Name: In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Öğrenin, farelerde primer fibroblastlarla in vitro scratch assay ve dorsal skinfold chamber kullanarak yara iyileşmesini ve hücre göçünü değerlendirme yöntemlerini. Bu protokoller farmakolojik etkileri incelemek için güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Petra Weissgerber'e ve Tıp Fakültesi'nin SPF hayvan tesisinin Transgen Birimi'ne (SFB 894'ün P2 projesi) ve Homburg'daki Saarland Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik ve Deneysel Cerrahi Enstitüsü'ndeki hayvan tesisine teşekkür ederiz. Dr. Andreas Beck'e el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, Proje A3 a.B. ve V.F. tarafından finanse edilmiştir.

Tüm deneysel prosedürler etik düzenlemelere ve Saarland ve Saarland Üniversitesi hayvan refahı komitelerine uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi.
1 Birincil hücre kültürü ve siRNA transfeksiyonu
NOT: Açıklanan yöntemde primer fibroblastlar kullanılır. Bu hücreler yara iyileşmesi ve doku remodeling önemli bir rol oynamaktadır11. Bu deneyde, yüksek gerilim kapılı kalsiyum kanalları12 Cavβ3 alt birimi kodlama Cacnb3 geni aşağı düzenlenmiş, böylece in vitro hücre göçü ve in vivo cilt yara onarım rolünü gösteren4.
<ol><li>SiRNA'nın hazırlanması: SiRNA'ları yeniden oluşturmadan önce, içeriğin en altta olduğundan emin olmak için tüpleri kısaca santrifüj edin. Üretici tarafından 20 μM konsantrasyonda sağlanan 100 μL RNase içermeyen tampon (100 mM potasyum asetat, 30 mM HEPES, pH 7.5) siRNA'ları yeniden oluşturun. Bu siRNA bir stok çözümdür.</li>
	<li>Aliquot bu stok çözeltisi tüp başına 10 μL (20 μM konsantrasyon) ve kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Ultra ince kalıcı bir işaretleyici kullanarak, her zaman aynı kazı kazan bölgesini belirleyebilmek ve kapanmasını takip edebilmek için her kuyunun alt kısmında yatay bir çizgi bulunan 6 kuyulu bir plaka işaretleyin. NOT: Hücre tek katmanında 200 μL pipet ucu kullanılarak tutarlı, tekrarlanabilir ve dikey bir çizik uygulamak için yeterli alan ve esneklik sağlamak için yeterince büyük oldukları ndan bu titrede 6 kuyulu kültür plakaları kullanılmıştır. Sınırlı sayıda hücre varsa, alternatif ve muhtemelen uygun maliyetli bir yol 12 veya 24-iyi kültür plakaları kullanmak olacaktır.</li>
	<li>Plaka primer fibroblastlar, yabani tip ve β3-eksik fareler izole4, 5 x 105 hücre / iyi yoğunluğunda 6-iyi bir plaka içinde 2 mL Dulbecco modifiye Eagle's orta varlığında (DMEM) 10% fetal sığır serumu ile desteklenmektedir (FCS). NOT: 6 kuyulu kültür plakası ve birincil fare fibroblastları için kuyu başına 5 x 105 hücre oluşturulmuştur. 12 veya 24 kuyulu hücre kültür plakaları veya boyutu farklı olabilecek diğer hücre tipleri kullanılarak testler gerekebilir. Hücreler biyolojik güvenlik dolapları sınıf II gibi steril bir ortamda ele alınmalıdır.</li>
	<li>6 kuyulu plakayı hücre tipi, genotip ve tarihle etiketlayın.</li>
	<li>6 kuyulu plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine taşıyın ve hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 24 saat boyunca koruyun.</li>
	<li>Ertesi gün, kuvözden tabağı çıkarın, hücre kültürünü kuyudan çıkarın, atın ve kuyunun duvarına dikkatlice ekleyerek 2,25 mL taze kültür ortamı ile değiştirin.</li>
	<li>SiRNA'larla fibroblastları transfect olarak, üretici nin önerdiği gibi lipid bazlı transfeksiyon reaktifi kullanın.</li>
	<li>Her transfeksiyon için iki mikrosantrifüj tüp etiket. İlkinde transfeksiyon reaktifinin 9 μL'sini ekleyin ve 150°L azaltılmış serum ortamı ile seyreltin. İkinci tüpe 1,5 μL siRNA(Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 veya negatif kontrol olarak çırpılmış siRNA) ekleyin ve 150°L azaltılmış serum ortamı ile seyreltin.</li>
	<li>Seyreltilmiş siRNA'yı seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ve girdap içeren tüpe 2 s. 21 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Etiket kuyuları veya Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 veya şifreli siRNA ile. Hücrelere siRNA-transfeksiyon reaktif karışımının 250 μL'sini damla ile ekleyin.</li>
	<li>6 kuyulu kültür plakasını kuvöze geri yerleştirin ve hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 72 saat tutun.</li>
	<li>Cacnb3 gen susturma etkinliğini kontrol etmek için, transfected hücreleri toplamak ve daha önce açıklandığı gibi immünoblot analizi yapmak4.</li>
</ol>2. In vitro yara iyileşmesi tsay (çizik göç tsay)
<ol><li>Hücre kültür plakasını kuvözden alın ve 10x hedefini kullanarak mikroskop altındaki hücreleri inceleyin. Sadece 0 biraraya geldiklerinde çizik tetkikiyle başlayın. NOT: Doğruluk ve tekrarlanabilirlik için , 0 birleşim, sıfırdan geçiş tetkikini başlatmak için zorunlu bir faktördür. Bu nedenle, kültür kuyularına aynı sayıda hücre tohumlamak, her kuyuyu biraraya gelmek için incelemek ve çiziyi aynı zaman noktasında (0. gün birleşimi) uygulamak önemlidir. Hücreler 0 birleştiğinde daha uzun süre beklemek farklı tepkileri çağrıştırabilir.</li>
	<li>Hücre 0 birleştiğinde, kültür ortamını kuyudan çıkarın ve atın.</li>
	<li>Kuyunun ortasındaki enakıcı hücre monokatmanı boyunca, kuyunun alt kısmında işaretlenmiş yatay çizgiye el ile dikey bir çizik oluşturmak için bir pipet ucu (200°L) kullanın.</li>
	<li>Hasarlı hücrelerden, gevşek hücrelerden ve kazınmış alandan çıkan faktörleri gidermek için her kuyuyu 2 mL fosfat tamponlu salin (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4,8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4) ile iki kez durun. Hücre kültüründen hücreleri ayırmaktan kaçınmak için kuyunun duvarına dikkatlice 2 mL PBS ekleyin.</li>
	<li>Her kuyuya serum veya %1 serum içeren 2 mL hücre kültürü ortamı ekleyin. NOT: Gözlenen etkinin hücre çoğalması ve göçü nden veya sadece hücre göçünden kaynaklandığını doğrulamak için serum ve %1 serumun altında çizik tahtının kullanılması önerilir.</li>
	<li>Plakayı mikroskop aşamasına taşıyın ve ışık mikroskobu kullanarak 10 x büyütmede (t=0h) çizildikten hemen sonra hücresiz alanın (kuyu başına iki alan) parlak alan görüntülerini yakalayın. Her zaman çizilmeye ait aynı bölgeyi görüntülemek için, adım (1.3) olarak hazırlanan yatay çizgiyi kullanın ve bu çizginin üzerinde bir görüntü ve bu çizginin altında bir görüntü alın. Görüntüleri TIFF veya JPEG olarak kaydedin.</li>
	<li>Mikroskop evresi hücre büyüme durumunu korumadığından, plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri taşıyın ve hücreleri 37 °C ve %5 CO2'detutun.</li>
	<li>6, 10 ve 30 saat sonra plakayı tekrar mikroskop aşamasına taşıyın ve 2.6 adımda açıklandığı gibi görüntüleri yakalayın. NOT: Bu zaman noktaları tanımlanan prosedür ve primer fibroblastlar için oluşturulmuştur. İlk pilot deney sırasında, daha fazla zaman noktaları ne kadar hızlı fibroblastlar boşluğu yeniden görmek için test edildi. 0, 6, 10 ve 30 saat makul başlangıç noktaları olmasına rağmen, araştırmacılar optimize etmeli ve her uygulama ve her hücre türü için uygun zaman noktaları kurmak. Daha doğru bir alternatif, eğer varsa, zaman atlamalı mikroskopi kullanmak olacaktır.</li>
	<li>ImageJ13kullanarak, ilk hücreserbest alanı (0) ölçmek ve 6, 10 ve 30 saat sonra kalan alan (Şekil 1). Geçiş hücreleri tarafından yeniden doldurulan çizilme alanı yüzdesi, ilk çizilme alanına göre hesaplanır.</li>
</ol>3. Çizilme alanının analizi
<ol><li>Açık ImageJ yazılımı13.</li>
	<li>Görüntüyü ImageJ menü çubuğuna bırakarak ilk resmi JPEG (örn. 24 bit RGB görüntüleri 1360x1024) olarak yükleyin.</li>
	<li>Serbest seçim düğmesini seçin ve hücresiz alanı işaretleyin</li>
	<li>Analiz et'e tıklayın ve Ölçü'nüseçin. Sonuçların bulunduğu bir pencere, alan değerini içeren görünür.</li>
	<li>Bu değeri bir analiz elektronik tablosuna aktarın.</li>
	<li>Her görüntü için 0 saat arası 3,2-3,5 adımlarını tekrarlayın ve bir sonraki zaman için 6, 10 ve 30 saat için yeniden başlayın.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak her çizik için 6, 10 ve 30 saat sonra geçirilen hücreler tarafından yeniden doldurulan çizilme alanıyüzdesini hesaplayın: <img alt="Hücre migrasyon analizi için çizik tahlil denklemi. Formül: hücre yeniden popülasyon yüzdesi." src="/files/ftp_upload/59608/59608eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> a = ilk çizik hücre serbest alanı, b = hücre serbest alan sonra 6 saat</li>
	<li>6 saat sonra geçiş hücreleri tarafından yeniden doldurulan çizilme alanı yüzdesi için ortalamanın (S.E.M.) ortalamasını ve standart hatasını hesaplayın.</li>
</ol>4. In vivo cilt yara iyileşme tsay
NOT: Bu çalışmada C57BL/6 yabani tip erkekler (22-26 g vücut ağırlığına sahip 8-12 haftalık) ve Cavβ3-eksik fareler kontrol olarak kullanılmaktadır.
<ol><li>Deneye başlamadan bir gün önce, skinfold odası nın hazırlanmasında kullanılacak tüm cerrahi aletler, vidalar, somunlar ve titanyum çerçeveler otoklav. NOT: Titanyum çerçeve iki simetrik tamamlayıcı yarımdan oluşur ve yaranın uygulanacağı ve ardından mikroskopinin yapılacağı dairesel bir gözlem penceresi vardır (bkz. Şekil 2a).</li>
	<li>Ketamin (75 mg/kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (25 mg/kg vücut ağırlığı) karışımını içeren 0,1 mL salin/10 g vücut ağırlığı enjeksiyonu ile yabani tip veya β3-eksik fare (22-26 g vücut ağırlığı) anestezi. Bir parmak sıkışmayanıt eksikliği ile anestezi derinliğini kontrol edin. NOT: Bu enjeksiyon yaklaşık 30 dk cerrahi anestezi verir ve anestezi derinliği fare refleksleri kontrol edilerek, cerrahi işlem ile kontrol edilmelidir.</li>
	<li>Gözlerde kuruluk veya hasar görmesini önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın ve gerekirse uygulamayı tekrarlayın.</li>
	<li>Fare dorsumunu dikkatlice tıraş edin, elektrikli tıraş makinesi ni kullanarak kalan tüyleri çıkarmak için traş edilen alana bir depilasyon kremi uygulamayı takip edin. Fare derisine zarar vermemeye dikkat edin. Tamamen tüm saç kaldırmak için yaklaşık 10 dakika için depilation krem bırakın.</li>
	<li>Simetrik titanyum oda çerçevesinin bir parçasını alarak titanyum haznesini hazırlayın ve bir tarafta ki somunlarla bağlantı vidalarını düzeltin. Bu fındık ciltte kan damarlarının sıkıştırma önlemek için odanın iki simetrik parçaları arasında 400-500 μm tutmak için bir spacer olarak hizmet verecek.</li>
	<li>Kremi farenin arkasından çıkarın ve tüysüz bölgeyi ılık (35-37 °C) musluk suyuyla temizleyin.</li>
	<li>Ameliyat yapılacak yerin temiz, sıcak (37 °C) ve nemli olduğundan emin olun.</li>
	<li>Farenin tüysüz bölgesini deri dezenfektanı ile dezenfekte edin. Bir ışık kaynağının önünde farenin arka derisinin bir kat ını alın ve titanyum odasının yerleştirileceği derinin çift tabakasının orta çizgisini yerleştirin. Bundan sonra, bir polipropilen sütür kranially ve caudally ile skinfold düzeltmek ve fare katlanmış cilt kaldırmak için metal bir raf üzerinde dikiş diğer tarafını sıkın. Farenin rahatça oturmasını sağlamak için rafın yüksekliğini ayarlayın.</li>
	<li>Titanyum çerçevenin iki simetrik yarısı arasında katlanmış sırt derisi tabakası sandviç bir şekilde farenin arka deri kıvrım içine titanyum oda implant. Titanyum çerçevenin ilk yarısını, üstün kenarına, dorsal deri kıvrımının arkasına polipropilen dikişlerle takın. NOT: Titanyum çerçeveüzerinde, üstün kenarda 8 delik vardır(Şekil 2a) ve katlanmış deri sekiz deliğin her birinde polipropilen dikişlerle iyi sabitlenmelidir.</li>
	<li>Bir sonraki adıma geçmeden önce, anestezi derinliğikorunur emin olmak için farenin refleksleri kontrol edin.</li>
	<li>Skinfold tabanında, titanyum odasının ilk yarısına bağlı iki bağlantı vidaları geçmek, arkadan ön tarafa skinfold nüfuz etmek için. Bağlantı vidalarının düzgün penetrasyonuna yardımcı olmak için ciltte küçük kesiler (ince makas kullanarak) yapın.</li>
	<li>Fareyi raftan ayırın ve yanal bir konuma yerleştirin. Titanyum haznesinin ikinci tamamlayıcı yarısını 3 bağlantı vidasının üzerine koyun (Şekil 2a'yabakınız) ve bu vidaları titanyum çerçevenin ikinci yarısından geçirmek için parmaklarla hafif basınç uygulayın. Sonra, paslanmaz çelik fındık ile her iki simetrik parçaları düzeltmek.</li>
	<li>Çok gevşek sayılsa bile, bu adımda vidaların sıkılığına dikkat edin. Buna karşılık, çok sıkı ise, cilt sıkmak, kan akışını azaltmak ve doku bozukluğu ve nekroz yol açabilir. NOT: 4.5 adımda hazırlanan somunlar, titanyum haznesinin iki simetrik yarısı arasında 400-500 m mesafeyi korumak için bir boşluk görevi göremez. Hafif bir direnç hissedilene kadar somunlar sıkılmalıdır.</li>
	<li>Vidaların kalan kısmını pliers kullanarak kesin. NOT: Bu adımda vidanın yanlış şekilde çıkması durumunda göz koruması için laboratuvar güvenlik gözlüklerinin kullanılması gerekmektedir.</li>
	<li>Tekrarlanabilir yara boyutlarını sağlamak için yara alanını gözlem penceresi içindeki derinin ortasına standart biyopsi yumruğu (2 mm çapında) işaretleyin (Bkz. Şekil 2a)cilt kıvrımı odasının.</li>
	<li>Ince forceps ve makas kullanarak, epidermis ve dermis ile tam deri kaldırarak işaretli alan içinde dairesel bir yara oluşturmak. Son yara alanı 3.5-4.5 mm2civarında olacaktır, bkz. Şekil 2b. Yarayı 0,5 mL steril salin (%0,9 NaCl, 37 °C) ile temizleyin.</li>
	<li>Yarayı cam bir kapak kaydırıcısıyla kapatın ve titanyum haznedeki çıtçıt halkasını kullanarak bu cam kapak kayslipini bir çıtçıt halkası ile düzeltin.</li>
	<li>Cerrahi işlemi tamamladıktan hemen sonra fareyi kamera yla donatılmış bir stereomikroskobun görüntüleme aşamasına yerleştirin ve ışıkaltında (0. gün) fotoğraf çekin. 40X büyütmeyi kullanın ve görüntüleri gelecekteki çevrimdışı analizler için kaydedin. NOT: Araştırmacı, kalitenin gelecekteki çevrimdışı analizler için yeterli olduğundan emin olmak için görüntüleri yakalandıktan hemen sonra incelemelidir. Deri kıvrım odasının hazırlanması ve deri yarasının performansı yaklaşık 30 dakika sürer.</li>
	<li>En az 2 saat anestezi kurtarma sırasında sıcak bir yerde fare tutun. Bundan sonra, tek tek kafeslerde farelergeri hayvan tesisine transfer (12 saat ışık / karanlık döngüsü) ve fareler gıda ve su erişimi olduğundan emin olun.</li>
	<li>Üç gün sonra yaralayıcı fareyi fareyi dizginlemeye yerleştirin ve izleme aşamasının üstüne dizginleyiciyi düzeltin.</li>
	<li>Sahneyi kamerayla donatılmış stereomikroskop un altına yerleştirin. 40x büyütme ile görüntüleri aydınlatma altında alın, tüm resimleri kaydedin ve gelecekteki çevrimdışı analizler için kaydedin</li>
	<li>Tekrar adımlar 4.20 ve 4.21 tekrar gün 6, 10 ve gün 14 sonrası yaralama.</li>
	<li>ImageJ13'tekioff-line analiz için yara görüntülerini kullanın. 0. gün deki yara alanı % 100 olarak kabul edilir ve zaman içinde yara kapanması ilk yara bölgesine göre çizilir. Temsil sonuçları Şekil 2c,d'degösterilmiştir.</li>
	<li>Yüzdeyi hesaplama (%) aşağıdaki denklemi kullanarak her zaman noktasında yara alanının: <img alt="Yara iyileşmesi hesaplama formülü, matematiksel denklemde yara alanının zaman içindeki yüzdesi." src="/files/ftp_upload/59608/59608eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> x: zaman noktası (gün 0, 3, 10 veya 14), a: 0, b: zaman noktasında ki yara alanı x</li>
</ol>

<ol><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
<li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li>
<li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li>
<li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca%282%2B%29+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li>
<li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li>
<li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+wounds+in+the+MRL%2FMPJ+mouse+heal+with+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li>
<li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li>
<li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li>
<li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li>
<li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsal+skinfold+chamber%3A+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cell+and+Materials%22%5BJournal%5D)">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li>
<li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li>
<li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion%2C+Spreading%2C+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li>
<li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+%28MIF%29+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li>
<li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-induced+Ca%282%2B%29+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li>
<li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825(2018).</li>
<li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts%2C+a+Smartphone%2C+and+Off-The-Shelf+Electronics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583(2016).</li>
<li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li>
<li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389(2013).</li>
<li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+starvation%3A+caveat+emptor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physioliology%22%5BJournal%5D)">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li>
<li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li>
<li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li>
<li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+excisional+wound+model%3A+Contraction+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li>
<li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265(2013).</li>
<li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1%2FCdc42%2FPAK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu yazıda in vitro ve in vivo yara iyileşmesi tahsinini açıklar ve elde edilen sonuçları ilişkilendiriz. In vitro tsay için, biz yara iyileşmesi ve doku remodeling önemli bir rol oynayan birincil fare fibroblastlar4,14,15 kullanılır11. Monolayers olarak büyüyen diğer yapışık hücre tipleri (örn. epitel hücreleri, endotel hücreleri, keratinositler) de kullanılabilir. Uygun ve sağlıklı hücrelerin aynı sayıda...

Cildin bütünlüğünü geri getirmek ve organizmayı enfeksiyonlardan korumak için cilt yaralanmasından hemen sonra cilt yaraiyileşmesi başlar. Yara iyileşme süreci dört örtüşen aşamadan geçer; koagülasyon, inflamasyon, yeni doku oluşumu ve doku remodeling1. Hücre göçü bu evrelerde çok önemlidir. İnflamatuar hücreler, bağışıklık hücreleri, keratinositler, endotel hücreleri ve fibroblastlar farklı zaman noktalarında aktive edilir ve yara bölgesini istila eder2. İn vitro ve in vivo yara iyileşmesini araştırma yöntemleri sadece altta yatan mekanizmaları anlamak için değil, aynı zamanda yeni ilaçları test etmek ve cilt yara iyileşmesini iyileştirmeyi ve hızlandırmayı amaçlayan yeni stratejiler geliştirmek için de büyük ilgi görmektedir.
Hücre geçişini izlemek ve analiz etmek için, sıfırdan geçiş titremi kullanılabilir. Genellikle in vitro yara iyileşmesi tsay olarak adlandırılır. Bu yöntem bir hücre kültür tesisi3gerektirir. Bu basit bir işlemdir, high-end ekipman gerek yoktur ve test çoğu hücre biyolojisi laboratuvarlarında yapılabilir. Bu teşpte, hücresiz bir alan, tercihen epitel veya endotel benzeri hücreler veya fibroblastlar, konfluent hücre monolayer mekanik bozulma tarafından oluşturulur. Çiziğin kenarındaki hücreler, oluşturulan boşluğu yeniden doldurmak için göç eder. Zaman içinde azalan hücresiz alanın niceliği geçiş hızına benzer ve hücrelerin boşluğu kapatmak için ihtiyaç duydukları zamanı gösterir. Bu amaçla, araştırmacılar ya WT fareler veya fareler ilgi4bir gen yoksun akut izole hücreleri kullanabilirsiniz , ya da güvenilir hücre depolarından kullanılabilir ölümsüzleştirilmiş hücreler. Çizik tsay farmakolojik olarak aktif bileşiklerin etkisi veya hücre göçü üzerinde transfected cDNA veya siRNA etkisi incelenmesi sağlar.
In vivo, yara iyileşmesi keratinositler, inflamatuar hücreler, fibroblastlar, bağışıklık hücreleri ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tipleri gerektiren karmaşık bir fizyolojik süreçtir mümkün olduğunca hızlı cildin fiziksel bütünlüğünü geri yüklemek için1 . In vivo yara iyileşmesi nde farklı yöntemler geliştirilmiş ve son5,6,7,8. Bu makalede açıklanan dorsal deri odası daha önce yara iyileşmesi tahlilleri için kullanılmıştır9. Bu fareler için modifiye dorsal skinfold oda hazırlığı olarak kullanılır. Modifiye skinfold oda modeli çeşitli avantajları vardır. 1) Yaranın iyileşme sürecini engelleyen ve farelerde yara onarımını etkileyebilecek cilt daralmasını en aza indirir. 2) Bu oda, yaranın cam bir kapak fişi ile kaplanması, doku enfeksiyonlarının azaltılması ve kurutunma, iyileşme sürecini geciktirebilir kullanır. 3) Kan akışı ve vaskülarizasyon doğrudan izlenebilir. 4) Bu yara tedavi etmek ve iyileşme yi hızlandırmak için farmakolojik olarak aktif bileşikler ve reaktifler tekrarlayan topikal uygulama sağlar9,10.
Yüksek gerilim kapılı kalsiyum kanallarının (Cavβ3) β3 alt ünitesini, iki bağımsız protokol, yani in vitro çizik göçü tetkik ve in vivo dorsal skinfold oda modeli ile cilt yara iyileşmesini etkileyebilecek potansiyel bir hedef molekül olarak tanımladık. İn vitro tetkik için, birincil fibroblastlar kullandık, bu hücreler Cavβ3 proteinini kodlayan Cacnb3 genini ifade eder, ancak depolarizasyona bağlı Ca2+ akını veya voltaj bağımlı Ca2+ akımları yoktur. Bu fibroblastlarda Cavβ3'ün yeni bir işlevini tanımladık: Cavβ3 inositol 1,4,5-trisfosfat reseptörüne (IP3R) bağlanır ve endoplazmik retikulumdan kalsiyum salınımını kısıtlar. Farelerde Cacnb3 geninin silinmesi IP3R IP3R artan duyarlılık yol açar, gelişmiş hücre göçü ve artan deri yara onarımı 4.

<table><tbody><tr><td>% 0.9 NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Biyopsi yumruğu</td><td>Kai Industries</td><td>48201</td><td>2 mm</td></tr><tr><td>Cacnb3 Fare siRNA Oligo Dubleks (Locus ID 12297)</td><td>Origene</td><td>SR415626</td><td></td></tr><tr><td>Epilasyon kremi</td><td></td><td></td><td>herhangi bir epilasyon krem</td></tr><tr><td>Dekspantenol% 5 (BEPANTHEN)</td> <td>Bayer</td><td>3400935940179.00</td> <td>(BEPANTHEN)</td></tr> <tr><td>Dihidroksilidinotiyazin hidroklorür (Ksilazin)</td> <td>Bayer Health Care</td><td></td><td>Rompun 2%</td></tr> <tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td><td>Gibco yaşam teknolojileri tarafından</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco yaşam teknolojileri tarafından</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Altıgen tam somun</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamin hidroklorür</td><td>Zoetis</td><td></td><td>KETASET</td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Keyence, Osaka, Japonya</td><td>BZ-8000</td><td>Benzer mikroskoplar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Mikro forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro Makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare tutucu</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amaç</td><td>Nikon</td><td>plan apo 10x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco by life technologies</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen sütürler</td> Tornavida <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaplaması dezenfektan (octeniderm)</td><td>Sch&uuml; lke & Mayr GmbH</td><td>118212</td><td></td></tr><tr><td>Oluklu peynir başlı vida</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çıtçıtlı halka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çıtçıtlı pense</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kameralı cerrahi mikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica M651</td><td></td></tr><tr><td>Deri katlama odası için titanyum çerçeveler</td><td>IROLA</td><td>160001</td><td>Halteblech M</td></tr><tr><td>Tel kazık</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ve in vivo in vivo analizi yara İyileşmesi için scratch migration tahlil ve dorsal skinfold odası

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Bozulmuş kutanöz yara iyileşmesi diyabet hastaları ve yaşlılar için önemli bir endişe kaynağıdır ve etkili bir tedaviye ihtiyaç vardır. Uygun in vitro ve in vivo yaklaşımlar cilt yara iyileşme sürecini iyileştirmek için ilaç tedavileri için yeni hedef moleküllerin belirlenmesi için gereklidir. Voltaj kapılı kalsiyum kanallarının β3 alt birimini (Cavβ3) iki bağımsız tahlilde yara iyileşmesini etkileyebilecek potansiyel bir hedef molekül olarak belirledik, yani in vitro çizik göçü tahlilleri ve in vivo dorsal skinfold oda modeli. Birincil fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) akut yabani tip (WT) ve Cavβ3-eksik fareler (Cavβ3 KO) veya fibroblastlar akut WT fareler siRNA ile tedavi izole aşağı-Cacnb3 genin ekspresyonunu düzenlemek için izole , Cavβ3 kodlama, kullanılmıştır. Bir çizik bir confluent hücre monolayer üzerine uygulandı ve boşluk kapatma göç eden hücreler tarafından boşluğun tam yeniden popülasyonkadar tanımlanan zaman noktalarında mikroskobik görüntüler alarak izledi. Bu görüntüler analiz edildi ve her durum için hücre geçiş hızı belirlendi. İn vivo bir testte, WT ve Cavβ3 KO farelere bir sırt derisi kalıbı yerleştirdik, 2 mm çapında tanımlanmış dairesel bir yara uyguladık, yarayı enfeksiyonlardan ve kurutunmaya karşı korumak için cam bir kapak kaymasıyla kapladık ve makroskopik yara nın kapanmasını izledik. zaman içinde. Cacnb3-gen eksikliği olan farelerde yara kapanması önemli ölçüde daha hızlıydı. In vivo ve in vitro tahlilsonuçları iyi korelasyon nedeniyle, in vitro tahlil in vivo yara iyileşme modeli ile in vitro isabet doğrulamadan önce yüksek iş itme taraması için yararlı olabilir. Burada yabani tip ve Cavβ3-eksik fareler veya hücreler için gösterdikleri Cavβ3 dışındaki belirli moleküller için de uygulanabilir.

Çizik telbette, yabani tip ve β3-eksik MEF'lerin(Şekil 1c)etkili bir hücre monotabakasıüzerinde yapıldı. 200 μL'lik pipet ucu kullanılarak "çizik" yaptıktan sonra, her iki genotipten hücreler çizilme alanına göç eder ve boşluğu kapatır. Görüntüler 6, 10 ve 30 saat sonraalınmıştır(Şekil 1a ). Hücre geçişi yüzde (%) olarak ölçüldü çizik yaptıktan 6 saat sonra göç eden hücreler tarafından yeniden doldurulur çizik alanı. Göç eden Ca...

Burada, primer fibroblastlar kullanarak in vitro çizik testve farelerde in vivo deri yara iyileşmesi test için bir protokol salıyoruz. Her iki tahliller in vitro ve in vivo yara iyileşmesini değerlendirmek için basit yöntemlerdir.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Asilerin deri yaralarının tedavisine ihtiyacı var. İlaç tedavileri için hedef moleküllerinizi belirlemek için in vitro ve in vivo test sistemleri gereklidir. Uygun sistemler in vitro çizik teşp, ve in vivo dorsal cilt kat odası vardır.Her ikisi de farmakolojik olarak aktif bileşiklerin yokluğunda ve varlığında hücre göçünü ve deri yara iyileşmesini izlemek için doğrudan ileri prosedürlerdir. Her iki teknik de doğrudan olmasına rağmen, araştırmacılar çizik uygulaması uygulamalıdır. Ve sırt derisi kat oda implantasyonu, ve güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için yaralanma.Prosedürlerin gösterimi, klinik ve deneysel cerrahi enstitüsünden cerrah ve profesör Dr. Matthias Laschke tarafından yapılacaktır. İşleme başlamadan önce, her kültür için çizilme bölgesini çizgilemek için her kuyunun altında yatay bir çizgi ile hücre tipi başına bir altı iyi plaka işaretlemek için ultra ince bir kalıcı işaretçi kullanın. Sonraki plaka birincil lif patlamalar vahşi tip ve beta 3 eksik fareler izole, bir altı kuyu plaka 5 kez 10 iyi konsantrasyon başına beşinci lif patlamaları.DMEM'in 2mL'sinde %10 fetal büyükbaş serum uymaktadır. Plakaları hücre tipi, genotip ve tarih ile etiketle. Ve plakaları 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Ertesi sabah ilgi her lipid tabanlı transfeksiyon reaktif 9 mikro litre ekleyin, tüp başına azaltılmış serum orta 150 mikro litre içeren bireysel mikro santrifüj tüpler. Tüp başına 150 mikro litre azaltılmış serum ortamı içeren transfeksiyon reaktifi başına ikinci bir mikro santrifüj tüpüne 1,5 mikro litre siRNA ekleyin. Ve transfeksiyon reaktif çözeltisi tek bir tüp ile her siRNA çözeltisi karıştırın.Kısa bir süre girdap sonra 5 dakika boyunca 21 derece santigrat de karışımları yerleştirin. Kuluçka sırasında dikkatle her kuyuda supernate değiştirin. Kuyuların yan aşağı taze kültür orta 2.25mL ile.Kuluçka sonunda uygun siRNA transfeksiyon reaktif karışımı 250 mikro litre ekleyin, hücrelerin her karşılık gelen kuyu içine akıllıca bırakın. Ve plakaları 72 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver. Hücreler %100 biraraya geldiğinde, her kuyudan kültür supernatant atın.Ve 200 mikro litrelik pipet ucu confluent hücre monolayer çizik oluşturmak için kullanın. Her kuyunun altındaki işaretli yatay çizgiye dikey. Daha sonra her yaralıyı yıkama başına 2mL PPS ile 2 kez dikkatlice durulayın.Hasarlı hücrelerden, gevşek hücrelerden veya çizik alandan enkaz dan serbest bırakılan faktörleri kaldırmak için. İkinci yıkamadan sonra her kuyuya yüzde 1 veya 10 serum ile takviye taze hücre kültürü orta 2mL ekleyin. Ve ışık mikroskobundaki her tabaktaki yaraların görüntülerini yakalayın.10X büyütmede tırmalamadan hemen sonra. Sonra plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver. Önümüzdeki 30 saat için uygun deneysel zaman noktalarında görüntüleri yakalamaya devam.Deneyin sonunda kültür 6, 10 ve 30 saat sonra ilk hücre serbest alan ve kalan alanı ölçmek. İlk çizilme alanına göre göç eden hücreler tarafından yeniden doldurulan çizilme alanının yüzdesini belirlemek için. Parmak tutam yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, vahşi türü veya beta üç nakavt C57 siyah altı fare, dikkatle dorsum tıraş.Ve hayvanın gözlerine merhem uygulayın. Kalan tüyleri ortadan kaldırmak için tüy dökücü krem uygulayın. 10 dakika sonra krem çıkarmadan.Titanyum haznesini hazırlamak için, simetrik titanyum oda çerçevesinin bir kısmını, somunlarla bağlantı vidaları ile sabitleyin. Haznenin iki simetrik parçası arasında 400 ila 500 mikrometre korumak. Deride kan vezikülleri sıkıştırma önlemek için.Maruz kalan cildi %70 etanol ile dezenfekte edin. Ve bir ışık kaynağının önünde bir deri kıvrımı kavramak. Derinin çift tabakasının orta çizgisini titanyum haznesinin implante edileceği yere yerleştirin.Ve kranially ve caudally bir polipropilen sütür ile cilt kıvrım düzeltmek. Katlanmış cildi kaldırmak için sütür diğer tarafını metal bir rafüzerinde sıkın. Ve farenin rahatça oturmasını sağlamak için rafın yüksekliğini ayarlayın.Dorsal deri kıvrımının arkasına üstün kenarı polipropilen dikişler ile titanyum haznesinin ilk çerçevedikiş. Sedasyon yeniden doğruladıktan sonra deride küçük kesiler yapmak için ince makas kullanın. Ve titanyum haznesinin ilk yarısına bağlı iki bağlantı vidasını deri kıvrımının tabanından geçirin.Fareyi raftan çıkarın ve hayvanı yanal bir konuma yerleştirin. Titanyum haznesinin ikinci ücretsiz yarısını 3 bağlantı vidasının üzerine yerleştirin. Ve el ile titanyum çerçevenin ikinci yarısından bu vidageçmek için hafif basınç uygulayın.Katlanmış deri tabakası şimdi titanyum çerçevenin iki simetrik yarısı arasında sıkışmış. Sonra paslanmaz çelik fındık ile her iki simetrik parçaları düzeltmek. Standart 2mL çapında biyopsi yumruğu kullanarak, deri kıvrım odasının gözlem penceresi içinde, derinin merkezindeki yara alanını işaretleyin.Ve işareti içinde tüm epidermis ve dermis kaldırmak için ince çerkes ve makas kullanın. Dairesel bir yara yaratmak için. 3,5 ila 4 buçuk milometre karelik yarayı 0,5 mL steril tuzlu su yla temizleyin.Yarayı cam kapaklı bir kapakla kapatın. Yerine kapak düzeltmek için titanyum odasında snap ring plier kullanın. Ve hemen fareyi bir stereomikroskobun görüntüleme aşamasına aktarın.Sonra yarayı 40X büyütmede görüntüle. Tam kurtarma kadar izleme ile bir kafesiçine fare yerleştirmeden önce. Gösterildiği gibi 200 mikro litrelik pipet ucu kullanılarak bir çizik oluşturduktan sonra, bu temsili deneyde, her iki genotipten hücreler çizilme alanına göç etti ve boşluğu kapattı.Hücre geçişi daha sonra çizik yapıldıktan 6 saat sonra göç eden hücreler tarafından yeniden doldurulan çizilme alanı yüzdesi olarak ölçüldü. Örneğin bu deneyde Cav beta 3 eksik lif patlamaları göç vahşi tip farelerden lif patlamaları önemli ölçüde daha erken çizik alanı kapattı. Cav beta 3'ün eksik lif patlamalarında gözlenen Cav beta 3 bağımlı etkisini doğrulamak için, yabani tip lif patlamaları Cav beta 3 proteinini aşağı doğru lamak için siRNA ile transfected edildi.Cav beta 3 spesifik siRNA'larla tedavi edilen fiber patlamalar beta 3 eksik lif patlamaları gibi davrandı. Her iki genotip arasında deri yara iyileşmesi karşılaştırmak için, deri kıvrım odasında yara alanı doğrudan yaradan sonra fotoğraflandı. Ve yara sonraki 2 hafta içinde görüntülendi.Görüntülerde yaraların boyutları ölçüldü ve yara alanı, belirli bir günde ilk yara alanının yüzdesi olarak ifade edildi. Beklendiği gibi cav beta 3 eksik farelerde yara kapatma oranı yabani tip kontrollere göre artırıldı. Her çizik için pipet ucuna eşit basınç uyguladığından ve çizikleri plakanın altındaki işaretli çizgilerle mümkün olduğunca yakından eşleştirdiğinden emin olun.Dorsal deri kıvrım odasının gözlem penceresi iyileşme sürecinde her zaman açılabilir. Farmakolojik olarak aktif bileşiklerin topikal uygulamasına izin vermek. Ayrıca iyileşme sürecinin farklı aşamalarında yaralı bölgeyi çıkarmak da mümkündür.Moleküler protein biyokimyasal veya histolojik analizi için.

scratch-migration-assay-dorsal-skinfold-chamber-for-vitro-vivo

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Göç etme kapasitesi, mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler) dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinin temel bir işlevidir. Bununla birlikte, hasardan sonra göç kapasitesindeki değişiklikleri ölçmek zordur. Bu protokol, hasardan sonra MSC göç kapasitesindeki değişiklikleri ölçmek için titiz istatistikler kullanan, kolayca uyarlanabilir bir geçiş testini açıklar.

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Burada, bir 96-yuvalı hücre kültürü plakasının bir yarı-yüksek verimli hücre göçü deneyi gerçekleştirmek için bir protokol mevcut. Bu protokol, bir hücre tek tabaka üzerinde tutarlı çizik yaraları oluşturmak için hızlı, basit ve ekonomik bir yöntemdir.

96 oyuklu bir plaka içerisinde hücre gücü / yara iyileşme gerçekleştirmek için bir cihaz

Bu çalışmada cep işgali ve geçiş analizi için iki farklı yöntem raporları: Boyden odası tahlil ve vitro video mikroskobu tabanlı yara iyileşmesi tahlil. Bu iki deney protokollerde açıklanmış ve kendi yararları ve dezavantajları karşılaştırılır.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

Bu el yazması kültürlü epitel hücre monolayers üzerinde yapılan nasıl kesi benzeri lezyonlar elverişli bir konuma sahip modeli şifa vitrogörüntüleme için tarafından confocal sağlayan, yarası. açıklar veya lazer tarama mikroskobu ve yüksek kaliteli sağlayabilir nicel ve nitel veri hücre davranış ve mekanizmaları geçişinde dahil çalışmak için.

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Burada, peptidler etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntemi Nicel veri hücre göç ve yara kapatma hızı üzerinde hızlı ve son derece tekrarlanabilir elde olanak sağlar.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.

Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş

Bu çalışmada bir vitro modeli (arsenik etkisi hücresel geçiş gibi nasıl çevre kirletici maddeleri belirlemek için yara iyileşme sıfırdan testin) bir mekanizma olarak odaklanır. Bu içinde vitro tahlil değişiklikleri için in vivo deneyler önce hücresel göç hızlı ve erken belirtileri sağlar sonuçlar gösterilmektedir.

Vitro Cilt hücre göç arsenik etkilerini göstermek için tahlil kaşı

Geçerli protokol kanser hücre göç ve gerçek zamanlı olarak tek bir platformda işgali araştırma, kolayca tekrarlanabilir ve zamanı verimli bir seçenek hücre hareketlilik ve morfoloji çalışmaya sağlayan entegre bir yöntemini açıklar.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Burada, biri hücresel ve sitokin yara iyileştirici yanıtlarını değerlendirmek, diğeri ise yara kapatma oranını ölçmek için tasarlanmış iki murine yara iyileşmesi modeli tanımlanmıştır. Bu yöntemler, kötü yara iyileşmesiçeşitli yönlerini mekanizmaları belirlemek için diyabet gibi karmaşık hastalık modelleri ile kullanılabilir.

Dorsal Subkutan Polivinil Alkol Sünger İmplantasyonu ve Eksizyonal Kuyruk Deri Yara Modelleri kullanılarak Akut Yara İyileşmesinin Değerlendirilmesi.

Ekipman yoğun yöntemler kullanılmadan hücre göçünün belirlenmesinde yeni bir yaklaşım sağlayan sıfırdan geçiş testini uygun maliyetli bir yöntem savuruyoruz. Bu protokolde fibroblastlar kullanılırken, ek hücre tipleri ve hücre göçü üzerindeki etkileri incelemek için uyarlanabilir ve kullanılabilir.

Maliyet Etkin ve Uyarlanabilir Çizilme Göçü Tsası

Bu çalışma, iki boyutlu (2D) çizik yara migrasyon testini ve üç boyutlu (3D) küresel filizlenme testini, RNA ekstraksiyonu ve immünositokimya dahil olmak üzere ilgili aşağı akış analiz yöntemleriyle birlikte, in vitro anjiyogenezi incelemek için uygun testler olarak sunmaktadır.

Çizik Yara Migrasyon Testi ve Sferoid Filizlenme Testinden Yararlanarak Anjiyogenezin Fonksiyonel ve Moleküler Düzeyde İncelenmesi

Öğrenin, farelerde primer fibroblastlarla in vitro scratch assay ve dorsal skinfold chamber kullanarak yara iyileşmesini ve hücre göçünü değerlendirme yöntemlerini. Bu protokoller farmakolojik etkileri incelemek için güvenilir sonuçlar sağlar.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Daha fazla video keşfet