Algılama ve ölçme protein Self-montaj In vivo tarafından akış sitometri
17 Temmuz 2019
Bu makalede, her iki S. cerevisiae ve HEK293T hücrelerinde protein kendinden montajı ölçmek için fret tabanlı akış sitometri Protokolü açıklanır.
Hücrelerde protein kendini birleştirme fiziksel temelini anlamak uygun araçların eksikliği ile sınırlıdır. Mevcut yöntemler düşük duyarlılık, dolaylı okumalar, sınırlı iş kaynağı ve/veya popülasyon düzeyi çözümlemesi ile muzdarip. Buna karşılık, bizim testi algılar ve protein lokalizasyonu veya çözünürlüğü ne olursa olsun hassas, tek hücreli, yüksek iş çıkış okuma ile kendi kendine montaj in vivo için bir protein eğilimini ölçer.
Ttük ilk çalışırken, fotoğraf dönüştürme hakkını almak, tüm plaka boyunca iyi bir okuma elde etmek için en uygun koşulları elde etmek için bazı ampirik testler gerektirebilir. Sitometrede FRET ve acceptor sinyalleri için ayrı algılama filtreleri yoksa, tözlerin hassasiyeti de tehlikeye atılabilir. Prosedürü benimle birlikte göstermek Andrew Box olacak, sitometri çekirdeğinin laboratuvar müdürü.
DAmFRET için bir maya kültürü hazırlamak için, her sorgu proteini için, 96 iyi yuvarlak alt kültür plakasının tek tek kuyularında uygun olmayan bir büyüme ortamının 200 mikrolitresinde dönüştürülmüş maya kolonilerini triplicate olarak aşılama. 1,5 milimetrelik bir yörünge ile sallayarak maya hücreleri kuluçka 16 saat boyunca 30 derece santigrat dakikada 200 dönüşler. Kuluçka sonunda, santrifüj ile maya hücreleri tortu ve güçlü inversiyon tarafından supernatants kaldırın.
Uygun bir indüksiyon ortamı200 mikrolitre ekleyin ve başka bir 12 saat için sallayarak kuvöz hücreleri iade. Kuluçka sonunda, santrifüj ve güçlü inversiyon ile maya hücreleri tortu, sonra taze indüksiyon orta 200 mikrolitre ekleyin. Sonra otomatik floresan azaltmak için ek bir dört saat boyunca sallayarak hücreleri kuluçka.
Örnekleri fotoğrafa dönüştürmek için, kapağı olmayan plakayı 320 ila 500 nanometre filtre ve plakanın 45 santimetre yukarısında konumlandırılmış bir ışın kolimatörle donatılmış ultraviyole lambanın altına yerleştirin. Fotoğraf sallamak ile 25 dakika boyunca hücreleri dönüştürmek için lambayı açın. DAmFRET veri toplama için, fotoğraf dönüştürülmüş hücreleri kolineer olmayan 488 ve 561 nanometre lazerlerle bir görüntüleme akış sitometresine yükleyin ve yüksek dairesellik ve küçük bir hücre alanı ile dört tek bir unbudded hücreleri kapısı.
Daha sonra floresan pozitif bir kapı içinde örnek başına dört tek hücre için 2 ila 5 kez 10 veri toplamak. Analizin sonunda, saf donör sinyali için fotoğrafdışı dönüştürülmüş mEos3.1 numunesi ve telafiyi ayarlamak için saf kabul sinyali için monomerik DsRed iki örnek kullanın. Daha fazla hassasiyet için FRET dedektör kanalının analiz programında yayılma hedefi olarak da değerlendirilmesini sağlayın.
AmFRET parametresini toplam FRET kabul sinyaline bölünen toplam FRET sinyalinin oranı olarak hesaplayın. Floresan proteini tek başına ifade eden maya hücrelerinin AmFRET profilleri ihmal edilebilir AmFRET gösterirken, floresan proteine bağlanan kararlı homooligomer olarak ifade edilen maya hücreleri tek tip pozitif AmFRET değerlerini gösterir. Görüntüleme akışı sitometrisi ile elde edilen hücrelerin görüntüleri tüm kanallarda dağınık bir floresan ortaya koymaktadır.
Hücre birden fazla alan için Z yığınlarının konfokal mikroskopisi, floresan'ın her hücrenin sitosolboyunca tek tip bir dağılımını ve saptanabilir puncta'yı göstermez. Tek başına florofor veya florofor artı bir insan inflamatuar protein mutant formu ifade maya hücreleri kendini etkileşim için bir yetersizlik gösteren tüm konsantrasyon aralığı üzerinde ihmal edilebilir AmFRET sergiler. Buna karşılık, yabani tip inflammasome protein bir ihmal edilebilir AmFRET popülasyonu ve bir yüksek AmFRET popülasyonu ile DAmFRET profili gösterir.
Yabani tip inflammasome protein hücrelerin sadece bir kısmını kendi kendine monte formuna protein geçiş ile yüksek konsantrasyonlarda bile kendi kendine montaj karşı olduğunu unutmayın. Bu, kendi kendini birleştirme için bir çekirdeklenme bariyerinin varlığının açık bir göstergesidir. Floresan görüntüleme ile doğrulanan gibi, bu popülasyonlar sırasıyla sadece çözünür protein veya çoğunlukla kendi kendine birleştirilmiş protein içeren hücreleri temsil eder.
Gerçekten de, DAmFRET, iltihaplanmadaki nokta mutantın bu ifade sistemi tarafından ulaşılabilen konsantrasyonlar arasında çekirdekleşmeyi bozduğuna dair önceki yapısal verileri doğrular. Caspase-1 ekspresyonu olmayan memeli hücrelerindeki protein ekspresyonu profillerinin maya hücrelerinde gözlenenlere benzediğini unutmayın. Hatırlanması gereken en önemli adım fotoğraf dönüşümüdür.
Diğer önemli adımlar arasında floresan sinyali için doygun olmayan yeterli sayıda olayın toplanması ve tazminatın doğru şekilde ödenmesi yer almaktadır. Uygun biyokimya ile tetkik takip, rasyonel mutagenez ve yapısal biyoloji yaklaşımları tamamen kendini derleme mekanizması açıklığa kavuşturulması için yardımcı olabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, canlı hücrelerde protein kendiliğinden birleşimini ölçmek için tasarlanmış, özellikle S. cerevisiae ve HEK293T hücreleri kullanarak FRET temelli akış sitometri protokolü sunar. Metodoloji, mevcut tekniklerin sınırlamalarını aşarak yüksek hassasiyet ve tek hücre çözünürlüğü sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Protein kendiliğinden birleşimi
- Hücresel biyoloji
- Akış sitometri teknikleri
Arka Plan
- Protein kendiliğinden birleşimini incelemek için mevcut yöntemler hassasiyet ve verimden yoksundur.
- Hücrelerde protein etkileşimlerinin dinamiklerini anlamak, moleküler biyolojiyi ilerletmek için esastır.
- FRET (Fluoresans Rezonans Enerji Transferi) protein etkileşimlerinin doğrudan bir ölçümünü sağlar.
Kullanılan Yöntemler
- FRET temelli akış sitometri protokolü
- Model organizmalar: S. cerevisiae ve HEK293T hücreleri
- Yüksek verimli veri toplama için tek hücre analizi
Ana Sonuçlar
- Denemenin protein kendiliğinden birleşimini verimli bir şekilde ölçme kabiliyetini gösterdi.
- Kendiliğinden birleşimi gösteren farklı seviyelerde AmFRET sergileyen hücre popülasyonlarını belirledi.
- Kendiliğinden birleşim dinamiklerini doğrulayan görüntüleme teknikleriyle bulguları doğruladı.
Sonuçlar
- Çalışma, canlı ortamda protein kendiliğinden birleşimini ölçmek için güvenilir bir deneme başarıyla kurar.
- Bu protokol, protein etkileşimleri ve hücresel mekanizmalar üzerindeki gelecekteki araştırmalar için önemli etkilere sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative detection of protein self-assembly in vivo is critical for de-risking early discovery targets and understanding mechanistic drivers of disease-relevant protein aggregation. DAmFRET enables high-throughput, single-cell resolution analysis of protein assembly states, supporting predictive confidence in target validation and functional characterization. This capability strengthens portfolio triage by clarifying assembly propensities and nucleation barriers across diverse biological systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of protein self-assembly mechanisms in live cells.
- Supports functional target validation by distinguishing monomeric versus assembled states.
- Facilitates mechanistic de-risking through detection of nucleation barriers and assembly thresholds.
- Improves predictive confidence for advancing aggregation-prone targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, quantitative single-cell readouts for assay development.
- Enables high-throughput screening of protein variants or modulators affecting assembly.
- Supports reproducibility and scalability across model systems and protein classes.
- Delivers robust data for reliable compound or genetic perturbation evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling analysis in both yeast and mammalian cells.
- Supports translational biomarker discovery by quantifying assembly states linked to pathology.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation of aggregation mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic assembly profiles.
Pipeline & Workflow Integration
DAmFRET integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a reusable, quantitative platform for protein assembly analysis at multiple pipeline stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification of protein aggregation.
- Screening: Delivers assay-ready, high-throughput, and reproducible single-cell data.
- Analytics: Provides quantitative AmFRET measurements for comparative analysis of assembly states.
- Translational Research: Enables cross-system validation and biomarker alignment for aggregation-driven pathologies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized workflow adaptable to diverse targets and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput for protein assembly assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for aggregation-prone assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and fluorescence compensation analysis.
- Needs access to imaging flow cytometers with appropriate FRET detection filters.
- Demands rigorous standardization of photo-conversion and gating protocols across teams.
- Adaptable to multiple model systems but may require empirical optimization for each.
- Dependent on sufficient event collection and proper control selection for robust data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:56
Saccharomyces cerevisiae Preparation
2:04
Photoconversion and Distributed Amphifluoric Fluorescence Resonance Energy Transfer (DAmFRET) Data Collection
2:51
Data Analysis
3:32
Results: Representative In Vivo Protein Self-Assembly Detection and Characterization
5:26
Conclusion
