Name: Ekstrasellüler veziküllerin depolama Istikrarı değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin ekstrasellüler veziküllerin depolama istikrarını AF4 ile değerlendirme yöntemini. Glukuronidaz kullanarak farklı hücre kaynaklı veziküllerin karşılaştırmalı saklanabilirliğini analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı NanoMatFutur küçük araştırma programı, Almanya (Grant numarası 13XP5029A) bu işi destekliyor. Maximilian Richter, Doktora Bursu ile Studienstiftung des Deutschen Volkes (Alman Akademik Burs Vakfı) tarafından desteklenmektedir.

1. hücre kültürü ve hücre-Klima orta üretim
<ol><li>Genellikle, ilgili hücre hattı için gerekli bireysel koşullar altında hücreleri yetiştirmek.</li>
	<li>Serum-serbest koşullarda veya orta içeren EV-tükenmiş fetal sığır serumu (FBS) 24-72 h için hücreleri yetiştirmek. Not: EV-depleted FBS kullanılırsa, sığır serumu türeyen EVs26ile kontaminasyonu önlemek için serumu verimli bir şekilde arındırma konusunda kanıtlanmış bir yöntem kullanın.</li>
	<li>Flasks orta toplayın. 300 x g 'de santrifüjler, hücreleri Pelet etmek için 10 dakika. Pelleted hücreleri rahatsız etmeden, hücre-Klima Orta (CCM) dikkatle toplayın. Tercihen, CCM 'yi doğrudan kullanın veya 4 °C ' de gece saklayın. Not: her zaman taze üretilen CCM kullanmak için tercih edilir. Daha uzun zaman dilimlerinin saklanması kaçınılamıyor, tüm ilgili parametreler MISEV2018 yönergelerine uygun olarak kaydedilmelidir ve elde edilen sonuçlarınpotansiyel önyargıları dikkate alınmalıdır.</li>
	<li>HUVECs için örnek protokol<ol>
<li>FBS ve diğer takviyeleri içeren EGM-2 orta 120 h için HUVEC hücreleri yetiştirmek.</li>
		<li>Ek takviyeleri ücretsiz EBM-2 bazal orta 48 h için HUVEC hücreleri yetiştirmek.</li>
		<li>Flsordan orta toplayın ve yukarıda belirtildiği gibi santrifüjleme adımını gerçekleştirin (adım 1,3). Genellikle, 100 mL orta bir EV-yalıtım için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CCM 'nin ultracentasması
<ol><li>Hemen önce (UC), 3.000 x g ve 4 °c ' de 15 dakika santrifüjler, hücre enkaz ve büyük agglomerates çıkarmak için santrifüj.</li>
	<li>Dikkatle UC tüpler için süpernatant aktarın. Sabit açılı rotor kullanıyorsanız, UC sonra EV Pelet alınmasını kolaylaştırmak için santrifüjdeki tüpler yönünü işaretleyin. Santrifüjlü 2 h at 120.000 x g, bir k-faktörü 259,4.</li>
	<li>UC sonra, özenle bir serolojik pipet kullanarak süpernatant atın, pelleted EVS rahatsızlık önlemek için. Not: Pelet görünmez olabilir.</li>
	<li>Ekleme 200 μL 0,2 μm-filtrelenmiş fosfat-tamponlu tuz (PBS) ilk tüp ve kullanmak PBS ve kalıntı süpernatant yukarı ve aşağı pipetleme tarafından Pelet pelletini. Elde edilen EV süspansiyonunu ilgili numunenin bir sonraki tüpüne aktarın ve Resuspension için kullanın. Yaklaşık 300-350 μL son hacminde numunenin tüm EVS yeniden pelletini bu şekilde devam edin.</li>
	<li>Resuspension sonra, nano madde izleme analizi (NTA) ile partiküllerin varlığını onaylayın. Aşağıdaki ayarlar gibi verilen EV türü için en iyi duruma getirilmiş ayarları kullanın (adım 2.5.1). Not: Gardiner ve al.27 ve vestad et al.28 ' ın kağıtları, EVS ölçümleri için parametrelerin optimizasyonu hakkında değerli bilgiler içerir.<ol>
<li>Aşağıda açıklanan sonuçları yeniden oluşturmak için, yeşil lazer ile donatılmış enstrümanları (örneğin, NanoSight LM14) kullanın. 1,0 ekran kazanç ve 13 kamera seviyesi ile 30 s üç video kaydedin. Analiz için 1,0 bir ekran kazanç ve 5 algılama eşik kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mümkünse Pelet hemen kullanın; Aksi takdirde, gece 4 °C ' de saklayın.</li>
</ol>3. EVs içine glucuronidase kapsülleme
<ol><li>Resuspended Pellet, eklemek Beta-glukuronidaz (10 mg/mL PBS) son konsantrasyon 1,5 mg/mL ve saponin (10 mg/mL H2O) son konsantrasyon 0,1 mg/ml. 3 s için vortekslenir tarafından iyi karıştırın.</li>
	<li>Tüp hafifçe Flicking ile inter, karıştırma ile Oda sıcaklığında 10 dk için inkübe. Kuluçlantıktan sonra, boyut-dışlama Kromatografi (SEC) ile doğrudan arındırın (Bölüm 5 ' e bakın). Not: bir kez çözülmüş glukuronidaz örnekleri refreeze etmeyin, donma nedeniyle enzim bozulması önlemek için.</li>
</ol>4. Liposome üretimi
<ol><li>EVs ile karşılaştırıldığında lipozomlar hazırlamak için, 1, 2-dimyristoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (dmpc) ve 1, 2-Dipalmitoyl-sn-glisero-3-FOSFATKOLIN (DPPC) 5 mm son konsantrasyonuna kloroform bir 2:3 molar rasyon çözülür. Yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) şişeleri 1 ml plakaya hazırlamak ve onları bir lipid film oluşturmak için bir gecede kuru izin. DIKKAT: Chloroform toksik ve kancerogenic olduğundan şüpheleniliyor. İşlerken uygun önlemler alın.</li>
	<li>1,5 mg/mL glukuronidaz içeren 1 mL PBS ile lipid-film rehydrate. 42 °C ' ye ısı ve 1 dak. Ekstruder montajını 42 °C ' ye ısıtın ve bir 200 Nm Polikarbonat membrandan lipid süspansiyonu 11x ekstrüze edilir. Doğrudan SEC tarafından arındırır (bkz. Bölüm 5).</li>
</ol>5. SEC tarafından arıtma
<ol><li>Aşağıdaki protokolü kullanarak SEC sütununu hazırlayın.<ol>
<li>Sadece taze arıtılmış su ve taze hazırlanmış tamponlar kullanın. Bir 0,2 μm membran filtresi ile tüm tamponları filtreleyin ve sütunda hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için onları Degas.</li>
		<li>Bir sec sütun hazırlanması için, agaroz jel filtrasyon tabanlı matris (örneğin, Sepharose CL-2B) veya başka bir sec orta protein kirleri ve aşırı enzim EVS ve lipozomlar ayırmak için uygun kullanın. İlk olarak, orta saklanır% 20 EtOH solüsyonu kaldırmak, sütunda hava kabarcık oluşumu önlemek için. Bu amaçla, SEC orta 3.000 x g 10 dakika Santrifüjü, EtOH kaldırmak ve gaz su ile değiştirin.</li>
		<li>Bir cam sütunu (10 mm iç çapı ile) SEC orta ile 15 mL işaretine doldurun. Not: birimler farklı ölçümlendirmelere sahip sütunlar için farklılık gösterecektir. Jel tamamen yerleşmek izin emin olun.</li>
		<li>Bir çalıştırmadan önce, sütunu en az iki sütun hacmine sahip PBS ile dengelenmiş olarak ayarlayın. Sütun saklamak için, önce su bir sütun hacmi ile yıkayın, en az iki sütun hacimleri tarafından takip 20% EtOH. Depodan sonra, ilk olarak PBS ile dengelenmiş önce bir sütun hacmi su ile sütun yıkayın.</li>
		<li>En fazla 400 μL 'ye kadar kullanın. 1 mL fraksiyonları toplayın. SEC sonra, ya saf EVs saklamak (Bölüm 7 bakın) veya bir glukuronidase tahlil onları konu (Bölüm 6 bakın).</li>
	</ol>
</li>
	<li>EVs ve lipozomların kontaminasyon proteinlerini ve ücretsiz glukuronidaz ayrılması onaylayın. Bu amaçla, toplanan fraksiyonlar partikül konsantrasyonlarını protein konsantrasyonu ve glukuronidaz aktivitesi ile ilişkilendirir.<ol>
<li>NTA tarafından partikül konsantrasyonunu değerlendir (bkz. 2,5)</li>
		<li>Protein içeriği bicinchoninik asit (BCA) tahlil veya başka bir uygun protein ölçüm tahlil tarafından değerlendirmek. Üreticinin protokolüne göre tahlil gerçekleştirin.</li>
		<li>Glukuronidase etkinliğini glucuronidase assay ile değerlendir (bkz. Bölüm 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, iletim elektron mikroskobu (TEM) ve Tarama elektron mikroskobu (SEM) ile EV morfolojisi değerlendirin.<ol>
<li>TEM örneklerinin hazırlanması için, bir TEM ızgarasına 10 μL EV süspansiyon ekleyin, 10 dakika boyunca inküye yapın ve ardından filtre kağıdı kullanarak aşırı sıvıyı uzaklaştırın. 10 μL% 4 paraformaldehit ile 10 dak için sabitleme ve herhangi bir fazlalıktan uzakta leke gerçekleştirin. 3x su ile yıkayın. 30 μL% 1 phosphor-Tungstic asit hidrat ile 20 s inkübasyon ile veziküller leke. Aşırı uzakta Blot sonra, bir gecede veziküller kuru. TEM ile görselleştirin. DIKKAT: Phospho-Tungstic asit son derece kostik; Böylece, cilt ve gözleri korumak.</li>
		<li>SEM için, daha önce hazırlanan TEM örneklerini karbon disklerine düzeltin ve 50 nm kalınlığında altın tabakaya sahip onları sputter. SEM tarafından görselleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. glukuronidaz tahlil
<ol><li>Parçacık numarası ve enzim aktivitesini ilişkilendirerek farklı numune ve depolama koşulları arasında bir karşılaştırmaya izin vermek için, ilk olarak NTA tarafından numunenin parçacık konsantrasyonunu ölçün (bkz. Adım 2,5).</li>
	<li>1 μL bileşik (10 mg/mL H2O) 199 ΜL PBS ekleyerek fluorcein di-β-D-glukuronid çalışma çözeltisi hazırlayın. 8,3 μg/mL 'Lik son bir konsantrasyon elde etmek için 125 μL 'yi saflaştırılmış EVs 'e eklemek için bu çözümün 25 μL değerini ekleyin. Numuneyi siyah 96-kuyu plakasına pipet. Ölçmek zaman noktası 0 h bir plaka okuyucu ile, kullanarak 480 uyarma olarak nm ve 516 emisyon dalga boyu olarak Nm.</li>
	<li>Plakayı sıkı bir şekilde (örn., PCR plakaları için kullanılan şeffaf plastik folyo ile) buharlaşmaya en aza indirmek ve 37 °C ' de 18 saat boyunca karanlıkta inkübasyon yapın. 6,2 adımda listelenen plaka okuyucu parametrelerini kullanarak floresan üretimini ölçün.</li>
</ol>7. EVs ve lipozomların depolanması
Not: tüm depolama amaçları Için, düşük bağlayıcı tüpler adsorpsiyon nedeniyle EV kaybı azaltmak için kullanılması tavsiye edilir.
<ol><li>Aşağıda verilen temsili sonuçları yeniden oluşturmak için bu bölümdeki parametreleri izleyin. 400 μL 'nin EV süspansiyonunu içeren örnekleri kullanın.<ol>
<li>4 °C veya-80 °C ' de saklayın veya aşağıda belirtilen adımlara geçin.</li>
		<li>EVs 'e lyophilize.<ol>
<li>Trehaloz Ekle (40 mg/ml H2O) son konsantrasyon kadar 4 mg/ml arıtılmış EVS için. Numuneleri-80 °C ' de en az 1 saat dondurur.</li>
			<li>Aşağıdaki parametreleri kullanarak örnekleri lyophilize. Ana kurutma için, raf sıcaklığını 15 °C ' ye ayarlayın ve 0,180 mbar 'a baskı yapın ve örnekleri 46 h için kurumaya bırakın. Son kurutma için, raf sıcaklığını 25 °c ' ye ayarlayın ve 0,0035 mbar 'a baskı yapın ve numuneleri 2 saat boyunca kurumaya bırakın. liyofilize numuneleri 4 °c ' de saklayın.</li>
			<li>Numuneleri yeniden nemlendirmek için H2O, başlangıç olarak ev süspansiyonu miktarına eşit (genellikle 400 μL) ekleyin. Rehydration için herhangi bir arabellek kullanmayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. depolama sonrası analiz
<ol><li>Enzim etkinliğini değerlendirmek için, önce depolama sırasında EVs sızdırılmış olabilir ücretsiz glukuronidaz, çıkarın. Bu, SEC (bkz. Adım 5) veya asimetrik akış alanı-akış fraksiyonasyonu (AF4) (bkz. Adım 8.1.2) tarafından gerçekleştirilen arıtma ek bir adım ile elde edin. Not: her iki yöntemin de EV örneğinin seyreltilmesine yol açmaları önerilir; Böylece, NTA miktarlandırma sınırının altına taşınmamak için depolama öncesinde yeterli EV konsantrasyonları kullanın. SANIYE veya AF4 nedeniyle parçacıkların bir 1:10 seyreltme bekliyoruz.<ol>
<li>SEC arıtma için yukarıda açıklanan protokolü izleyin (bkz. Bölüm 5).</li>
		<li>AF4 arıtma gerçekleştirin.<ol>
<li>350 μm spacer ve 30 kD molekül ağırlığı kesilmiş selüloz membranlı küçük bir kanal kullanarak cihazı ayarlayın. HPLC pompası ve AF4 kanalı arasında 0,1 μm gözenek boyutu filtresi yerleştirin. Hafif saçılma dedektörlerinde parçacık yükünü ve gürültüyü azaltmak için taze hazırlanmış 0,1 μm-filtrelenmiş PBS 'i mobil faz olarak kullanın.</li>
			<li>280 nm olarak ayarlanan bir UV dedektörü kullanarak proteinleri algılayın. Parçacıkları algılamak için, 658 nm 'ye kadar lazer seti ile multiangle ışık saçılma kullanın.</li>
			<li>Aşağıdaki Run yöntemini kullanın. 1 mL/dak netleme debisi ile 1 dakika ön odak; daha sonra 0,2 mL/dak hızında örnek 300 μL enjekte edin ve odak akışını 10 dakika tutun. Enjeksiyondan sonra, numuneyi 1 mL/dak 'da 2 mL/dk 'dan 0,1 mL/dk 'dan 8 dk. arası akımlı bir çapraz akış uygularken 10 dk. çapraz akış olmadan başka bir on dakika için elute. 12,5 dk sonra başlayan ve 27 dakika kadar devam 1 mL kesirler toplayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Yukarıda açıklandığı gibi glucuronidase tahlil gerçekleştirin (Bölüm 6 bakın).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Boyutu ve konsantrasyonu değerlendirmek için, yukarıda açıklandığı gibi NTA kullanın (bkz. Adım 2,5).</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, depolama sonrası EVs morfolojisi değerlendirmek için TEM ve SEM gerçekleştirin (bkz. 5,3).</li>
</ol>

<ol><li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).</li>
<li>Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+vesicles+for+drug+therapy+and+diagnostics%3A+Opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges.</a> Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).</li>
<li>Goes, A., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenic+and+Biomimetic+Carriers+as+Versatile+Transporters+To+Treat+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).</li>
<li>György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Applications+of+Extracellular+Vesicles%3A+Clinical+Promise+and+Open+Questions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).</li>
<li>Schulz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+bacteria-derived+vesicles+show+inherent+antimicrobial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity.</a> Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).</li>
<li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+extracellular+vesicles+from+breast+cancer+cells+activates+VEGF+receptors+and+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis.</a> Nature Communications. 8, 14450(2017).</li>
<li>Bewicke-Copley, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+released+following+heat+stress+induce+bystander+effect+in+unstressed+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746(2017).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+transfer+antigens+to+dendritic+cells+by+releasing+exosomes+containing+dead-cell-associated+antigens+partially+through+a+ceramide-dependent+pathway+to+enhance+CD4%28%2B%29+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses.</a> Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).</li>
<li>Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10, 356(2014).</li>
<li>Rajappa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+Astrocytic+Tumor+Progression+Potentiated+by+JAK-mediated+Recruitment+of+Myeloid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%3A+An+Official+Journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).</li>
<li>Umezu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+miR-135b+shed+from+hypoxic+multiple+myeloma+cells+enhances+angiogenesis+by+targeting+factor-inhibiting+HIF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1.</a> Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in coronary artery disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 14, 259(2017).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+HEK293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).</li>
<li>Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).</li>
<li>Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+things+come+in+small+packages%3A+Overcoming+challenges+to+harness+extracellular+vesicles+for+therapeutic+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery.</a> Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).</li>
<li>Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+of+Human+Extracellular+Vesicle-Based+Therapeutics+for+Clinical+Use%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190(2017).</li>
<li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+Storage+Stability+of+Extracellular+Vesicles+for+Therapeutic+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1(2017).</li>
<li>Lőrincz, ÁM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+on+physical+and+functional+properties+of+extracellular+vesicles+derived+from+neutrophilic+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465(2014).</li>
<li>Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+protect+glucuronidase+model+enzymes+during+freeze-drying%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12377(2018).</li>
<li>Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+exosomes+at+room+temperature+using+lyophilization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).</li>
<li>Kusuma, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+Protect+and+to+Preserve%3A+Novel+Preservation+Strategies+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).</li>
<li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li>
<li>Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+loading+into+extracellular+vesicles+significantly+improves+the+cellular+uptake+and+photodynamic+effect+of+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins.</a> Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671(2013).</li>
<li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis%3A+a+variation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087(2017).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162(2016).</li>
<li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">DLS and zeta potential - What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li>
<li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858(2014).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Patel, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cell+culture+parameters+on+production+and+vascularization+bioactivity+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%26+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles.</a> Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li>
<li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509(2015).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Bu yazıda, EVs 'in farklı depolama koşullarında istikrarını incelemek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Fonksiyonel bir okuma ve EVs fizikokimyasal parametrelerin değerlendirilmesi olarak kapsüllenmiş glukuronidaz kombinasyonu ile, protokol EVs ve farklı hücreden EVs karşılaştırılması basit bir depolama stabilitesi değerlendirilmesi için izin verir Satır. SEM ve TEM, tamamlayıcı yöntemler olarak tek parçacık düzeyinde EVs değişikliklerine ilişkin bir anlayış sağlar. Burada sunulan sonuçlar, EVs ve lipozomların bir kr...

EVs membran bağlı nanopartiküller neredeyse tüm hücre türleri tarafından üretilmektedir. Memeli hücreler için, EVS farklı üretim yolları1,2ile iki ana gruba ayrılabilir. Membran veziküller, yaklaşık 100-1000 Nm boyutunda bir boyutla, hücre zarından doğrudan tomurcuklanma tarafından üretilmektedir. Exosomes, ölçekli 30-200 Nm, daha sonra aynı anda birden fazla exosomes serbest bırakmak için hücre membranı ile sigorta endosomes içine içeri tomurcuklanan tarafından oluşturulan multiveziküler organları türetilmiştir. Bu veziküllerin ana fonksiyonu hücreler arasında bilgi taşımacılığında3. Bu amaçla RNA, DNA ve proteinler gibi kargolar aktif olarak onlara sıralanmaktadır. EVs, hem sağlık hem de hastalık durumunun etkileri ile hedefleri üzerinde çeşitli efektler iletebilir. Bir tarafta, onlar tedavi olarak gelişimi için onları uğurlu hedefler kılan doku rejenerasyon, antijen sunumu veya antibiyotik etkileri gibi olumlu etkileri Arabulmak4,5. Diğer tarafta, EVs tümör vaskülarizasyonu teşvik edebilir6, stres tepkiler7seyirci etkileri, ve otoimmün hastalıklarda rol oynayabilir8 ve inflamatuar hastalıklar9. Böylece, birçok patolojik etkinin daha iyi anlaşılması için önemli bir bileşen olabilirler. Ancak, manifold hastalıklarında değiştirilmiş EVS varlığı, kanser gibi10,11,12 ve kardiyovasküler bozukluklar13, ve kan ve idrar kolay erişilebilirlik onları ideal hale getirir biyolojik. Son olarak, onların iyi biyouyumluluk14 ve onların içsel hedefleme yeteneği EVS de ilaç teslim15için ilginç hale. Bu yazıda, hala az incelenmiş önemli bir özellik olan memeliler hücrelerinden elde edilen EVs 'nin depolama kararlılığının değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.
EVs 'nin klinik gelişimi için, tedavi edici etkileri, üretim, arıtma ve depolama17' nin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere16' nın üzerinde hala birçok engel vardır. Süre-80 ° c, EV depolama18için altın standart olarak yaygın olarak görülür, gerekli dondurucular pahalıdır ve üretim hasta için gerekli soğuk zincir korumak zor olabilir. Dahası, bazı raporlar, depolama-80 °c ' de hala en iyi şekilde EVS koruymaz ve ev işlevselliği19,20bir kayıp indükler gösterir. Freeze-kurutma21,22 veya sprey-kurutma23gibi diğer yöntemler, EVS dondurulmuş depolama için potansiyel alternatifler olarak önerilmiştir.
Depolama stabilitesini değerlendirmesinin en uygun yolu, EVs 'i fonksiyonel testlerle veya belirli bir işaretçinin değerlendirilmesiyle, örneğin antibakteriyel aktivitesi19' a test etmek olacaktır. Bu veziküller istenen etkisi bilindiğinde ve bir ayrı grup EVs incelenecek olduğunda mümkündür. Farklı hücre kaynaklarından EVs karşılaştırıldığında (örneğin, ilaç Kapsülleme için) veya bilinen işlevsel bir okuma yoksa, artık değişiklikleri doğrudan bir şekilde depolama nedeniyle değerlendirmek mümkün değildir.
Öte yandan, sadece kendi fizikokimyasal parametrelerinde değişiklikleri değerlendirmek, boyut gibi, parçacık kurtarma, ve protein konsantrasyonu, her zaman değişiklikler tahmin etmez EV aktivite, son patent gösterildiği gibi20.
Burada, EVS 'in kargo için bir vekil olarak bir kapsüllü Beta-glukuronidaz enziminin aktivitesi ile birlikte fizikokimyasal parametrelerini değerlendirerek, ailelerinin depolama kararlılığını ölçmek için kolayca uygulanabilir bir protokol sağlıyoruz. Enzim yükleme saponin inkübasyon tarafından yapılır, farklı kaynaklardan EVS ile kurulan hafif bir yöntem21,24,25. Saponin, EV membranında enzim alımı sağlayan geçici gözenekleri oluşturur. Enzimlerin etkinliğini kaybetmek eğilimli olduğu gibi olumsuz depolama koşullarına tabi, onlar EVs fonksiyonel kargoların korunması değerlendirilmesi için ideal bir vekil vardır.
Bu protokol uygulamasının insan mezenkimal kök hücrelerinden (MSCS), insan göbek ven endotel hücrelerinden (huvecs) ve insan adenokarsinoma alveolar epitelyal hücrelerden (A549) elde edilmesi, gerçekten de büyük farklılıklar ortaya koyduğunu göstermiştir EV kaynak21seçerken dikkate alınmalıdır farklı hücre hatları arasında depolama stabilitesi.

<table><tbody><tr><td>1,2 dimyristoyl-sn glisero-3-fosfo-kolin (DMPC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P2663-25MG</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfo-kolin (DPPC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4329-25MG</td><td></td></tr><tr><td>225 cm ve sup2; hücre kültürü şişeleri</td><td>Corning</td><td>431082</td><td>25 ml ortam</td></tr><tr><td>30 kDa rejenere selüloz membran</td> ile kullanılır <td>Wyatt Technology Europe</td><td>1854</td><td></td></tr><tr><td>350 ve mikro; m ara parçası</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otomatik fraksiyon toplayıcı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-glukuronidaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7646-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher scientific</td><td>C/4966/17</td><td></td></tr><tr><td>Sütunlu fırın</td><td>Hitachi Yüksek Teknolojiler Avrupa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehaloz dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531-10G</td><td></td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II, Çok açılı ışık saçılma dedektörü</td><td>&nbsp; Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durapore Membran filtre, PVDF,&nbsp; 0,1&nbsp; &mikro; m, 47&nbsp; mm</td><td>Merck</td><td>VVLP04700</td><td>AF4</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td> için tamponların hazırlanmasında kullanılır.<td>CC-3156</td><td>Endotel Hücre Büyümesi bazal ortam, HUVEC hücrelerinin serumsuz kültürü için kullanılır</td></tr><tr><td>Eclipse dualtec</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3162</td><td>Endotel Hücre Büyüme ortamı, HUVEC hücrelerinin normal kültürü için kullanılır</td></tr><tr><td>ELISA Plaka Kapatıcılar</td><td>R& </td><td>Glukuronidaz tahlili için 96 oyuklu plakaların sızdırmazlığı için kullanılan</td>D Systems <td>DY992</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher scientific</td><td>E / 0665DF / 17</td><td></td></tr><tr><td>Tutucu / Isıtma Bloklu Ekstruder Seti</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Filtre desteği</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014-1EA</td><td>lipozom hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>Floresein di-&beta; -D-glukoronid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F2915</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS-tabletler+CA10:F36</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Universal 320 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td> 300 g Hettich Rotina 420 <td>R'de hücrelerin peletlenmesi için kullanılır</td></tr><tr><td>Andreas</td><td>Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>3000 g HUVEC hücrelerinde daha büyük döküntüleri peletlemek için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>Lonza Verviers, Öğr.</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>Kimble&nbsp; FlexColumn 1X30CM</td><td>Kimble</td><td>420401-1030</td><td></td></tr><tr><td>Liyofilizatör ALPHA 2-4 LSC</td><td>Mesih Mikrosantrifüj</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tüpleri, Polipropilen</td><td>VWR uluslararası</td><td>525-0255</td><td>tüm EV işlemleri için kullanılan tüplerin, partikül geri kazanımı konusunda diğer tedarikçilerin karşılaştırılabilir ürünlerinden daha uygun olduğu bulundu</td></tr><tr><td>Nanosight LM14 yeşil lazer ile donatılmış</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosight yazılım sürümü 3.1</td><td>Malvern Pananalitik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nükleopore 200 nm iz-aşındırma polikarbonat membranlar</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>110406</td><td>lipozom hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>PEEK Satır içi filtre tutucu</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfotungstik asit hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüjleme için polikarbonat şişeler</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>QuantiPro BCA Test Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QPBCA-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Taramalı elektron mikroskobu Zeiss EVO HD 15</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sepharose Cl-2b</td><td>GE Sağlık</td><td>17014001</td><td></td></tr><tr><td>SEM bakır karbon filmli ızgaralar</td><td>Plano</td><td>S160-4</td><td></td></tr><tr><td>Küçük AF4 kanalı</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sputter-coater Q150R ES</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmisyon elektron mikroskobu JEOL JEM 2011</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tip 45 Ti ultrasantrifüj rotoru</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex otomatik numune alma cihazı</td><td>Thermo Fisher Scientific Ultimate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3000 Dionex izokratik pompa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex online vakumlu gaz giderici</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj OptimaTM L-90 K</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV dedektörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 ve mikro; m gözenek boyutu karışık selüloz filtre</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>10401712</td><td>EV'lerde ve SEC'de kullanılan tüm tamponların filtrasyonu için kullanılır</td></tr></tbody></table>

ekstrasellüler veziküllerin depolama istikrarı değerlendirilmesi

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Ekstrelüler veziküller (EVs), ilaç, uyuşturucu taşıyıcıları ve Biyomarkörler olarak kullanılmak üzere mevcut araştırmalarda umut verici hedeflerdir. Onların klinik gelişimi için, sadece onların ilaç aktivitesi önemli değil, aynı zamanda üretim değerlendirilmesi gerekir. Bu bağlamda araştırma, EVs yalıtımına, onların karakterizasyonu ve depolarına odaklanır. Mevcut el yazısı, genetik manipülasyon veya spesifik fonksiyonel etkileri olmadan, EVs üzerinde farklı depolama koşullarının etkisini değerlendirmek için bir facile prosedürü sağlamayı amaçlamaktadır. Bu mümkün hızlı bir şekilde belirli bir depolama koşulu altında EVs istikrarı bir ilk izlenim almak için yapar, ve farklı hücre kaynaklarından türetilen EVs kolayca karşılaştırılabilir. Kararlılık ölçümü, EVs (boyut, parçacık konsantrasyonu ve morfoloji) ve onların kargo aktivitesinin korunması fizikokimyasal parametrelerine dayanır. İkincisi, EVS içine enzim Beta-glukuronidaz saponin-aracılı kapsülleme tarafından değerlendirilir. Glukuronidaz bir vekil olarak davranır ve bir floresan muhabir molekül bölünmesini ile kolay bir kantifikasyon sağlar. Mevcut protokol, klinik uygulamaya doğru EV araştırmalarını ilerletmek için EV özelliklerini en iyi şekilde korumak için depolama koşulları arayışında araştırmacılar için bir araç olabilir.

Şekil 1 , huvecs 'den Izole edilen EVS 'nin depolama özelliklerini görüntüler. EVs UC tarafından izole edildi, glukuronidaz kapsüllenmiş, ve SEC sonra, saflaştırılmış EVs NTA tarafından Fizikokimyasal özellikleri için değerlendirildi. Veziküllerin bir örneği daha sonra AF4 arıtılmasına maruz kalmıştır ve glukuronidaz aktivitesi ölçülmüştür.
Veziküller daha sonra 4 °C veya-80 °C ' de 7 d ve likofilize formda 4 °C ' de, ikinci durumda ise% 4 trehalose eklenmesiyle saklanır. Depo...

Burada, hücre tarafından üretilen doğal Nano opartiküllerden oluşan bir grup olan ekstrüllüler veziküller için depolama kararlılığını değerlendirmek üzere kolayca uygulanabilir bir protokol sunuyoruz. Veziküller bir model enzim olarak glukuronidaz ile yüklenir ve farklı koşullarda saklanır. Depodan sonra, fizikokimyasal parametreleri ve kapsüllenmiş enzimin aktivitesi değerlendirilir.

Ekstrasellüler veziküllerin depolama Istikrarı değerlendirilmesi

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Ekstra hücresel veziküllerin depolama stabilitesi, prospektif terapötik kullanımları için önemli bir parametredir. Protokolümüz, depolamanın vezikülleri nasıl etkilediğini değerlendirmek için kolayca uygulanabilir bir araç sağlar. Tekniğimizin en büyük avantajı, glukuronidaz'ı eksojen bir belirteç olarak tanıtarak, farklı ana hücrelerden elde edilen hücre dışı veziküllerin depolanabilirlik açısından kolayca karşılaştırılmasıdır.Asimetrik akış alanı akış fraksiyonu veya AF4, çok hassas bileşikler için boyut dışlama kromatografi saflaştırma hafif bir alternatiftir. Çünkü bileşikler kanalda daha az stresle karşılaşır. Glukuronidaz hassas bir enzim olduğu için, mevcut ların kalitesi kapsamlı planlama ve arınma ve analiz için arka arkaya adımların yürütülmesinden yararlanır.Bu hücreler için standart koşullara göre ilgi hücre hattı kültürlendikten sonra, serum ücretsiz veya ekstra hücresel vezikül tükenmiş orta ile supernatant değiştirin ve ek bir 24 ila 72 saat için hücre kültürü kuluçka hücreleri iade. Kuluçka sonunda, her şişeden süper natant toplamak ve hücreleri tortu örnekleri santrifüj. Peletrahatsız etmeden hücre klimalı orta dikkatle toplayın.Ve hücre enkaz ve büyük agregalar ka

evaluation-of-the-storage-stability-of-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu karaciğerden doku ekstrasellüler (EVs) izole etmek için bir protokoldür. Protokol, kollajenaz perfüzyonunu içeren iki aşamalı bir süreci ve ardından karaciğer dokusu EVs'lerini izole etmek için diferansiyel ultrasantrifüji tanımlıyor.

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Protokol hücre kültür supernatants ile kullanılmak üzere tasarlanmış küçük hücre dışı veziküller (EV) üzerinde yüzey epitopları algılamak için tekrarlanabilir yöntemi açıklanır. Yüzey antijeni CD9, tanıyan antikorlar ile CD63 ve CD81 birleştiğinde boncuk kullanarak belirli EV immunoprecipitation kullanır. Yöntem aşağı akım akış sitometresi analizi için optimize edilmiştir.

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Bu rapor, mikroglia veya kan makrofajlarından ekstrasellüler vezikül (EV) izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Mikroglia kaynaklı EV'ler nötral büyümenin düzenleyicisi olarak değerlendirilirken, c6 glioma hücre invazyonunun kontrolünde in vitro tahlillerde kan makrofajlı eV'ler incelendi. Amaç, belirli mikroortamlarda bağışıklık arabulucusu olarak bu EV fonksiyonlarını daha iyi anlamaktır.

İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Çevresi Üzerindeki Fonksiyonel Etkisinin İncelenmesi

Burada, osteoartrit için model olarak kullanılan kıkırdak eksplantlarında göçlerini ve alımlarını izlemek için trombositten türetilmiş hücre dışı veziklikleri etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Kıkırdak Eksplantlarında Göç ve Alımı İzlemek için Hücre Dışı Veziküllerin Etiketlenmesi

Mevcut protokol, siyanobakteriyel kültürlerden hücre dışı veziküllerin izolasyonu, konsantrasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı açıklamalar sunmaktadır. Vezikülleri farklı ölçeklerdeki kültürlerden arındırmaya yönelik yaklaşımlar, metodolojiler arasındaki ödünleşimler ve saha örnekleriyle çalışmak için dikkat edilmesi gerekenler de tartışılmaktadır.

Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu

Bu yazıda, kanserli ürotelyal hücrelerden kaynaklanan hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonu ve donma-kırılması için bir protokol sunulmaktadır. Dondurarak kırılma tekniği, EV'lerin çapını ve şeklini ve benzersiz bir özellik olarak EV membranlarının iç organizasyonunu ortaya çıkardı. Bunlar, EV'lerin alıcı membranlarla nasıl etkileşime girdiğini anlamada büyük önem taşımaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Analizi için Donma-Kırık Elektron Mikroskobu

Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Bu protokol, mezenkimal stromal hücreler tarafından salınan hücre dışı veziküllerin (EV'ler) sıralanmasının ayrıntılı bir tanımını sağlar. Özellikle, cihaz ayarına ve sıralama koşullarının optimizasyonuna odaklanır. Amaç, özelliklerini koruyarak hücre dışı vezikülleri sıralamaktır.

Hücre dışı vezikül izolasyonu için başarılı bir sıralama ayarlama

Burada, Echinococcus granulosus'tan in vitro kültür koşullarını, izolasyonu ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) artan oluşumunu açıklıyoruz. Küçük EV'ler, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin tutulumu ve fenotipik modülasyonları, konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak incelendi.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Burada, insan deneklerin gözyaşı ve tükürük gibi biyolojik sıvılarından toplanan hücre dışı veziküller (EV'ler) için karakterizasyon yöntemini gösteriyoruz. Bu yöntemde kullanılan tarayıcı, numunenin 1 μL'sinden EV'lerin fenotipini, boyutunu ve toplam partikül sayısını tespit etme yeteneğine sahiptir.

Biyolojik Sıvılardan Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu

Öğrenin ekstrasellüler veziküllerin depolama istikrarını AF4 ile değerlendirme yöntemini. Glukuronidaz kullanarak farklı hücre kaynaklı veziküllerin karşılaştırmalı saklanabilirliğini analiz edin.

Ekstrasellüler veziküllerin depolama Istikrarı değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet