Name: Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Öğrenin, tüm kemik iliği hazırlama protokolü ile kısa ömürlü miyeloid hücrelerin bütünlüğünü koruyarak nadir nötrofil soyağı hücrelerini kütle sitometri ile analiz etmeyi. Bu yöntem, daha önce gözden kaçan bağışıklık hücrelerinin keşfedilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kitle sitometri prosedüründe yardım almak için LJı Flow sitometri çekirdeğine teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma NıH hibe R01HL134236, P01HL136275 ve R01CA202987 (tüm C. C. H) ve ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. ve Y. P. Z) tarafından destekleniyordu.

Tüm deneyler La Jolla alerji ve Immünoloji hayvan bakımı ve kullanım Komitesi için onaylı yönergeler takip ve kemirgenler kullanımı için onay belirtilen kriterlere göre alerji ve Immünoloji için La Jolla Enstitüsü 'nden elde edildi Ulusal Sağlık Enstitüleri 'nden laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kılavuz.
1. hasat fare kemik Iliği (BM)
<ol><li>Ticari bir satıcıdan C57BL/6J fareler satın alın. Mikroizolatör kafeslerinde standart kemirgen Chow diyetini ve evini patojen içermeyen bir tesiste besleyin.</li>
	<li>Kullanım erkek fareler, 6-10 hafta yaş, deneysel amaç için. CO2 inhalasyon tarafından ötenize servikal dislocation izledi.</li>
	<li>Fare, karın tarafı kadar steril bir cerrahi ped üzerine yerleştirin. % 70 etanol püskürterek karın ve hindekstremite alanı cildi sterilize. Karın boşluğu açık kesmek için bir çift diseksiyon cerrahi makas kullanın.</li>
	<li>Hindekstremite ortaya çıkarmak için cilt çıkarın. Fare Tibia sağ ayak bileği altında tutmak için künt uçlu soyunma forseps bir çift kullanın. Sivri uçlu soyunma forseps altında Tibia stabilize etmek için kavisli soyunma forseps başka bir çift kullanın. Tibia kırmak ve künt-ucu soyunma forseps ile kas kesmek tarafından kemik açığa. Not: Tibia gevşek diz eklemine bağlı ve kolayca künt-ucu soyunma forseps kullanılarak seçilebilir.</li>
	<li>Soğuk 1x PBS Tibia yerleştirin.</li>
	<li>Sonra, dengeleyen kavisli soyunma forseps aşağı femur taşıyın. Künt-ucu soyunma forseps diz eklemin altına kaydırın ve diz kapağı tutun. Hafifçe çekerek diz kapağını çıkarın. Diz kapağı bağlı kas sökük tarafından femur açığa. Kavisli soyunma forseps tarafından maruz femur tutun ve diseksiyon cerrahi makas kullanarak kemik altındaki femur kesilmiş.</li>
	<li>Femur soğuk 1x PBS yerleştirin.</li>
	<li>0,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 18 G iğne ile bir delik delin.</li>
	<li>Hem Tibia ve femur aynı 0,5 mL mikrosantrifüjü tüp içine kemiklerin açık ucunu deliğe aşağı bakacak şekilde yerleştirin.</li>
	<li>0,5 mL tüpünü, hem Tibia hem de femur içeren 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>Mikro-santrifüjde 30 s için 5.510 x g 'de hem Tibia hem de femur içeren çift katmanlı tüpleri döndürün.</li>
	<li>BM 'nin kemiklerden çıkarıldığından ve tüpün alt kısmında peletlenmiş olduğundan emin olun. At 0,5 ml tüp kutsal kemikler içeren Toss. Fare BM sonraki adımlara hazırdır. Not: Insan BM, daha önce açıklanan11klinik kaynaklarda hasat edilir.</li>
</ol>2. CyTOF için leke BM hücreler
<ol><li>1 mL 1x kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponunun içinde BM 'yi resuspend. İnsan BM için, 1x kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponunun 10X hacminde tüm BM 'yi pelletini. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca inküye yapın.</li>
	<li>350 x g 'de tüpü 4 °c ' de 5 dakikaya döndürün. İnsan BM için, adım 2,3 devam etmeden önce 2,1 ve 2,2 adım tekrarlayın.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant Aspire ve Pelet kırıldı bırakın. 1 ml soğuk 1x PBS ile Pelet resuspend. Bir 70 μm hücreli süzgeç aracılığıyla 15 ml konik tüp içine Pelet filtre. BM hücreleri şimdi tamamen kas ve kemik enkaz tüp içine izole edilmiştir. Tüpün içine 9 mL soğuk 1x PBS ekleyerek hücreleri yıkayın.</li>
	<li>4 °C ' de 5dk için 350 x g 'de 15 ml tüp döndürün.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant Aspire ve 10 ml soğuk PBS ile BM hücreleri pelletini. Sayma için hücrelerin bir kısım alın. Bir hemokytometer kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Aliquot 5 x 106 BM hücrelerinin içine yeni bir 15 ml tüp Için CyTOF boyama.</li>
	<li>350 x g 'de 15 ml 'lik tüp kısım 'u 4 °c ' de 5 dakikaya döndürün.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant Aspire ve 125 nm Cisplatin ile BM hücreleri pelletini 1 ml cytof boyama tampon örnek için bir canlılığı göstergesi olarak. RT 'de 5 dakika boyunca inküye yapın.</li>
	<li>Kuluçkten sonra, tüp için 4 mL CyTOF boyama tamponu ekleyin. 350 x g 'de tüpü 4 °c ' de 5 dakikaya döndürün. İnsan BM için, CyTOF boyama tampon içine% 10 insan AB serum ekleyin.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant Aspire ve FC reseptör engelleme çözeltisi 50 μL ile BM hücreleri pelletini. 4 °C ' de 10 dak. İnsan BM için bu adımı atlayın.</li>
	<li>Ekle 50 μL ev yapımı CyTOF antikor kokteyl5 örnek için toplam boyama hacmi 100 μL. Karıştırın hafifçe pipet. 4 °C ' de 30 dakika boyunca inkübe. Antikor kokteylinin son hacmi, hem fare BM hem de insan BM örnekleri için 100 μL 'dir.</li>
	<li>Hücreleri yıkamak için inkübasyon aşağıdaki her tüp için 2 mL CyTOF boyama tampon ekleyin, 4 °C ' de 5 dakika için 350 x g tüp spin.</li>
	<li>Toplam iki yıkanıyor için adım 2,12 yineleyin.</li>
	<li>% 16 stok ampüden taze 1,6% formaldehit solüsyonu hazırlayın. 1x PBS 9 parçaları ile stok formaldehit 1 parçası seyreltmeli.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant Aspire ve 1 ml taze 1,6% FA çözeltisi ile Pelet pelletini. RT 'de 15 dakika boyunca inküye yapın.</li>
	<li>800 x g 'de tüpü 4 °c ' de 5 dakikaya döndürün.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant Aspire ve 1 ml Fix/Perm tampon 125 nm ardalaması çözeltisi ile hücre Pelet pelletini.</li>
	<li>Numuneyi bir gecede 4 °C ' de intercalasyon çözeltisi içinde kuluçat.</li>
</ol>3. CyTOF edinme için hücreleri hazırlayın
<ol><li>800 x g 'de 4 °c ' de 5 dakika yavaşça girdap ve spin hücreleri.</li>
	<li>2 ml cytof boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın, 4 °c ' de 5 dakika için 800 x g 'de spin hücreleri ve aspirasyon ile süpernatant çıkarın.</li>
	<li>1 mL diH içinde resuspend hücreler2O. hücreleri saymak için her tüpten küçük bir hacim (yaklaşık 10 μL) ayırın.</li>
	<li>800 x g 'de 4 °c ' de 5 dakikaya kadar spin hücreleri.</li>
	<li>3,3 ve 3,4 adım yineleyin.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant Aspire ve pellet içinde hücreleri bırakın. BM hücreleri şimdi 1 x 106 hücreler/ml cytof edinme konsantrasyonu için Resuspension için hazırdır.</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li>
<li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li>
<li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li>
<li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+data+using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li>
<li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).</li>
<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+profiler%E2%80%99s+guide+to+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A deep profiler’s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li>
<li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+New+insights+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).</li>
<li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Son yıllarda, hücresel sırların ve heterojenlik1,2,3çalışma için ana yöntem olarak floresans bazlı akış sitometri kullanılmıştır. Akış sitometri çok boyutlu veriler sağlasa da, bu yöntem Parametreler ve spektral örtüşme seçenekleriyle sınırlıdır. Akış sitometri zayıflığının üstesinden gelmek için biz, bu nedenle, dedektör kanalları veya hücrelerin otofloresans arasındaki çapraz ortadan kaldıran antikorlar etiketlemek için fluoro...

Son yıllarda, sitometri yöntemleri BM 'de hematopoetik sistemi araştırmak için güçlü bir araçtır. Bu yöntemler arasında floresan aktif akış sitometri ve ağır metal etiketli antikorlar kullanarak yeni CyTOF yöntemi yer aldı. Benzersiz yüzey Marker ifade profillerinin tanımlanması ile heterojen bir biyolojik örnekten birçok hücre türünün keşiflerine yol açtı. Daha fazla kanal ile ilişkili olan artan spektrumlu çakışmalar, floresan aktif akış sitometri uygulamalarında daha yüksek veri doğruluğunu sağlar. Bu nedenle, floresan aktif akış sitometri analizi için ilgi hücre nüfusunu zenginleştirmek amacıyla istenmeyen hücreler rutin olarak kaldırılır. Örneğin, Ly6G (veya gr-1) ve CD11b olgun miyeloid hücre işaretçileri olarak kabul edilir ve Ly6G+ (veya gr-1+) ve CD11b+ hücreler rutin olarak BM örneklerinden kaldırılır ve akış sitometri analizinden önce Manyetik Zenginleştirme kitleri kullanılarak hematopoetik kök ve progenitör hücreler (hspcs) veya bir döküm kokteyl kanalı1,2,3bu işaretçileri birleştirerek. Diğer bir örnek ise nötrofiller, immünolojik çalışmalar için periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) zenginleştirmek için insan kanı örneğinden rutin olarak kaldırılmalıdır. Tüm kemik iliği fare veya insan izole, ancak, nadiren sitometri analizi için bozulmamış incelenmiştir.
Son zamanlarda, cytof hematopoetik sistemi araştırmak için devrimci bir araç haline gelmiştir4,5,6. CyTOF ile fluorophore etiketli antikorlar ağır eleman muhabiri etiketli antikorlarla değiştirilir. Bu yöntem, spektrum örtüşme endişe olmadan aynı anda 40 üzerinde işaretçileri ölçümü için izin verir. Önceden tükenme adımları veya bir döküm kanalı olmadan bozulmamış biyolojik numunenin analizini sağladı. Bu nedenle, geleneksel 2-b akış sitometri grafiklerden yüksek içerik boyutallık ile hematopoetik sistemi kapsamlı bir şekilde görebilirsiniz. Tükenme veya gating süreci sırasında geçmişte atlanacak hücre nüfusu artık cytof4,5tarafından oluşturulan yüksek boyutlu verilerle ışığa getirilebilir. Hemopoetik sistemde 39 parametreleri aynı anda ölçen bir antikor paneli tasarladık, miyeloid astar7' ye odaklanarak. Geleneksel akış sitometri verilerine kıyasla, CyTOF tarafından oluşturulan eşsiz tek hücreli yüksek boyutlu verilerin yorumlama ve görselleştirilmesi zordur. Hesaplamalı Bilim adamları, yüksek boyutlu veri kümeleri görselleştirme için dimensionality azaltma teknikleri geliştirdik. Bu yazıda, CyTOF verilerini analiz etmek ve yüksek boyutlu yapısı koruyarak 2 boyutlu harita üzerinde yüksek boyutlu sonuç sunmak için t-dağıtılmış Stochastic komşu katıştırma (t-SNE) tekniği kullanır algoritma, viSNE, kullanılan veri8,9,10. TSNE arsa, benzer hücreler alt kümeleri içine kümelenmiş ve renk hücrelerin özelliğini vurgulamak için kullanılır. Örneğin, Şekil 1 ' de miyeloid hücreler, 33 yüzey işaretleyicilerinin ifade desenlerinin benzerliklerini temel alarak birkaç hücre alt setine dağıtılır (Şekil 1)4. Burada daha önce bildirilen 39-Marker CyTOF panel viSNE analiz tarafından fare kemik iliği araştırıldı7. CyTOF verilerimizin viSNE analizi, HSPC (CD117+) ve nötrofil (Ly6G+) özelliklerini (Şekil 2)7gösteren tanımlanamayan bir hücre popülasyonunu ortaya koydu.
Sonuç olarak, CyTOF analizi için taze tüm kemik iliği işlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu yazıda, bir örnek olarak fare kemik iliği kullandık, bu protokol de insan kemik iliği örneklerini işlemek için kullanılabilir iken. İnsan kemik iliği örneklerine özgü detaylar da protokolde belirtilmiştir. Bu protokolün avantajı, tüm kemik iliğinde nötrofil-köklü hücreleri korumak için optimize edilmiş olan inkübasyon süresi ve sıcaklığı gibi ayrıntıları içerdiğinden, tüm kemik iliği üzerinde soruşturma sağlamak. Bu protokol floresans aktif akış sitometri uygulamalarında da kolayca değiştirilebilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>CyTOF Antikorları (fare)</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD45 (Klon 30-F11) -89Y</td><td>Fluidigm</td><td>Kedi# 3089005B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-İnsan/Fare CD45R/B220 (Klon RA36B2)-176Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Kedi# 3176002B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD105 (Klon MJ7/18)-Saflaştırılmış</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD115 (CSF-1R) (Klon AFS98)-Saflaştırılmış</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD117/c-kit (Klon 2B8)-166Er</td><td>Fluidigm</td><td>Kedi# 3166004B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD11a (Klon M17/4)-Saflaştırılmış Biolegend</td><td></td><td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD11b (Klon M1/70)-148Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3148003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD11c (Klon N418)-142Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3142003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD127 (IL-7R&alpha;) (Klon A7R34)-MaxPar Hazır Biolegend Cat</td><td></td><td># 133919; RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD150 (Klon TC1512F12.2)-167Er</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3167004B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD16.2 (Fc & gama; RIV) (Klon 9E9)-Saflaştırılmış Biolegend</td><td></td><td>Kedi# 149502; RRID:AB_2565302</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD162 (Klon 4RA10 (RUO))-Saflaştırılmış</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD169 (Siglec-1) (Klon 3D6.112)-Saflaştırılmış</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD182 (CXCR2) (Klon SA044G4)-Saflaştırılmış Biolegend</td><td></td><td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD183 (Klon CXCR3-173)-Saflaştırılmış</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD335 (NKp46) (Klon 29A1.4)-MaxPar Hazır Biolegend</td><td></td><td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD34 (Klon MEC14.7)-Saflaştırılmış</td><td>Biolegend</td><td>Cat # 119302; RRID:AB_345280</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD41 (Klon MWReg30)-MaxPar Hazır Biolegend Cat</td><td></td><td># 133919; RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD43 (Klon S11)-146Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3146009B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD48 (Klon HM48.1)-156Gd</td><td>Fluidigm Cat</td><td># 3156012B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD62L (Klon MEL-14)-MaxPar Hazır</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat # 14-1351-82; RRID:AB_467481</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD71 (Klon RI7217)-Saflaştırılmış</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD90 (Klon G7)-Saflaştırılmış</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare F4/80 (Klon BM8)-159Tb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3159009B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare Fc & epsilon; RI ve alfa; (Klon MAR-1)-MaxPar Hazır Biolegend Kedi</td><td></td><td># 134321; RRID:AB_2563768</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Saflaştırılmış</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare I-A/I-E (Klon M5/114.15.2)-174Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3174003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare Ki67 (Klon B56 (RUO))-Saflaştırılmış</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare Ly-6A/E (Sca-1) (Klon D7)-169Tm</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3169015B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare Ly6B (Klon 7/4)-Saflaştırılmış</td><td>abcam</td><td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare Ly-6G (Klon 1A8)-MaxPar Hazır Biolegend Cat</td><td></td><td># 127637; RRID:AB_2563784</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare NK1.1 (Klon PK136)-165Ho</td><td>Fluidigm Cat</td><td># 3165018B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare Siglec-F (Klon E50-2440 (RUO))-Saflaştırılmış</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 552125; RRID: AB_394340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare TCR ve beta; (Klon H57-597)-143Nd</td><td>Fluidigm</td> <td>(Klon H57-597)-143Nd</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare TER-119/Eritroid Hücreleri (Klon TER-119)-MaxPar Hazır Biolegend Cat</td><td></td><td># 116241; RRID:AB_2563789</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Kimyasallar, Peptitler ve Rekombinant Proteinler </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antikor Stabilizatörü</td><td>CANDOR Biyobilim</td><td>Kedisi# 130050</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedisi# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Sisplatin-194Pt</td><td>Fluidigm Kedi</td><td># 201194</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 1x RBC Lizis Tamponu</td><td>ThermoFisher</td><td>Kedi # 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat # 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>EQ Dört Elemanlı Kalibrasyon Boncukları</td><td>Fluidigm</td><td>Cat # 201078</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>ThermoFisher</td><td>Cat # AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Omega Bilimsel Kedi</td><td># FB-02</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fosfat Tamponlu Tuzlu su çözeltisi</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>Kedi # SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Intercalator-Ir</td><td>Fluidigm</td><td>Cat # 201192B</td><td></td></tr><tr><td>MAXPAR Antikor Etiketleme Kitleri</td><td>Fluidigm http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # 158127</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich Kedisi</td><td># S2002</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedisi # X100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>Kedisi # 25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Deneysel Model: Organizma / Suşlar < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fare: C57BL / 6J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Stok No: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Software Alogrithm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boncuk Tabanlı Normalleştirici</td><td>Finck ve diğerleri, 2013</td><td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cytobank</td><td>Cytobank https://www.cytobank.org/</td><td></td></tr> <tr><td>Cytofkit v1.r.0</td><td>Chen ve diğerleri, 2016</td><td></td> https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html <td></td></tr><tr><td>t-SNE</td><td>van der Maaten ve Hinton, 2008</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik iliği hazırlanması-lineage hücreler

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Bu makalede, tüm BM CyTOF analizi için taze BM nötrofil-Lineage hücreleri korumak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü kullanarak nötrofil-köklü hücrelere odaklanarak hematopoetik sistemi değerlendirmek için bir myeloid-önyargılı 39-antikor CyTOF panelini kullandık. CyTOF sonucu bir açık kaynak boyutlu azaltma algoritması ile analiz edildi, viSNE, ve veri bu protokol sonucunu göstermek için sunuldu. Bu protokole dayanarak yeni nötrofil-köklü hücre nüfusu keşfettik. Yeni tüm BM hazırlık bu protokol 1 için kullanılabilir), CyTOF Analizi tüm BM 'den tanımlanamayan hücre nüfusu keşfetmek için, 2), lösemi gibi kan bozuklukları olan hastalar için tüm BM kusurlarını araştırmak, 3), optimizasyon yardımcı Yeni tüm BM kullanan floresans aktif akış sitometri protokolleri.

Şekil 1 , CyTOF deneylerinden örnek bir sonuç olarak sunulmuştur. Bu tsne arsa üzerinde birden fazla fare dokularında hücreler bir 33-parametre cytof paneli ile ölçülen kendi yüzey Marker ifade profilleri benzerlik dayalı alt kümeleri içine kümelenmiş. Daha benzer özelliklere sahip hücreler, nötrofiller, makrofajlar veya her hücrede 33 işaretçileri ifadesine dayanan DCs gibi otomatik olarak birlikte kümelenir.
Şekil 2 Bu çalışmada sun...

Burada, fare veya insan yüksek boyutlu kitle sitometri için izole taze kemik iliği (BM) işlemek için bir protokol sunuyoruz (zaman-of-Flight ile sitometri, CyTOF) nötrofil-köklü hücrelerin analizi.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Bu kitle sitometri protokolü tüm kemik iliğinin bütünlüğünü koruyarak, incelenen hücrelerin analizi için konvansiyonel numune hazırlama sırasında kaybolan bilgilerin kurtarılmasına olanak sağlar. Bu hızlı ve zahmetsiz kemik iliği izolasyon protokolü, nadir nötrofil-soy alt kümeleri gibi canlı kısa ömürlü miyeloid hücre popülasyonlarının edinimi kolaylaştırır. Nötrofil-soy hücreleri gibi daha önce takdir bağışıklık hücreleri altında tanımlamak için kitle sitometri kullanarak hastalıkların geniş bir yelpazede için geniş etkileri olabilir.Bu protokol kemik iliğinde bulunan ve katı tümör gibi diğer doku tiplerine kolayca uygulanabilen kısa ömürlü miyeloid hücrelerin bütünlüğünü korur. Biz mümkün olduğunca kullanıcı dostu yapmak için protokol basitleştirilmiş, ancak tüm biyolojik çalışmalarda yönetmek için birkaç uygulama çalışır gerekebilir. Bunu ilk kez yaptığınızda, önce tüm reaktiflerinizi hazırlayabilir ve sonra protokolü harfiharfiyle uygulayabilirsiniz.Herhangi bir sorunla karşılaşırsanız, CyTOForum'a bağlanabilir ve sorun gidermeye yardımcı olabilecek diğer CyTOF kullanıcılarıyla konuşabilirsiniz. Biyolojik numune hazırlama için, basit hileler sonuç ile büyük bir fark yaratabilir. Yeni bir kullanıcının protokolü kavraması görsel bir gösteri için çok daha kolaydır.Bunu ilk kez yapıyorsanız, önce reaktiflerinizi hazırlayabilir ve ardından protokolü harfiharfine uygulayabilirsiniz. Kemik iliği hasadı için, altı ila 10 haftalık C57 siyah altı fareyi steril bir cerrahi ped üzerinde supine pozisyonunda yerleştirin ve karın ve arka ekstremiteleri sterilize etmek için %70 etanol kullanın. Karın boşluğu açmak ve arka ekstremiteleri ortaya çıkarmak için deri kaldırmak için diseksiyon cerrahi makas bir çift kullanın.Künt uçlu pansuman forceps bir çift kullanarak, ayak bileği nin hemen altında fare tibia tutun ve künt uçlu pansuman forceps altında tibia stabilize etmek için kavisli pansuman forceps bir çift kullanın. Kaval kemiği kırmak ve kemik ortaya çıkarmak için kas kaldırmak için künt uçlu pansuman forceps kullanın. Tibia soğuk PBS yerleştirmeden önce, femur stabilize kavisli pansuman forceps hareket ettirin ve diz kapağı tutmak için diz eklemi altında künt uçlu pansuman forceps slayt.Yavaşça diz kapağı çıkarmak için yukarı çekin ve uyluk ortaya çıkarmak için diz kapağı kas kaldırmak. Kavisli pansuman forceps tarafından maruz uyluk tutun ve kemik altından femur kesmek için cerrahi makas kullanın. Sonra PBS içinde femur yerleştirin.Daha sonra, 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüp bir delik yumruk ve deliğe aşağı bakan kemiklerin açık uçları ile tüp her iki kemik yerleştirin 18 gauge iğne kullanın. 0,5 mililitrelik tüpü 1,7 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve çift katmanlı tüpleri mikro bir santrifüjde döndürün. Santrifüjün sonunda, kemik iliğinin tüpün altına çıkarıldığını doğrulayın.Kitle sitometri için kemik iliği hücrelerini lekelemek için, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kırmızı kan hücre lisis tampon bir mililitre kemik iliği askıya. Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve soğuk PBS bir mililitre pelet askıya yeniden. Hücreleri 70 mikrometrelik bir süzgeçten 15 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin ve hücreleri dokuz mililitre taze, soğuk PBS ile yıkayın.Re taze, soğuk PBS 10 mililitre kemik iliği hücre pelet askıya sayım ve yeni bir 15 mililitretüp içine altıncı hücre aliquot beş kez 10 transfer. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve yeniden kitle sitometri boyama tampon bir mililitre hücreleri askıya, ile desteklenen 125 nanomolar sisplatin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, taze kitle sitometri tampon dört mililitre hücreleri yıkayın.FC reseptör engelleme çözeltisinin 50 mikrolitresinde peleti yeniden askıya alın. Dört santigrat derece 10 dakika sonra, hücrelere ilgi antikor kokteyl 50 mikrolitre ekleyin ve yavaşça karıştırmak için pipet. Farklı kuluçka adımlarında sıcaklık kemik iliği hücrelerinin canlılığını korumak için çok önemlidir.Dört santigrat derece 30 dakika sonra, taze hazırlanmış bir mililitre hücreleri askıya almadan önce yıkama başına taze kitle sitometri tampon iki mililitre hücreleri iki kez yıkayın 1.6% formaldehit oda sıcaklığında 15 dakika. Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve dört santigrat derecede bir gecede kuluçka için 125 nanomolar intercalation çözümü ile desteklenen sabit perma tampon bir mililitre pelet askıya. Kitle sitometri ile hücreleri analiz etmeden önce, yavaşça girdap ve taze kitle sitometri boyama tampon iki mililitre hücreleri yıkamadan önce hücre süspansiyon santrifüj.Daha sonra, yıkama başına distile su bir mililitre hücreleri iki kez yıkayın, dikkatle kütle sitometri analizi için kitle sitometri tampon konsantrasyonu mililitre başına altıncı hücrelere bir kez 10 hücreleri askıya önce ikinci yıkamadan sonra supernatant aspire. Bu T dağıtılmış stokastik komşu gömme çiziminde, birden çok fare dokuları arasındaki hücreler, 33 parametrelik kütle sitometri paneli ile ölçülen yüzey işaretli ifade profillerinin benzerliğine göre alt kümelere kümelenmiştir. Daha benzer özelliklere sahip hücreler, her hücredeki bu işaretçilerin ifadesine bağlı olarak otomatik olarak bir araya toplanmış.Bu yöntem kullanılarak, tüm kemik iliği bütünlüğü korunmuş, aynı anda nötrofil ve hematopoetik kök ve atatüror hücreleri imza yüzey işaretleri ifade daha önce bilinmeyen bir hücre popülasyonunun keşfine yol açtı. Ly6G pozitif hücre tükenmesi nedeniyle daha önce miyeloid progenitor çalışmalarında atlanan bu hücre popülasyonu, yüzey belirteci ekspresyonunun farklı bir deseni sergilemektedir. Daha da önemlisi, bu veriler Ly6G ifade etmez Ly6G pozitif hücre kümesinin küçük bir alt kümesinin keşfine yol açtı, ancak CD117 pozitif Ly6G pozitif hücrelere yakın kümelenmiş, bu hücrelerin nötrofil-soy bu kitle sitometri deneyinde kullanılan 33 yüzey belirteçleri ifade dayalı benzerlik düşündürmektedir.Bir 13 renk floresan aktif hücre sıralama paneli sonra inşa edilebilir, downstream fonksiyonel tahliller için akış sitometri tarafından nötrofil atalarının izolasyon sağlayan. Kemik iliği izolasyon işlemini mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirmek ve boyama işlemi sırasında hücreleri dört derecede tutmak önemlidir.

preparation-whole-bone-marrow-for-mass-cytometry-analysis-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, lösemi gibi kan hastalıkları olan hastalarda tüm BM kusurlarını araştırmak için farenin arka bacaklarından taze tüm kemik iliğini izole etmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Fare Arka Uzvundan Kemik İliği Alımı

Bir yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla ve CellTracker boyalar kullanılarak nötrofil etiketlemesi için fare kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu ve saflaştırılması için bir protokol açıklamaktadır. Bu aşağı fonksiyonel çalışmalar ya da evlatlık transferi ve izleme deneyler için nötrofil çok sayıda elde etmek için basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik yöntem temsil eder.

İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Biz pDC fonksiyonel çalışmalar için, lupus-eğilimli farelerin kemik iliğinden, yüksek saflıkta plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) izole etmek için sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre kullanarak bir protokol sunulmuştur.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

MDS tanı morfolojik ölçüt veya bilgilendirici sitogenetik yokluğunda zordur. MFC MDS tanı sürecinin rafine yardımcı olabilir. Klinik uygulamalar için faydalı olmak için MFC analiz parametreleri üzerinde yeterli özgüllük ve duyarlılık ile esas almalıdır ve veri arasında farklı operatör tekrarlanabilir olmalıdır.

Veritabanı güdümlü akışı-sitometresi kemik iliği Myeloid hücre olgunlaşma değerlendirilmesi için

Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC'ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.

Murin Kemik İliği Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin ve Stromal Niş Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Tek hücreli/tek çekirdekli transkriptomiklerin ve multi-omiklerin başarısı büyük ölçüde hücrelerin/çekirdeklerin kalitesine bağlıdır. Bu nedenle, hücrelerin/çekirdeklerin dokudan izole edilmesi ve saflaştırılması yüksek düzeyde standartlaştırılmalıdır. Bu protokol, aşağı akış tek çekirdekli multiom testi için beyin ve kemik iliğinden çekirdeklerin hazırlanmasını açıklar.

Tek Çekirdekli Multiom Tahlilleri için Yüksek Kaliteli Beyin ve Kemik İliği Çekirdeği Hazırlığı

Burada, miyelodisplastik sendromlar ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu teknik, endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler dahil olmak üzere hematopoietik olmayan kemik iliği nişindeki değişiklikleri hastalık ilerlemesi ile tanımlar.

Miyelodisplastik Sendrom ve Akut Miyeloid Lösemide Kemik İliği Mikroçevresel Popülasyonlarının Belirlenmesi

Bu el yazması, optimal nötrofil canlılığını ve yüksek kütüphane kalitesini garanti etmeyi amaçlayan, murin kemik iliğinden nötrofillerden oluşan bir ATAC-seq kütüphanesi hazırlamak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. BMC hazırlama, immünomanyetik sıralama ve kütüphane yapımı hakkında adım adım talimatlar sunarak, özellikle nötrofilleri incelemeye yeni başlayanlar için değerli bir rehber görevi görür.

Murin Kemik İliği Kaynaklı Nötrofillerin ATAC-Seq Kütüphanesi Hazırlanması

Öğrenin, tüm kemik iliği hazırlama protokolü ile kısa ömürlü miyeloid hücrelerin bütünlüğünü koruyarak nadir nötrofil soyağı hücrelerini kütle sitometri ile analiz etmeyi. Bu yöntem, daha önce gözden kaçan bağışıklık hücrelerinin keşfedilmesini sağlar.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

Daha fazla video keşfet