Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

Burada, fare veya insan yüksek boyutlu kitle sitometri için izole taze kemik iliği (BM) işlemek için bir protokol sunuyoruz (zaman-of-Flight ile sitometri, CyTOF) nötrofil-köklü hücrelerin analizi.

Bu kitle sitometri protokolü tüm kemik iliğinin bütünlüğünü koruyarak, incelenen hücrelerin analizi için konvansiyonel numune hazırlama sırasında kaybolan bilgilerin kurtarılmasına olanak sağlar. Bu hızlı ve zahmetsiz kemik iliği izolasyon protokolü, nadir nötrofil-soy alt kümeleri gibi canlı kısa ömürlü miyeloid hücre popülasyonlarının edinimi kolaylaştırır. Nötrofil-soy hücreleri gibi daha önce takdir bağışıklık hücreleri altında tanımlamak için kitle sitometri kullanarak hastalıkların geniş bir yelpazede için geniş etkileri olabilir.

Bu protokol kemik iliğinde bulunan ve katı tümör gibi diğer doku tiplerine kolayca uygulanabilen kısa ömürlü miyeloid hücrelerin bütünlüğünü korur. Biz mümkün olduğunca kullanıcı dostu yapmak için protokol basitleştirilmiş, ancak tüm biyolojik çalışmalarda yönetmek için birkaç uygulama çalışır gerekebilir. Bunu ilk kez yaptığınızda, önce tüm reaktiflerinizi hazırlayabilir ve sonra protokolü harfiharfiyle uygulayabilirsiniz.

Herhangi bir sorunla karşılaşırsanız, CyTOForum'a bağlanabilir ve sorun gidermeye yardımcı olabilecek diğer CyTOF kullanıcılarıyla konuşabilirsiniz. Biyolojik numune hazırlama için, basit hileler sonuç ile büyük bir fark yaratabilir. Yeni bir kullanıcının protokolü kavraması görsel bir gösteri için çok daha kolaydır.

Bunu ilk kez yapıyorsanız, önce reaktiflerinizi hazırlayabilir ve ardından protokolü harfiharfine uygulayabilirsiniz. Kemik iliği hasadı için, altı ila 10 haftalık C57 siyah altı fareyi steril bir cerrahi ped üzerinde supine pozisyonunda yerleştirin ve karın ve arka ekstremiteleri sterilize etmek için %70 etanol kullanın. Karın boşluğu açmak ve arka ekstremiteleri ortaya çıkarmak için deri kaldırmak için diseksiyon cerrahi makas bir çift kullanın.

Künt uçlu pansuman forceps bir çift kullanarak, ayak bileği nin hemen altında fare tibia tutun ve künt uçlu pansuman forceps altında tibia stabilize etmek için kavisli pansuman forceps bir çift kullanın. Kaval kemiği kırmak ve kemik ortaya çıkarmak için kas kaldırmak için künt uçlu pansuman forceps kullanın. Tibia soğuk PBS yerleştirmeden önce, femur stabilize kavisli pansuman forceps hareket ettirin ve diz kapağı tutmak için diz eklemi altında künt uçlu pansuman forceps slayt.

Yavaşça diz kapağı çıkarmak için yukarı çekin ve uyluk ortaya çıkarmak için diz kapağı kas kaldırmak. Kavisli pansuman forceps tarafından maruz uyluk tutun ve kemik altından femur kesmek için cerrahi makas kullanın. Sonra PBS içinde femur yerleştirin.

Daha sonra, 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüp bir delik yumruk ve deliğe aşağı bakan kemiklerin açık uçları ile tüp her iki kemik yerleştirin 18 gauge iğne kullanın. 0,5 mililitrelik tüpü 1,7 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve çift katmanlı tüpleri mikro bir santrifüjde döndürün. Santrifüjün sonunda, kemik iliğinin tüpün altına çıkarıldığını doğrulayın.

Kitle sitometri için kemik iliği hücrelerini lekelemek için, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kırmızı kan hücre lisis tampon bir mililitre kemik iliği askıya. Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve soğuk PBS bir mililitre pelet askıya yeniden. Hücreleri 70 mikrometrelik bir süzgeçten 15 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin ve hücreleri dokuz mililitre taze, soğuk PBS ile yıkayın.

Re taze, soğuk PBS 10 mililitre kemik iliği hücre pelet askıya sayım ve yeni bir 15 mililitretüp içine altıncı hücre aliquot beş kez 10 transfer. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve yeniden kitle sitometri boyama tampon bir mililitre hücreleri askıya, ile desteklenen 125 nanomolar sisplatin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, taze kitle sitometri tampon dört mililitre hücreleri yıkayın.

FC reseptör engelleme çözeltisinin 50 mikrolitresinde peleti yeniden askıya alın. Dört santigrat derece 10 dakika sonra, hücrelere ilgi antikor kokteyl 50 mikrolitre ekleyin ve yavaşça karıştırmak için pipet. Farklı kuluçka adımlarında sıcaklık kemik iliği hücrelerinin canlılığını korumak için çok önemlidir.

Dört santigrat derece 30 dakika sonra, taze hazırlanmış bir mililitre hücreleri askıya almadan önce yıkama başına taze kitle sitometri tampon iki mililitre hücreleri iki kez yıkayın 1.6% formaldehit oda sıcaklığında 15 dakika. Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve dört santigrat derecede bir gecede kuluçka için 125 nanomolar intercalation çözümü ile desteklenen sabit perma tampon bir mililitre pelet askıya. Kitle sitometri ile hücreleri analiz etmeden önce, yavaşça girdap ve taze kitle sitometri boyama tampon iki mililitre hücreleri yıkamadan önce hücre süspansiyon santrifüj.

Daha sonra, yıkama başına distile su bir mililitre hücreleri iki kez yıkayın, dikkatle kütle sitometri analizi için kitle sitometri tampon konsantrasyonu mililitre başına altıncı hücrelere bir kez 10 hücreleri askıya önce ikinci yıkamadan sonra supernatant aspire. Bu T dağıtılmış stokastik komşu gömme çiziminde, birden çok fare dokuları arasındaki hücreler, 33 parametrelik kütle sitometri paneli ile ölçülen yüzey işaretli ifade profillerinin benzerliğine göre alt kümelere kümelenmiştir. Daha benzer özelliklere sahip hücreler, her hücredeki bu işaretçilerin ifadesine bağlı olarak otomatik olarak bir araya toplanmış.

Bu yöntem kullanılarak, tüm kemik iliği bütünlüğü korunmuş, aynı anda nötrofil ve hematopoetik kök ve atatüror hücreleri imza yüzey işaretleri ifade daha önce bilinmeyen bir hücre popülasyonunun keşfine yol açtı. Ly6G pozitif hücre tükenmesi nedeniyle daha önce miyeloid progenitor çalışmalarında atlanan bu hücre popülasyonu, yüzey belirteci ekspresyonunun farklı bir deseni sergilemektedir. Daha da önemlisi, bu veriler Ly6G ifade etmez Ly6G pozitif hücre kümesinin küçük bir alt kümesinin keşfine yol açtı, ancak CD117 pozitif Ly6G pozitif hücrelere yakın kümelenmiş, bu hücrelerin nötrofil-soy bu kitle sitometri deneyinde kullanılan 33 yüzey belirteçleri ifade dayalı benzerlik düşündürmektedir.

Bir 13 renk floresan aktif hücre sıralama paneli sonra inşa edilebilir, downstream fonksiyonel tahliller için akış sitometri tarafından nötrofil atalarının izolasyon sağlayan. Kemik iliği izolasyon işlemini mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirmek ve boyama işlemi sırasında hücreleri dört derecede tutmak önemlidir.