İnsan blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon

Hem blastosist biyopsisi hem de vitrifikasyon tüp bebekte bir devrim olmuştur, in vitro fertilizasyon, dünyanın dört bir yanından gelen embriyologlar embriyo için en az risk ile insan embriyoları üzerinde preimplantasyon genetik test yapmak için izin. Trophectoderm biyopsisi, tamamen büyümüş bir embriyodan yaklaşık yedi hücrenin alınmasına izin vererek sağlam aşağı genetik analizlere olanak sağladı. Ayrıca, bugüne kadar, bu yaklaşım için hiçbir etkisi gösterilmiştir.

Bu iş akışının klinik etkinliği monojenik koşulları olan hastalara ve blastosistiçinde kromozom anomalisi riski yüksek olan tüm hastaların preimplantasyon genetik testinden faydalanmalarını sağlar. Embriyo seçimimevcut stratejileri geliştirmek için hala yer var. Örneğin, miRNomik ve proteomik profilleme tek bir trophectoderm biyopsisi preimplantasyon genetik testi tamamlamak için ilginç seçenekleri temsil.

Deneyimsiz operatörler genellikle zona pellucida açma ve nüfuz ile mücadele. Bu sadece odaklanma meselesi. Blastosist, lazer hedefi ve pipetler aynı odak düzleminde olmalıdır.

Biyopsi kabını hastanın detaylarıyla etiketledikten sonra, kalıcı, toksik olmayan belirteçle, embriyo ve döngü KIMLIĞI ile HEPES-tamponlu ortamın her 10 mikrolitrelik damlasını numaralandırın.300 mikrometre sıyırma pipeti kullanarak, biyopsi kabının ilk damlasına uygun, tamamen genişletilmiş blastosisti aktarın ve aşırı dişortasını kaldırmak için damlayı durulayın. Ters bir mikroskop altında çanak yerleştirin ve biyopsi çanak üçüncü damla orta ile biyopsi pipet asal. 20 kat büyütme altında, blastosisti saat yedide iç hücre kütlesinin net bir görünümünü elde etmek için yönlendirin ve embriyoyu tutma pipeti üzerinde sabitleyin.

Zona pellucida odaklanın, böylece hem pipetler hem de blastosist aynı odak düzleminde dir. Lazer hedefine geçin ve lazer işaretçisini iç hücre kütlesinin karşı tarafındaki zona pellucida'ya yerleştirin. İki ila üç lazer darbeleri ile zona pellucida matkap, ve yavaşça zona pellucida karşı biyopsi pipet basın orta iç yüzeyden trophectoderm hücreleri ayırmak için ihlali ile üfleme izin vermek.

Trophectoderm ayrıldığında, delikten girin ve nazik emme ile biyopsi pipet içine yedi ila sekiz trophectoderm hücreleri aspire. Hedef hücreleri germek için ılımlı bir emme uygularken, biyopsi pipetini hafifçe geriye doğru hareket ettirin ve lazeri aspire edilen hücrelerin en ince kısmına doğru yönlendirin. Hedef hücreleri embriyonun gövdesinden ayırmak için hücreler arasındaki kavşaklarda 2-5 lazer darbesini ateşle.

Trophektoderm parçası blastosistten ayrıldığında, parçanın biyopsi borusu içine geri çekilmesini önlemek için blastosistten uzakta ki aynı biyopsi damlasına bırakın. Blastosisti tutan pipetten serbest bırakın ve parçanın pipetlere yapışmasını önlemek için her iki pipeti de derhal kaldırın. Daha sonra biyopsi yapılan parçayı kalite kontrol amacıyla görüntüleyin.

Blastosistlerin tamamı sadece gösterildiği gibi biyopsi yapıldığında biyopsi yemeğini laminar akış başlığına geri taşıyın ve biyopsi sonrası kültür yemeğini çift kimliği ve her damlayı embriyo ve döngü kimlikleriyle etiketlayın. Bir tanığın varlığında blastosisti temiz ivf ortamda durulayın ve blastosisti biyopsi sonrası çanaktaki damlasına doğru hareket ettirin. Daha sonra biyopsi sonrası kabı 37 derecesi santigrat, %6 karbondioksit ve %5 oksijen kuvöze yerleştirin.

Tanığın huzurunda ve oda sıcaklığında bir laminar akış kaputunun içinde, PCR tüpleri kalıcı, toksik olmayan bir belirteçle etiketleyin. Biyopsi yapılan embriyo teşekklü 60 x 15 milimetrelik bir tüp kültür çanağının kapağını etiketlendirin ve yemeğe iki adet 10 mikrolitrelik biyopsi yıkama çözeltisi ekleyin. Trophectoderm parçalarını görselleştirmek için stereo mikroskop altındaki tüp kabının ikinci damlasından biyopsi yıkama solüsyonu ile 140 mikrometrelik bir pipet ata.

Trophectoderm parçasının üzerine biyopsi yıkama solüsyonu yavaşça bırakın ve parçayı sıyırma pipete yükleyin. Biyopsi yıkama çözeltisinin ikinci damlasına parçayı taşıyın ve dokuyu 2-3 kez dikkatlice durulayın. Trophectoderm parçasını yükleme solüsyonu ile uygun şekilde etiketlenmiş PCR tüpünün altına aktarın ve sıyırma pipetinin ucuyla tüpün duvarlarına dokunmamaya özen gösteriyor.

Tüm parçalar tüplerine eklendiğinde, tüm tüpleri birkaç saniye mini bir santrifüjde döndürün ve parçaları tortulayın. Daha sonra numuneleri test için başvuran genetik laboratuvara gönderilene kadar eksi 20 derecede saklayın. Trophektoderm biyopsisinden 30 dakika sonra, hastanın detayları ve vitrifiye edilmesi gereken blastosistlerin dislerini içeren bir vitrifikasyon plakası etiketleyin.

Özel soğuğa dayanıklı kriyoetiketler kullanarak, vitrifikasyon desteklerini hastanın adı ve soyadı, çift kimliği, üzerine yüklenecek embriyonun kimliği ve işlemin tarihi ile etiketlendirin. Oda sıcaklığında, vitrifiye edilecek her blastosist için 300 mikrolitre denge çözeltisi dağıtın ve bir tanığın huzurunda blastosisti bir denge çözeltisi hacmine taşımak için 300 mikrometrelik bir sıyırma piposu kullanın. 13-15 dakika equilibration çözeltisi içinde blastosist bırakın.

Hacmin ilk küçülme sonra, kademeli bir yeniden genişleme gözlenecektir. Dengenin sonunda, vitrifikasyon plakasının ikinci kuyusuna 300 mikrolitre vitrifikasyon çözeltisi ekleyin ve tamamen yeniden genişletilmiş blastosisti bir dakika lığına vitrifikasyon solüsyonuna aktarın. Kuluçka sonunda, denge çözeltisini seyreltmek için blastosisti durulayın ve bir tanığın huzurunda blastosisti vitrifikasyon desteğine yükleyin.

Vitrifikasyon çözeltisinin fazlalıklarını çıkarın. Çözelti ince bir film blastosist çevreleyen gerekir. Vitrifikasyon desteğini sıvı nitrojene daldırın ve numuneye yakın kabarcık oluşumu riskini azaltmak için desteği şiddetle hareket ettirin.

Daha sonra vitrifikasyon desteği hala sıvı nitrojen batık iken destek koruyucu kap yerleştirin. Bu temsili iki yıllık dönemde yapılan 1, 544 trophektoderm biyopsi sınama işlemlerinden 1-4 blastosist, işlem başına 3-22 dakika süreyle biyopsi yapıldı. Bu parsellerde, çalışma trimesterleri boyunca her operatör için biyopsi ortalama zamanlaması, 8,24 dakika ortalama genel değeri ile gösterilir.

Sonuçsuz teşhislerin nedeninin parçanın boyutuna ve/veya kalitesine, tüpün veya numunenin genetik laboratuvarda işlenmesindeki bazı sorunların nedeninin değerlendirilip değerlendirilemeyeceğini değerlendirmek için, kalite kontrol amacıyla her biyopsi yapılan parçanın görüntüsünü elde etmek yararlıdır. Bu çalışmada euploid tanısı konulduktan sonra 572 euploid blastosisti embriyo transferi için ısıtıldı. Tüm blastosistler 30 dakika içinde vitrifiye, blastosistlerin %2.4'ü 31-90 dakika arasında yeniden genişlemez ve %4.9'u ısınmadan sonraki 90 dakikadan sonra tekrar genişlemez.

Özellikle kalitesiz ve/veya yedinci gün blastosistlerde biyopsi ve vitrifikasyon arasındaki zamanlama ısınmadan sonra yeniden genleşmenin sağlanması için çok önemli görüner. Trophectoderm hücre ve ateş arasındaki kavşak açığa zona pellucida açmadan önce odaklanmak için dikkat edin, ve ayrıca vitrifikasyon öncesi blastosist yeniden genişlemesini önlemek için dikkat edin. Diğer iki blastosist biyopsi söktürücü yaklaşımlar, her ikisi de zona pellucida açılması ve trophectoderm hücrelerinin spontan kemer bekliyor gerektirir.

Bu yaklaşımlar daha kolay ama daha fazla manipülasyon gerektirir ve daha fazla zaman alıcıdır. Bu iş akışının etkinliği, embriyo transferinden önce implant alameti en yüksek şansa sahip blastosisti seçmek için IVF'de moleküler teknolojilerin uygulanmasına olanak sağlar. Embriyolar için toksik olabilecek herhangi bir cihaz veya çözüm kullanmamayı ve DNA içermeyen malzemeler kullanarak DNA kontaminasyonunu önlemeyi unutmayın.