Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Merhaba, ben Bin Ren, Alabama Üniversitesi'nde birmingham Tıp Fakültesi'nde cerrahi ve biyomedikal mühendisliği doçentiyim. Laboratuvarımız endotel hücre biyolojisi fonksiyonu anjiyogenez acuogenez bu ortak kardiyovasküler hastalıklar ve kanserler bağlamında ilgi. Araştırma odaklarımızdan biri endotel hücre transdifferentiasyonu ve anjiyogenezin epigenetik ve transkripsiyon düzenlemesidir.

Anjiyogenezin transkripsiyonel mekanizmalarını anlamak için, sadece endotel hücrelerinde anjiyogenezle ilişkili belirli genleri siletmekle kalmadık, aynı zamanda geliştirilmiş bir GFP sondasının genetik olarak yerli endotel hücrelerinin ribozomlarına etiketlendiği transgenik mühendislik fare çizgileri oluşturduk. Bu şekilde, ilişkili haberci RNA'nın döngülerini doğrudan transgenik hayvanlarda farklı doku organlarındaki endotel hücrelerinden izole edebilir ve arındırabiliriz. Daha sonra transkript ve transkriptom downstream analizi için saflaştırılmış haberci RNA kullanabilirsiniz.

RNA sıralama ve gerçek zamanlı chill PCR ile. Bu videoda, öğrencilerim Patrick Moran ve Jordan Palmer ve araştırma teknisyenleri Nicholas Barnekow ve Rong Yuan size transgenik farelerve doğrudan transgenik hayvanlarda endotel gelen aspire RNA genotipleme bir yaklaşım gösterecektir. Genotipleme, bu protokolün önemli bir ön aşamasında, buzun endotel hücrelerinin ribozomlarında GFP etiketine sahip olmasını sağlamaktır.

Tüm downstream RNAi izolasyon adımları GFP etiketli ribozomların varlığına dayandığından, deneye başlamadan önce genotipi belirlemek önemlidir. RNA yalıtımına başlamadan önce birkaç hazırlık adımının tamamlanması gerekir. Bunlar tampon hazırlama ve protein G dina boncuk anti-GFP antikor bağlama içerir.

Tamponlar dört santigrat derecede bir aya kadar sürebilir ve antikora bağlı boncuklar dört santigrat derecede bir haftaya kadar sürebilir. Bu nedenle, denemenizi planlarken bu sınırlamaları göz önünde bulundurun. Azı lı homojenleştirici kullanmak RNA verimini artırmak için mükemmel bir yoldur.

RNA bozulmasını azaltmak için daha düşük frekans ayarlarını ve süreleri kullandığınızdan emin olun. Daha önce de belirtildiği gibi, genotipleme deneme protokolünde önemli bir ön adımdır. TRAP tekniği kullanılarak RNA'sı izole edilecek farelerin TRAP geni, en azından heterozigotlar için olumlu olmasını sağlamak, ancak TRAP geni için ideal olarak homozigot olması önemli bir adımdır, çünkü GFP etiketinin ribozomüzerinde olmasını sağlamak, deneye başlamadan önce hazırlamış olduğunuz antijen antikor reaksiyonu ve anti-GFP boncuklarını kullanarak aşağı çekmek için gereklidir.

Fareden istenilen dokuları izole edin ve mililitre siklohexamide çözeltisi başına 100 mikrogram ile hemen buz gibi bir PBS içine yerleştirin. Bu, çevirinin durdurulmasını ve transkripsinatın ötenaziden önce farenin doğru bir tasviri olmasını sağlar. Bir hücre süspansiyon içine doku homojenize etmek için bir motor tahrikli homogenizer kullanın.

İdeal zamanlama ve frekans ayarları, kullanmak ta izinli özel motorlu homogenizer göre tek tek laboratuvar tarafından belirlenmelidir. Çok yüksek bir frekans ayarı kullanmak RNA bozulmasına ve protokolün geri kalanını bozabilir. Deneye başlamadan önce hazırlamanız gereken lisis tamponu içindeki hücre peletini askıya alın.

Protokolün geri kalanına geçmeden önce yeterli homojenizasyonu sağlamak için bu karışımı daha da homojenleştirin. Homojeni 10 dakika boyunca 2,000 kez G'de dört derece santifuge'de santrifüj edin. Bu çekirdekleri ve downstream immünenazasyon reaksiyonu ile müdahale edebilir büyük hücresel enkaz pelet olacaktır.

Önceki santrifüj adımından supernatant dhpc ve CA-630 lipidler ekleyin. Bu lipidler protein fazlarını diğer hücre içi bileşenlerden ayırmaya yardımcı olur. Süspansiyonu beş dakika buza yerleştirin ve oturmasını bekleyin.

13,000 kez G'de 10 dakika boyunca lysate santrifüj herhangi bir çözünür malzeme pelet. Gelecekteki adımlar için net lysate% 15 tutun. Anti-GFP antikor bağlı boncukları hücre lisate supernatant'a ekleyin ve karışımı 4 derece santigrat derecede inkübünle ve son dönüşte 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.

Burası anti-GFP antikorlarının GFP etiketli ribozomları bağlayacakları yer. Manyetik raf üzerinde boncuk toplamak ve izolasyon başlamadan önce hazırlamış olacak yüksek tuz polizom yıkama tampon kullanarak beş kez boncuk yıkayın. Boncukları HEMEN RLT arabelleğine yerleştireceğiniz bir sonraki adıma geçin.

Lysat'ı tam hızda üç dakika santrifüj edin ve supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve yeni bir mikrofuge tüpüne aktarın. Temizlenen lysate için% 70 etanol bir hacim ekleyin ve pipetleme ile hemen karıştırın. Oluşan herhangi bir çökelti de dahil olmak üzere numunenin 700 mikrolitreye kadarını iki mililitrelik toplama tüpüne yerleştirilen bir spin sütununa aktaracağınız bir sonraki adıma hemen devam edin.

Spin kolon zarını yıkamak için 8.000 kez G'den daha fazla 15 saniye boyunca lysate santrifüj edin. Akışı atın ve bir sonraki adıma geçin. Dönüş sütununa 350 mikrolitre arabellek RW1 ekleyin.

Spin sütun membranını yıkamak ve akışı atmak için 8.000 kat Daha fazla 15 saniye santrifüj yapın. Bir sonraki adıma geçmeden önce 350 mikrolitre arabellek RW1 kullanarak bu adımı tekrarlayın. Dönüş sütununa 500 mikrolitre arabellek RPE ekleyin.

Spin kolon membranını yıkamak için 8.000 kat G'den daha büyük 15 saniye santrifüj yapın. Akışı atın ve spin sütununa 500 mikrolitre daha arabellek RPE ekleyerek bu adımı tekrarlayın. Bu kez, spin sütun membran yıkamak için 8.000 kez G daha fazla iki dakika santrifüj.

Akışı atın ve spin sütununa yeni bir iki mililitrelik toplama tüpüyerleştirin ve dönüş sütununda bulunabilecek artık arabelleği kaldırmak için bir dakika boyunca tam hızda santrifüjedmeye devam edin. Akışı atın ve dönüş sütununu yeni bir 1,5 mililitrelik toplama tüpüne yerleştirin. Spin sütun membranına 30 ila 50 mikrolitre RNase serbest su eklemeye devam edin.

Spin kolon membranından RNA'yı elemek için 8.000 kez G'den daha büyük bir dakika için santrifüj. Bu noktada, RNA'nız RNase içermeyen suda çözünür ve bir yıla kadar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Spektrofotometre kullanarak izole ettiğiniz RNA'nın saflığını ölçmek ve kontrol etmek için devam edin.

260 nanometrede bir tepe arıyorsanız, rna da dahil olmak üzere nükleik asit maksimum emer. Miktar mikrolitre başına nanogram görüntünün sağ alt kısmında gösterilmiştir. Kalite, ekranın sağ alt kısmındaki miktarın üzerinde bir madde gösterilen 260 230 oranı ile çıkarılabilir.

Yaklaşımımız düşük RNA verimleri gösterdi, özellikle biz kalp dokularından veya daha önce dondurulmuş dokulardan mRNA saflaştırılmış. Bu nedenle verimi artırmak için koşulları optomize gerekir. Ancak, EC spesifik CD-36 eksik farelerde, kontrol ile karşılaştırıldığında hem akciğer hem de kalp endotellerinde efrin B2 ve DLL4 düzeyinin önemli ölçüde arttığını gözlemledik.

Bu sonuçlar, RNA kalitesinin akış aşağı analizi için yeterli olduğunu düşündüren önceki in vitro çalışmalarımızla uyumludur. Verim, çalışma alanımızdaki katı koşullar nedeniyle düşüktü. Bu sınırlamayı aşmak için, kaliteli RNA'yı ayıklamak ve verimi artırmak için bir RNa serbest çalışma bölgesi kurmak ve rna ile kirlenebilecek çalışma yüzeylerini ve ekipmanlarını sık sık değiştirmek için çalışmak önemlidir.

Ayrıca yakınlık matrisinde uygun GFP antikor konsantrasyonları bulmak ve doku lysis tamponunda uygun RNase inhibitörü konsantrasyonlarının kullanılması ve hedeflenen dokuların endotel ribozomlarından RNA ekstraksiyonu için RNa serbest plastik gereç ler ve reaktifler kullanılması da önemlidir.