Ince katman Kromatografi takip Escherichia coli (p) ppGpp çoklu In vivo ölçümleri Için mikrotiter bulaşık Radiolabeling kullanma

Bu yöntem, farklı büyüme koşulları ve stres durumları içinde küresel regülatör ppGpp düzeylerini ölçer. PpGpp gram pozitif ve negatif bakterilerde yanı sıra kloroplast bulunabilir. PpGpp saniyeler içinde hızlı bir başlangıç vardır, stres üretildikten sonra hızlı bir ikinci ilişkiye yol açan.

Aynı anda, 30 saniyeye kadar kısa bir yarı ömrü vardır. Bu nedenle, stresli geçişler de dahil olmak üzere 10 saniyeile saat arasında değişebilen zaman aralıklarında birçok kültürü izlemek gerekir. Ayrıca mikrotiter yemeklerde bakteri kültürlerini radyolabel olarak birden fazla teknik ve biyolojik kopyaya izin veren yüksek üretim örneklemelerini kolaylaştırır.

Radyoaktif malzemelerle çalışırken uygun güvenlik önlemlerine uyun. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde özetlenen tüm ortamları hazırlayın. Üç milimolar sodyum fosfat ile MOPS medyada bir gecede kültürleri büyümek.

MOPS medya 550 mikrolitre ekleyin, 24 kuyu plaka kuyularına 0,2 mikromolar sodyum fosfat taşıyıcı ve her bakteriyel inoculum 30 mikrolitre contining. Bu 0.1 bir OD600 ile bir başlangıç inoculum neden olacaktır. Bir sterilite kontrolü gibi bir taze medya ekleyin.

37 santigrat derece bir sallayarak kuvöz de plaka yerleştirin, 30 dakika boyunca 900 RPM sallayarak. Büyüme aynı koşullar altında kuluçka sırasında p32 eksik medya paralel bir çoğaltma plaka ile bir plaka okuyucu kullanılarak izlenebilir. Daha sonra, plaka her kuyuya p32 orthphosfat 100 mikrocuries ekleyin.

Dış etiketbüyük ölçüde hücreler arası nükleotit havuzları ile dengelemek için izin vermek için bir ila iki iki katına sallayarak bir kuluçka kültürleri büyütün. Uygun görselleştirme için, aktif malzeme hiçbiri bu videoda kullanılmadı. Gerçek bir deneyde, uygun korumanın yanı sıra bir etüt ölçerle kontaminasyon için sürekli izleme gereklidir.

İlk olarak, stres tür için uygun bir yöntem kullanarak stres neden okudu. Daha sonra, her etiketli hücre örneğinden 20 mikrolitreyi ayrı bir 0,2 mililitrelik PCR tüpüne ekleyin, 20 mikrolitre buz gibi soğuk altı azılı formik asit içeren. Örnekleri hemen kuru buzüzerine yerleştirin.

Dondurma ve eritme üç döngü leri ile hücresel ekstraksiyon verimliliğini artırın. PEI selüloz ince tabaka kromatogramları tespit hemen önce, pelet hücre enkaz maksimum hızda bir dakika için örnekleri santrifüj. İlk olarak, 20 tarafından 20 santimetre PEI selüloz TLC plaka yola.

Üst beş santimetre kaldırmak için makas kullanın. Ve kenardan bir santimetre uzaklıktaki bir başlangıç çizgisini işaretlemek için yumuşak bir kalem kullanın. PEI yüzeyine her numuneden beş mikrolitrelik damlatın uygulayın.

Nokta kurumadan önce, plakayı 1,5 molar monopotasyum fosfat tabakası içeren ve başlangıç numunesi noktasına değmeyecek kadar sığ bir tanka aktarın. Tankı hava geçirmez bir contayla kapatın ve 15 santimetre kesilmiş levhanın üstüne sıvı tırmanışı bekleyin. Bundan sonra, tam gelişmiş kromatogram çıkarın ve oda sıcaklığında kuru.

Serbest P32 içeren kromatogramın üst kısmını radyoaktif atıklara kesin ve atın. Bir gecede audioradiographic filmleri ortaya çıkarmak için bir fosfor ekran kullanın. Ertesi gün, filmi geliştirin ve fosforun yeşil sinyalini yakalamak ve quantitate etmek için bir fosforimager kullanın.

Ardından, radyoaktif noktaları quantitate için ImageJ yazılımı kullanın. PpGpp birikimine izin vermek için yeterli zaman için stres veya açlık provoke sonra, stresi tersine çevirmek için uygun bir yöntem kullanın. İki dakikaya kadar her 20 ila 30 saniyede bir numune alın ve örnekleri daha önce açıklandığı gibi işleyin.

TLC geliştirildikten ve ppGpp düzeyleri zaman dilimi sırasında elde edildikten sonra, semilogathmic arsa ve zaman kalıntı ppGpp içeriği arsa. Bu çalışmada, ILV hariç tüm amino asitleri içeren MOPS'larda yetişen hücreler P32 ile etiketlenmiştir. Bir kez etiketli, L valine izolösin açlık üretmek için eklenir.

Beş dakika sonra, guanozin tetra ve pentaphosfat düzeylerinde iki buçuk eski bir artış meydana geldi. P32 kaynağında ortopedik olmayan olası bileşikleri tespit etmek için hücre içermeyen etiketli numunenin negatif kontrolü kullanılır. Izolösin açlığı tersine çevirmek kloramfenikol ile elde edilebilir, protein sentezinin bir inhibitörü, hangi yüklü izolösin tRNA tüketimini azaltır, ve sırayla, şarj edilmemiş tRNA yüklü yüksek oranlarda geri.

Güçlü rela aracılı ppGpp synthetase aktivasyonu kaldırılır, hangi ppGpp bozulma bir ölçü kalıntı sentezi ile tedirgin sağlar. Bu durumda ppGpp yaklaşık 64 saniyelik yarı ömrü ile çürür. Bu hücrelerin herhangi bir stres veya açlık indüklemeden önce tek tip etiketleme elde etmek için nesiller bir çift için büyümeye izin önemlidir.

PPGpp bakteriler arasında yaygın olarak yayıldığı için bu yöntem diğer organizmalara uygulanabilir. TLC geliştirme yönteminin değiştirilmesi ppApp gibi tüm düzenleyici nükleotitlerin doğru şekilde ayrılmasına olanak sağlayabilir. P52 daha iyi bir yayıcı izotop, bu yüzden uygun koruma kullanmak ve düzgün herhangi bir kalıntı atmak için önemlidir.