TaqMan Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td>Ters Transkripsiyon</td></tr><tr><td>Rnaz içermeyen su</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T143</td><td>Ters Transkripsiyon</td></tr><tr><td>0.2 ml tüpler</td><td>Marka</td><td>781305</td><td>Ters Transkripsiyon</td></tr><tr><td>Santrifüjü</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Mikrosantrifüj AL</td><td>Ters Transkripsiyon</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>Ters Transkripsiyon</td></tr><tr><td>TaqMan Primer</td><td>Thermo</td><td></td> <td>Scientific-qPCR</td></tr><tr><td>iTaq Evrensel prob supermix</td><td>BioRad GmbH</td><td>1725131</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>PCR makinesi</td><td>Corbett</td><td>Rotor-Gene RG-6000</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4366596</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Megaplex RT Primerleri, İnsan Havuzu A v2.1</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4399966</td><td>TaqMan</td></tr><tr><td>Dizisi TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4391128</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primerler, İnsan Havuzu A v2.1</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4399933</td><td>TaqMan Dizisi</td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, UNG yok</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4440040</td><td>TaqMan</td></tr><tr><td>Dizisi TaqMan Gelişmiş miRNA İnsan A Kartları</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>A31805</td><td>TaqMan Dizisi Nükleaz</td></tr><tr><td>içermeyen su</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td>TaqMan Dizisi</td></tr><tr><td>MgCl2 (25mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0971</td><td>TaqMan Dizisi</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Canlandırıcı</td><td>AM9849</td><td>TaqMan Dizisi</td></tr><tr><td>7900HT Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4351405</td><td>TaqMan Dizisi TaqMan Dizisi</td></tr> Kart <tr><td>Mühürleyen</td><td>Uygulamalı Biyosistemler-TaqMan</td><td></td> <td>Dizisi</td></tr></tbody></table>

microrna ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microrna içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein parçacıklar kan dolaşımında lipid ve kolesterol ağırlıklı taşıyıcılar vardır. Ayrıca, küçük miktarlarda kodlaması olmayan microRNA (miRNA) ipleri içerir. Genel olarak, miRNA, Messenger-RNA (mRNA) ile etkileşimleri nedeniyle protein ifadesi profilini değiştirir. Böylece, lipoprotein parçacıklarının göreceli ve mutlak miRNA içeriğinin bilgisi, hücresel parçacık alımı biyolojik etkisini tahmin etmek için esastır. Burada, lipoprotein parçacıklarının mutlak miRNA içeriğini belirlemek için, yerli ve miRNA zenginleştirilmiş lipoprotein parçacıkları için gösterilen örneklenmiş bir nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tabanlı protokol sunulmaktadır. Göreceli Mirna içeriği multiwell mikroakışkan dizi kartları kullanılarak niceleyilmiş. Ayrıca, bu protokol bilim adamlarının hücresel Mirna ve böylece, lipoprotein parçacık alımını oranı tahmin sağlar. Hücre miRNA seviyesinin önemli bir artışı, miRNA ile yapay olarak yüklenmiş yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) parçacıkları kullanıldığında gözlemlenebilir, ancak yerel HDL partikülleri ile inkübasyon oldukça düşük miRNA içeriği nedeniyle önemli bir etki vermez. Buna karşılık, düşük yoğunluklu lipoprotein hücresel alımı (LDL) parçacıklar-ne yerli miRNA ile ne de yapay ile yüklü-hücresel miRNA seviyesini değiştirmez.

Burada, lipoprotein parçacıklarının yerel Micro-RNA içeriğinin (mutlak/göreceli) belirlenmesi için nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon tabanlı protokol sunulur. Buna ek olarak, Mikro-RNA seviyesini artırmak için bir yöntem, hem de lipoprotein parçacıkları hücresel alımını oranını belirlemek için bir yöntem gösterilmiştir.

MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Lipoprotein parçacıkları yerli taşıma araçlarıdır. Yabancı maddelerin zenginleşmesi, palet taşıyıcısı olarak kullanımını kolaylaştırır. Moleküllerin veya bütün parçacıkların özel olarak etiketlemi hücresel alımının ölçülmesini mümkün kılar.Zenginleştirme için iki yöntem hızlı ve kullanımı kolaydır ve maddelerin geniş bir yelpazede için adapte edilebilir. Prosedürü gösteren Markus Axmann ve Andreas Karner, laboratuvarımdan iki doktora sonrası. Duman kaputunda delipidasyona başlamak için, beş miligram HDL partikülü içeren bir ila iki mililitre uzunluğundaki HDL çözeltisini, konik bir santrifüj tüpünde önceden soğutulmuş üç-iki etanol etil eter karışımıile 50 mililitre HDL parçacıklarını karıştırın.Negatif 20 derecede iki saat kuluçkaya yat. 2500 kez g'de 10 dakika boyunca negatif 10 santigrat derecede santrifüj. Supernatant atın, önceden soğutulmuş etanol etil eter karışımı 50 mililitre pelet resuspend, ve girdap kısaca.Negatif 20 santigrat derecede iki saat boyunca ikinci kez kuluçkaya yat. Negatif 10 santigrat derece 10 dakika için 2500 kez g tekrar santrifüj. Sonra pelet kurutmak için azot gazı akışı sağlayan tüpler ekleyin.Ve 250 mikrolitre tampon A.Bradford protein isay'ını ya da uygun bir tanesini kullanarak protein konsantrasyonu belirleyin. Bu çözücüler apolipoproteinlerin relipidasyon inhibe edeceğini gibi, etanol diethyl eter karışımı nın herhangi bir kalıntıları kaldırmak için önemlidir. Sonra, tampon A.Insert bir tüp tüp çözelti parçası içine inert gaz sağlayan bir tüp eklemek başına protein bir miligram son konsantrasyonu seyreltin.Gerekirse, solüsyonu bir gecede, inert gaz atmosferinin altında dört santigrat derecede saklayın. Yeniden yapılmaya başlamak için, temiz bir cam tüpte 100 mikrolitre CO, 13,5 mikrolitre C ve 500 mikrolitre PC'yi karıştırın. Daha sonra homojen bir yüzey tabakası verim için karışımı kurutmak için tüp içinde azot gazı kızarma sırasında cam tüp döndürün. 0.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünde, tampon A.Then 100 mikrolitre 100 mikrolitre sentetik mikroRNA ile 100 mikrolitre spermin çözeltisi ile iki mililitrelik reaksiyon tüpünde taze 30 milimolar spermin çözeltisi hazırlayın.Ve 30 derece santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat. Daha sonra, hazırlanan PC-CO-C mastermix yüzey tabakasını yeniden sulamak için kuluçkaya yatan 200 mikrolitrelik çözeltiyi cam tüpe aktarın. Ve sonra mililitre sodyum deoksiol çözeltisi başına 30 miligram 50 mikrolitre ekleyin.İki saat boyunca dört derecede karıştırın. Bundan sonra, cam tüp içine delipidated HDL çözeltisi 250 mikrolitre ekleyin. Ve bir gecede 4 derece karıştırın.Diyalize başlamak için, ilk çift distile su 800 mililitre adsorbent boncuk 50 gram ekleyin. Ve bir dakika karıştırmak için manyetik karıştırıcı kullanın. Boncukların yerleşmesi için 15 dakika bekleyin ve süpernatant'ı dekantlayın.İşlemi önceden soğutulmuş PBS ile tekrarlayın. PBS'de ıslak öncesi diyaliz kasetleri. Üreticinin talimatlarına göre kasetlere önceden hazırlanmış karışımı eklemek için bir şırınga kullanın.PBS tarafından işlenmiş adsorbent boncukları üç litre PBS'ye ekleyin ve kasetleri PBS'ye yerleştirerek dört santigrat derecede diyalize alın. Boncuklar diyaliz membranı boyunca yoğunluk gradyanı sabit tutar. Bir saat ve iki saat sonra arabellek ve boncuk değiştirin.24 saat sonra, bir şırınga ile, yeniden oluşturulan HDL parçacık çözeltisini kurtarmak için kasetteki çözeltiyi 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne alın. Bradford tsay kullanarak protein konsantrasyonu belirleyin. Reaksiyon tüpüne inert gaz tedarik edin, kapatın ve yeniden oluşturulmuş HDL parçacık çözeltisini durağan gaz atmosferinin altında dört santigrat derecede saklayın.İlk olarak, RNAse içermeyen suda taze 30 milimolar spermin çözeltisi hazırlayın. 100 mikrolitre sentetik mikroRNA 100 mikrolitre spermin çözeltisi ile iki mililitrelik reaksiyon tüpünde karıştırın. Ve 30 derece santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat.Daha sonra hazırlanan mikroRNA spermin çözeltisine 100 mikrolitre DMSO ve 1,2 mililitre 1X LDL tampon ekleyin. PBS ile daha önce hazırlanmış LDL parçacık çözeltisini mililitrebaşına yaklaşık dört miligramlık bir konsantrasyona seyreltin. Daha sonra seyreltilmiş çözeltinin 450 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne çekin ve 50 mikrolitre 10X LDL tamponile karıştırın.Buzda 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 500 mikrolitreLDL parçacık çözeltisi ve 1.5 mililitrelik mikroRNA-spermin-DMSO çözeltisini birleştirin ve 40 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Daha önce açıklandığı gibi diyaliz gerçekleştirin ve etiketli LDL parçacık çözeltisini durağan gaz atmosferinin altında dört santigrat derecede saklayın.Başlamak için, PBS'deki HDL veya LDL parçacık çözeltisini 1'den 100'e 1'e 000 arasında seyreltin. Mika alt tabakasına yapıştırıcı bant basarak ve üst mika katmanlarını çıkarmak için bandı çekerek mikayı ayırın. Beş dakika kuluçka için taze yarık mika üzerinde iki mikrolitre yatırmak için bir pipet kullanın.Lipoprotein parçacıkları yüzeylerde sürekli bağ membranları oluşturma eğilimindedir. Sonuç olarak, mika yüzeyindeki parçacık konsantrasyonunu tek tek ayarlamak önemlidir. Kuluçkadan sonra, örneği PBS ile durula.Yüksek hızlı AFM sıvı hücresini PBS ile doldurun ve mika taşıyan tarayıcıyı yüksek hızlı AFM aşamasına monte edin. Kontrol yazılımında, mika yüzeyine cantilever yaklaşma sürecini başlatın. Bir metre kareden daha az ölçüm boyutları kullanın ve görüntüleme kuvvetlerini mümkün olduğunca düşük tutun.Dokunma modunda örneği görüntüleyin. Verileri Gwyddion'a yükleyin ve parçacıkları eşik işlevine göre işaret taneleri aracılığıyla algıla. Tek tek parçacıkları maskelemek için yükseklik eşik değerini ayarlayın.Genellikle, % 50 civarında bir seviye iyi bir başlangıç noktasıdır. Görüntüyü düzleştirmek için çok nolualt arka planı kaldırın ve maskeli bölge seçeneğini dışla seçeneğini etkinleştirin. Çeşitli tane karakteristiklerinin dağılımı işlevini kullanarak algılanan parçacıkların maksimum yükseklik değerlerini dışa aktarın ve kaydedilen tüm görüntüler için bu adımları yineleyin.Bu deneyde HDL partiküllerinin yeniden yapılandırılması HDL partiküllerinin delipidasyonu ile gerçekleştirildi, ardından relipidasyon ve diyaliz yapıldı. Yeniden oluşturulan HDL partiküllerinin %50'si verim elde edilebilir. Ancak, apolipoprotein B100 proteininin hidrofobikliği nedeniyle, mikroRNA ile aynı etiketleme LDL partiküllerinin etiketlanması için mümkün değildi.Böylece, DMSO LDL parçacıklarının lipid monotabakasının penetrasyonu için kullanılmıştır, kalite kontrolü sırasında %100'e yakın bir verim ile seyreltme analiz için kritiköneme sahiptir. Üstteki görüntü çok yüksek parçacık yoğunluğu gösterir. Alttaki görüntü analiz için uygundur.Parçacık yüksekliklerinin olasılık yoğunluğu fonksiyonları yerli, etiketli ve etiketli kontrol lipoprotein parçacıklarının boyut dağılımlarının karşılaştırılması için hesaplanmıştır. Etiketleme işleminden önce ve sonra göreli değişiklik ihmal edilebilir. RNA oligonükleotidleri işlerken RNAse'siz çalışın.Taze tek kullanımlık plastik sarf malzemeleri kullanın ve her zaman eldiven giyin. Sadece nükleaz içermeyen çözeltiler kullanın. Yüksek hızlı AFM lipoproteinlerin genel şeklini belirlemek için sadece bir yöntemdir.Alternatif bir yöntem elektron mikroskobu olacaktır. Uygun kişisel koruma ekipmanı giyin ve diethyl eter kullanırken bir duman kaputunda çalışın.

enrichment-native-lipoprotein-particles-with-microrna-subsequent

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

MikroRNA'lar önemli bir düzenleyici rol oynar ve çeşitli insan hastalıkları için yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır. MiRNA'ların yüksek yoğunluklu lipoprotein taşınmaktadır gösterilmiştir. Hızla insan plazmasından MiRNA analizi için uygun, saflaştırılmış HDL izole edilmesi için basit bir yöntem geliştirdik.

Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Bu protokol, yüksek yoğunluklu lipoprotein küçük RNA'ların izolasyonunu ve miktar tayinini açıklar.

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

Lipid damlacıkları Hepatit C virüsü (HCV), dahil olmak üzere çeşitli patojenlere replikasyonu için önemli organellerdir. Bu ilişkili proteinler kantitatif kütle spektrometresi için lipid damlacıkları izole edilmesi için bir yöntem tarif; bu tür virüs enfeksiyonu, çevresel stres veya ilaç tedavisi gibi koşullar, çeşitli altında kullanılabilir.

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Bakteriyel lipoproteinler yöntemi bölümleme bir iyonik olmayan yüzey aktif faz kullanarak zenginleştirme doğrudan TLR deneyleri kullanımda veya diğer uygulamalar için tanımlanır. Daha fazla adımlar için yapısal karakterizasyon N-terminal tryptic lipopeptides hazırlamak için kütle spektrometresi tarafından ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Zenginleştirme bakteriyel lipoproteinler ve kütle spektrometresi tarafından yapısal kararlılık için N-terminal Lipopeptides hazırlanması

Bu rapor plazma miRNA, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR ile veya öncesi amplifikasyon olmadan kullanarak mutlak düzeylerini ölçmek için bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı plazma miRNAs miktarı daha iyi anlaşılmasını tanıyor ve nitel karşılık gelen verilerden farklı çalışmalar veya laboratuvar değerlendirmesini sağlar.

Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Bu protokol lipozomların imalatını ve bunların bir yüzeyüzerinde nasıl hareketsiz hale getirilebildiğini ve floresan mikroskopi kullanılarak büyük bir paralel şekilde tek tek nasıl görüntülenebileceğini açıklar. Bu, popülasyonun tek lipozomları arasındaki boyutun ve bileşimsel homojenliğin nicelikselleştirilmesine olanak sağlar.

Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi

Lipid nanopartikülleri mRNA ve DNA kapsülleme için mikroakışkan karıştırma platformu yaklaşımı kullanılarak geliştirilmiştir.

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Burada, mikroRNA paketlemesinin dinamiklerini incelemek ve hücre dışı veziküllere (EV'ler) aktarmak için floresan etiketli mikroRNA'ların bolluğunun in vitro değerlendirmesini sağlayan basit bir protokolü açıklıyoruz.

Akış Sitometrisi Kullanarak Hücre Dışı Veziküllere miRNA Salınımının İzlenmesi

Öğrenin lipoprotein parçacıklarında mikroRNA zenginleştirme ve hücresel alım hızı ölçümü için kuantitatif PCR tabanlı protokol. Bu yöntemler HDL ve LDL partiküllerinin yeniden yapılandırılmasını içerir.

MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi (Video) | JoVE Journal

MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi

Daha fazla video keşfet