Stimululated Raman saçılma dayalı doğrusal olmayan mikroskop uygulanması

Bu protokol, doğrusal olmayan mikroskobu ile ilgilenen bilim adamının, uyarılmış Raman saçılımına dayalı bir mikroskobunun temel bileşenlerini, ayarını ve hizalama prosedürünü anlamasına yardımcı olabilir. SRS mikroskopisinin başlıca avantajları titreşim kontrastına dayalı etiketsiz görüntüleme yapabilme ve birkaç saniye içinde görüntü elde etme yetenekleridir. SRS mikroskobu, özellikle hücreler ve hücresel mimari için temel olan lipidler gibi karmaşık biyolojik yapıların çalışmaları, etiketsiz görüntülemeyi yeni boyutlara taşımıştır.

SRS sinyali, sonda ışınının yoğunluğunda küçük bir değişiklik olarak algılanır ve gürültü yle bozulabilir. Bu nedenle doğru bir işaret çok önemlidir. Başlamak için, OPO ve Titanyum-safir lazer ışınlarını hizalayın, böylece ikisi de mikroskoba ulaşsın.

Daha sonra, lazer ışını konum sensörü dedektörleri iki pozisyonda dichroic ayna bir ve ayna altı arasında yerleştirin. İlk pozisyon dikroik ayna bir yakın yer alır ve ikinci bir ayna altı yakındır. Her pozisyon için, OPO ışınının X ve Y koordinatlarını algılamak için sensörleri kullanın.

Daha da önemlisi, Titanyum-safir lazer ışınının X ve Y koordinatlarının sensörün dedektörlerinin her iki konumunda da aynı OPO'ya ait olduğunu doğrulayın. Bazı pozisyonlarda, eşakışmayacak koordinatlar varsa, dengelemek için bitişik aynanın eğimini ayarlayın. Titanyum-safir ışın konumlarını aynanın altı ve yedi arasındaki yol için OPO ile ilgili olarak hizalamak için aynı prosedürü uygulayın.

Ayna altı ve yedi arasında bir flip-flop montaj ek bir ayna yükleyin ve otokorelator içine Kiriş yönlendirmek için ayna nın montaj çevirin. Otokorelatör denetleyicisi üzerinde güç, onu kontrol bilgisayarda yazılım uygulamasını başlatmak ve 8,35 milimetre normal konumuna otoklavator ışın mesafesi ayarlama vidaayarlayın. Daha sonra, Titanyum-safir ışını durdurun ve OPO ışınını ek aynadan otokorelatörün giriş aynasına yansıtın.

Burada gösterildiği gibi lazer darbe sinyali maksimize etmek için giriş aynası ayarlamaya çalışın. Daha sonra, OPO ışını durdurun ve serbest bırakın ve flip-flop monte aynadan giriş aynasına ve otokorelatora Titanyum-safir ışını yansıtın. Burada gösterilen otokorelatör sinyali elde edilene kadar en uygun ışın ayarı tekrarlayın.

Şimdi, Kiriş mesafesi ayar vidasını 7.30 milimetrelik çapraz konuma ayarlayın. Her iki kiriyi de serbest bırakın ve iki kirişle çakışmak için gecikmiş hattı tarayıp takın. Burada gösterildiği gibi, ortaya çıkan çapraz korelatör sinyalini elde edin.

Daha sonra, kirişler ayna yedi ve mikroskop un tarama kafası ulaşabilirsiniz böylece flip-flop monte ayna çevirin. Kondansatörü çıkarın ve 60x öznel lensi geçici olarak geri çekmek için kaçış düğmesini kullanın. Ardından 60x öznel lensi optik yoldan çıkarmak için burun parçasını döndürün.

Daha sonra, dedektörü harici mekanik montaj kullanarak mikroskobun üst kısmına monte edin. Dedektörün çıkışını 50 Ohm Düşük Geçiş Filtresi'nden osiloskopa bağlayın. Şimdi, tarayıcı kafasını kontrol eden işlemciyi açın ve OPO ışınını mikroskobun tarayıcı başına yansıtın.

OPO sinyalini izleyin ve xy çevirmeni kullanarak dedektör tarafından ölçülen gücü en üst düzeye çıkarın. Daha sonra, OPO lazerden Titanyum-safir lazere ışın geçişi ve Titanyum-safir lazer için de bir sinyal elde olduğunu doğrulayın. Bu, her iki kirişin de iyi hizalanmış olduğunu gösterir.

60x öznel tanıtmak için burun parçası geri döndürerek kiriş hizalama sonuçlandırın. Ardından, 60x mikroskop objektif objektifine kesinleştirilmiş odağı yeniden kazanmak için mikroskoptaki yeniden odaklama düğmesini kullanın. Son olarak, hedefi, numuneye dokunmadan veya rahatsız etmeden kondansatörün yerine 40x büyütme ile yerleştirin.

Mikroskoptan önce ölçülen Titanyum-safir ve OPO lazerlerinin gücünü her iki ışın için de 30 miliwatt'a ayarlayın. Daha sonra, pompa ve prob boncuk titreşim frekansı ile rezonans içinde değil, böylece, bir önceki ne göre, farklı bir değere OPO lazer dalga boyu ayarlayın. Sonra, her iki Kirişi de serbest bırakın, böylece mikroskoba girin.

Tarama gecikme hattını bilgisayarlı çevirmeni çalıştırın ve gecikme hattının her konumu için kilitleme amplifikatörü kullanarak ölçülen yoğunluğu kaydedin. Gecikme hattı taraması tamamlanana kadar bekleyin. Şimdi, OPO'nun dalga boyunu 1076 nanometreye ayarlayın, böylece pompa ve sonda boncukların titreşim frekansıyla rezonansa alın.

Tarama gecikme hattını bilgisayarlı çevirmençalıştırın ve gecikme hattı taraması tamamlanana kadar bekleyin. Son olarak, elde edilen çakışma ışını konumunu ve uyarılmış Raman saçılma görüntülerinin bir sonraki kazanımını elde etmek için gecikme hattını ayarlayın. Kirişlerin uzamsal senkronizasyonunu optimize etmek için Titanyum-safir ışınıdurdurarak ve OPO gücünü sekiz miliwatt'a indirerek başlayın.

Ardından, dedektör okumasını veri toplama kartına bağlayın. Mikroskop tarama konsolu ile birlikte veri toplama programını çalıştırın. Tamamlandığında, dosyayı kaydedin ve burada gösterilen gibi bir görüntü elde etmek için verileri işleyin.

Daha sonra, OPO ışını durdurun ve Titanyum-safir gücünü 2,5 ila 4,5 miliwatt'a düşürün. Dedektörü kilitleme amplifikatörü ve okumalarını veri toplama kartıyla bağlayın. Daha sonra, yine mikroskop tarama konsolu ile birlikte veri toplama programı çalıştırın.

Tamamlandığında, dosyayı kaydedin ve burada gösterilen gibi bir görüntü elde etmek için verileri işleyin. Pompa darbeleri kaldırmak ve sadece stoke sinyali elde etmek için 40x objektif ve fotodiyot arasında filtre yığını tanıtın. Daha sonra pompa sinyalini 8 miliwatt'lık odaklanmış güçle 810 nanometreye ayarlayın.

3054 ters santimetre Raman kayması ile polistiren tipik bir Karbon-Hidrojen bağı araştırmak için sekiz miliwatt aynı odaklı gücü ile 1076 nanometre sonda sinyali ayarlayın. Dedektörü kilitleme amplifikatörü ve kilitleme amplifikatörü okumasıyla veri toplama kartına bağlayın. Son olarak, mikroskop programında piksel biçimini ve edinme süresini ayarlayın ve tamamlandığında matris dosyasını kaydederek ve veri toplama sistemini çalıştırın.

Örneğin tek bir noktasından bir örnek ölçüm burada görüntülenir. Işın zaman veya uzayda çakışmadığında, elde edilen sonuç, kilitleme amplifikatörü ile ölçülen sinyalgeninin sıfır olduğu rezonanskapalıdır. Ancak bu sinyalin fazı negatif ve pozitif değerler arasında geçiş eder.

Eğer ışınlar uzayda üst üste bindirilirse, ışınlar zaman içinde mükemmel bir şekilde örtüştünce sinyal artar ve maksimuma ulaşır, faz ise Kirişlerin örtüştüldettiği süre boyunca sabit bir değer elde etmeye başlar. İletim görüntüsünde tek bir ışın kullanılır ve numuneden iletilen ışın yoğunluğu bir fotodiyot ile ölçülür. Sol tarafta, iletim görüntüsü OPO kullanılarak elde edilirken, sağ tarafta titanyum-safir kullanılarak iletim görüntüsü elde edildi.

Üç mikrometre çapında polistiren boncukların etiketsiz görüntülerinin rapor edildiği srs görüntüsünün tipik bir örneği burada gösterilmiştir. SRS mikroskobudayalı yüksek kaliteli bir görüntü elde etmek için, bir mikroskobun hizalanması önemlidir. Bu nedenle protokolde belirtilen tüm adımın dikkatle yerine getirilmesi gerekir.