Name: In vitro transkripsiyonu RNA tabanlı luciferase Reporter assay Poxvirus-virüslü hücrelerde çeviri Yönetmeliği çalışma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Keşfedin, poxvirus enfekte hücrelerde mRNA translasyon regülasyonunu in vitro transkripsiyonlu luciferase reporter assay ile nasıl çalışılacağını. Bu yöntem, 5'UTR ve 3'UTR gibi cis-elementlerin etkilerini analiz ederek viral translasyon mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Proje, Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI128406 www.nih.gov) tarafından ZY 'ye ve kısmen Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) tarafından PD 'ye Lisansüstü öğrenci yaz maaşları şeklinde finanse edildi.

1. In vitro transkripsiyon için PCR tarafından DNA şablonunun hazırlanması
<ol><li>DNA şablonunu PCR tarafından hazırlamak için, tasarım astar. Astarları tasarlarken, astar uzunluğu, tavlama sıcaklığı (Tm), GC Içeriği, G veya C ile 3 ' End vb. gibi önemli özellikleri dikkate alın. Not: Bu literatürde ayrıntılı olarak25,26,27.</li>
	<li>5 '-3 ' yönünde aşağıdaki unsurları içeren PCR amplikon oluşturmak için tasarım astar: T7-Promoter, Poly (a) lideri, Firefly Lusiferaz ORF ve Poly (a) kuyruk T7_12A-Fluc olarak atıfta. Şablon DNA 'sında mevcut olmayan tüm ek unsurları kapsayacak şekilde tasarım astar (Ileri ve geri) (Şekil 2a). Not: Tüm öğelerin dizisi Tablo 1 ' de bulunabilir.
</li>
	<li>İleri astar birkaç ekstra nükleotidler dahil (5 '-3 ')28, sonra T7-Promoter, Poly (A) lideri veya istenen 5 '-UTR dizisi ve yaklaşık 20 nükleotid, Tmdayalı olarak ayarlamak, karşılık gelen 5 ' muhabirin geni sonuna Orf. Primer içinde karşılık gelen bölgenin gen duyu iplikiyle (+ Strand) özdeş olduğundan emin olun. Not: Uzun 5 '-UTR için, iki DNA parçaları sentezlemek: bir T7 organizatör ile uzun 5 '-UTR ve ikinci muhabiri geni ORF ile izledi. Bu iki parçaya PCR29örtüşme uzantısı kullanarak katılın.</li>
	<li>Tasarım ters astar (5 '-3 ') Poly (A) kuyruk ve yaklaşık 20 nükleotidler dahil etmek, Tmdayalı ayarlamak, muhabirin genin ORF 3 ' sonuna karşılık gelen. Primer içinde karşılık gelen bölgenin gen Anti-duyu Strand (-Strand) özdeş olduğundan emin olun ve bir çerçeve içinde stop kodon Poly (A) kuyruk önce mevcut. Not: Poli (A) lideri veya Poly (A) kuyruğunda A 'nın istenilen uzunluğu astar içinde özelleştirilebilir. Örneğin, eklemek için 50 A 's Poly (A) kuyruk, ters astar 50 T gerektirmelidir. Benzer şekilde, eklemek için 20 A 's Poly (A) lideri, ileri astar 20 A 's gerektirmelidir.</li>
	<li>İç kontrol için, 5 '-3 ' yönünde aşağıdaki öğeleri içeren başka bir astar seti Tasarla: T7 Promoter, kozak dizisi içeren rasgele 5 '-UTR kodlama dizisi, Renilla Lusiferaz ORF ve Poly (a) kuyruğu T7_ olarak anılacaktır Kozak-Rluc.</li>
	<li>Bir PCR tüpünde, reaktifleri aşağıdaki sırayla ekleyin: DNase serbest su, 2x yüksek sadakat DNA Polymerase, astar, ve sıra teyit Lusiferaz şablon DNA (Tablo 2). Not: Karışımı bireysel bileşenlerin tutarları reaksiyon hacmine göre ayarlanması gerekir.</li>
	<li>Tablo 3' te gösterildiği gıbı bir DNA şablonu oluşturmak için standart 3 adımlı (denaturation, tavlama, uzatma) PCR döngüsü kullanın. Not: Tavlama sıcaklığı X °c kullanılan primer set ve uzatma süresi T min PCR amplikon boyutuna ve kullanılan DNA polimeraz bağlıdır bağlıdır.</li>
	<li>PCR ürününü% 1 agaroz Tris-asetat-EDTA (Tae) jel elektroforezi (0.1 μg/ml etidyum bromür içeren) ve ticari olarak mevcut moleküler ağırlık standardı ile% 5-10 oranında çalıştırarak algılayın. PCR ürününün boyutunu belirlemek için bir UV aydınlatıcısı altında jel görselleştirin.</li>
	<li>PCR ürününün doğru boyutunu belirledikten sonra, T7_Kozak-Rluc için T7_12A-Fluc ve ~ 1,0 KB için ~ 1,7 KB, ticari olarak kullanılabilen bir PCR arıtma kiti kullanarak arındırır. 100 μL nükleaz ücretsiz suyu kullanarak DNA 'yı elute (Şekil 2B).</li>
	<li>Bir kez, bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu kontrol ve A260/A280 oranını belirlemek (~ 1.8-2.0 kabul edilebilir) saflaştırılmış.</li>
	<li>Arındırılmış DNA 'Yı-20 °C ' de saklayın veya hemen in vitro transkripsiyon için kullanın.</li>
</ol>2. In vitro transkripsiyon tarafından mRNA üret
<ol><li>
RNA 'nın PCR üründen in vitro sentezini, bir in vitro transkripsiyon kiti kullanarak (Şekil 3A). Not: T7_12A-Fluc ve T7_Kozak-RLUC DNA şablonları sırasıyla 12A-Fluc ve kozak-Rluc mRNAs sentezlemek için kullanılır.<ol>
<li>Bunu yapmak için, bir mikrosantrifüj tüpü alın ve reaktifler aşağıdaki sırayla ekleyin: DNase-RNase serbest su, NTP tampon karışımı, Cap analog, şablon PCR ürün, T7-RNA polimeraz Mix (Tablo 4). Not: Diğer kapak sistemleri ayrıca, üreticinin talimatını takiben in vitro transkripsiyon sonrası RNA 'ya sıralı olarak da kullanılabilir.</li>
		<li>37 °C ' de 2 saat boyunca iyice karıştırın ve inküye yapın.</li>
		<li>RNA arıtma kiti kullanarak sentezlenmiş RNA 'nın arıtılmasına devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA 'yı kontrol etmek için% 1,5 agaroz Tris-borate-EDTA (TBE) jel (0,5 μg/ml etidyum bromür içeren) içinde saflaştırılmış RNA çalıştırın. Bir UV aydınlatıcısı altında jel görselleştirin (Şekil 3B).</li>
	<li>Bir spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu kontrol edin ve A260/A280 oranını belirleyin (~ 1.8-2.0 kabul edilebilir).</li>
	<li>Saflaştırılmış RNA ve mağaza at-80 °C.</li>
</ol>3. mRNA 'yı hücrelere transfekt
<ol><li>Bir 24-kuyu plaka tohum HeLa hücreleri (yaklaşık ~ 80-90% confluent ertesi gün) ve% 5 CO2Ile 37 °c ' de bir kuluçko bir gecede inkübe.</li>
	<li>, Bir multiplicity içinde Vaccinia virüsü (VACV) ile HeLa hücreleri enfekte (MOı) 5 ya da karşılaştırma için enfekte olmayan HeLa hücreleri tutmak. Not: MOı hücre başına bulaşıcı viral parçacıklar sayısıdır.</li>
	<li>MOI X = {[(hücre sayısı * X)/virüs titer] * 1000} μL 1 mL orta başına virüs.</li>
	<li>
İstenilen h sonrası enfeksiyon (HPi) (10-12 HPi 'de bu denemede), Şekil 3c'de gösterildiği gibi bir cationıc lipid transfeksiyon reaktif kullanarak mRNA (24-kuyu plakaları başına toplam mrna 500 ng) transfect.
	<ol>
<li>Bir 24-kuyu plaka bir iyi için, mix 480 ng 12A dizi Firefly Lusiferaz (12A-Fluc) mRNA ve 20 ng kozak sıra taşıyan Renilla Lusiferaz (kozak-rluc) mRNA bir mikro santrifüj tüp. Başka bir mikrosantrifüjte tüp 1,1 ekleme μL cationıc lipid transfeksiyon reakajının.</li>
		<li>Her iki tüpte düşük serum orta 55 μL ekleyin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırın ve inküye yapın.</li>
		<li>5 dk. inkübasyon yapıldıktan sonra, mRNA 'da tüp içeren azaltılmış serum ortamı içeren 55 μL katyonik lipid transfeksiyon reakajının eklenmesi.</li>
		<li>Hafifçe ama iyice karıştırın ve 15 dakika oda sıcaklığında inküye.</li>
		<li>İnkübasyon sırasında, hücre kültürü ortamını çıkarın ve 24-kuyu plakalarının iyi başına düşük serum Orta 400 μL ekleyin.</li>
		<li>İnkübasyon sonrası, 100 μL karışımı dropwise ve eşit bir iyi 24-kuyu plakaları ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. luciferase etkinliklerini ölçmek
<ol><li>Beş saatlik Post-Co-transfeksiyon 12A-Fluc ve kozak-rluc mRNA, bir Lusiferaz tahlil sistemi iki muhabir deneyleri performans yeteneğine kullanarak ölçmek Lusiferaz aktivite (örneğin, Çift Lusiferaz Reporter tahlil kiti).</li>
	<li>Azaltılmış serum orta çıkarın ve 150 μL 1x liziz tampon, Lusiferaz tahlil kiti bir bileşeni ekleyerek hücreleri Lyse.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 10 min inkübasyon yapıldıktan sonra, hücreleri parçalayarak lysate toplayın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>4 °C ' de 10 dakika için 12.000 x g 'de lysate Santrifüjü Pelet hücre enkaz.</li>
	<li>Bir katı alt ile opak duvarlı 96 iyi beyaz assay plaka süpernatant 30 μL ekleyin.</li>
	<li>Lusiferaz tahlil kiti ve MultiMode plaka okuyucu Luminometre kullanarak çift lüminesans ölçmek.</li>
	<li>Tablo 5' te açıklanan ayarları kullanarak kinetik fonksiyonunu (her iyi bazda) kullanarak ölçümü gerçekleştirin. Not: Okuma da manuel Luminometer kullanılarak alınabilir. Bir küvette Fluc için eşit hacimli lysate ve substrat ekleyin. Luminometre kullanarak 10 s için 2 s ve ölçü bekleyin. Fluc ölçümünü takiben, luminometreden hızlı bir şekilde küvetten çıkarın ve Rluc için el ile eşit hacimli bir substrat ekleyin. Yine, 2 s ve ölçü için 10 s Luminometer kullanarak bekleyin.</li>
	<li>Lüminesans okuma verilerini arzu edilen bir dosya biçimine dışa aktarın.</li>
	<li>Dahili kontrol Rluc değeri ile Fluc değerini bölerek enfekte olmayan ve VACV enfekte HeLa hücrelerinde 12A-Fluc mRNA göreli çeviri oranını belirleyin. Not: Ek Şekil 1 göreli Fluc aktivitesini elde etmek için ham verilerin adım adım analizini gösterir.</li>
</ol>

<ol><li>Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Symposia+of+the+Society+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">On protein synthesis.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).</li>
<li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Dogma+of+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Central Dogma of Molecular Biology.</a> Nature. 227, 561-563 (1970).</li>
<li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Translation+Initiation+in+Eukaryotes%3A+Mechanisms+and+Biological+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li>
<li>Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+Gene+Expression+during+Conditions+of+Cell+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress.</a> Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).</li>
<li>Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShchelkunov%2C+SN+%22Orthopoxviruses+Pathogenic+for+Humans%22">Orthopoxviruses Pathogenic for Humans</a>. , Springer US. (2005).</li>
<li>Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Control+of+Viral+Gene+Expression+in+Eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).</li>
<li>Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinkering+with+Translation%3A+Protein+Synthesis+in+Virus-Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351(2013).</li>
<li>Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+against+the+Tide%3A+Selective+Cellular+Protein+Synthesis+during+Virally+Induced+Host+Shutoff%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).</li>
<li>Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-independent+translation+of+poliovirus+mRNA+is+conferred+by+sequence+elements+within+the+5%E2%80%99+noncoding+region%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).</li>
<li>Pelletier, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+initiation+of+translation+of+eukaryotic+mRNA+directed+by+a+sequence+derived+from+poliovirus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA.</a> Nature. 334, 320-325 (1988).</li>
<li>Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+a+cap-independent+translation+element+that+functions+in+either+the+3%E2%80%B2+or+the+5%E2%80%B2+untranslated+region%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region.</a> RNA. 6, 1808-1820 (2000).</li>
<li>Simon, A. E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%E2%80%B2+Cap-Independent+Translation+Enhancers+of+Plant+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses.</a> Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).</li>
<li>Marom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+poly%28A%29+binding+proteins+mediate+internal+translational+initiation+by+a+plant+viral+IRES%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES.</a> RNA Biology. 6, 446-454 (2009).</li>
<li>Liu, B., Qian, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+reprogramming+in+cellular+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Review.+RNA%22%5BJournal%5D)">Translational reprogramming in cellular stress response.</a> Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).</li>
<li>Ahn, B. Y., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capped+poly%28A%29+leaders+of+variable+lengths+at+the+5%E2%80%99+ends+of+vaccinia+virus+late+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs.</a> Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).</li>
<li>Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+vaccinia+virus+gene+encoding+an+18-kilodalton+subunit+of+RNA+polymerase+and+demonstration+of+a+5%E2%80%99+poly%28A%29+leader+on+its+early+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript.</a> Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).</li>
<li>Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinuous+transcription+or+RNA+processing+of+vaccinia+virus+late+messengers+results+in+a+5%E2%80%B2+poly%28A%29+leader%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader.</a> Cell. 50, 163-169 (1987).</li>
<li>Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+initiation+and+3%E2%80%B2+end+formation+of+poxvirus+post-replicative+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).</li>
<li>Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%E2%80%99-poly%28A%29+leader+of+poxvirus+mRNA+confers+a+translational+advantage+that+can+be+achieved+in+cells+with+impaired+cap-dependent+translation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation.</a> PLOS Pathogens. 13, e1006602(2017).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-kingdom+mimicry+underlies+ribosome+customization+by+a+poxvirus+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase.</a> Nature. 546, 651-655 (2017).</li>
<li>Dai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Profiling+Reveals+Translational+Upregulation+of+Cellular+Oxidative+Phosphorylation+mRNAs+during+Vaccinia+Virus-Induced+Host+Shutoff%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).</li>
<li>De Silva, F. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin-independent+plasmid+replication+occurs+in+vaccinia+virus+cytoplasmic+factories+and+requires+all+five+known+poxvirus+replication+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors.</a> Journal of Virology. 2, 23(2005).</li>
<li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+analysis+of+vaccinia+virus+and+host+cell+transcriptomes+by+deep+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).</li>
<li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analysis+of+the+5%E2%80%B2+and+3%E2%80%B2+Ends+of+Vaccinia+Virus+Early+mRNAs+Delineates+Regulatory+Sequences+of+Annotated+and+Anomalous+Transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts.</a> Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+and+Applications%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).</li>
<li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInnis%2C+MA+%22PCR+Protocols%3A+A+Guide+to+Methods+and+Applications%22">PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+on+DNA+Transcription+of+Nucleotide+Sequences+Upstream+to+T7+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter.</a> Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).</li>
<li>Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThornton%2C+JA+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci%3A+Methods+and+Protocols%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York. 43-49 (2017).</li>
<li>Akichika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-specific+terminal+N6-methylation+of+RNA+by+an+RNA+polymerase+II%E2%80%93associated+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase.</a> Science. , (2018).</li>
<li>Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-specific%2C+terminal+N6-methylation+by+a+mammalian+m6Am+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase.</a> Cell Research. 1, (2018).</li>
<li>Boulias, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+m6Am+methyltransferase+PCIF1+reveals+the+location+and+functions+of+m6Am+in+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome.</a> bioRxiv. , 485862(2018).</li>
<li>Dominissini, D., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N4-acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+by+NAT10+Regulates+Stability+and+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation.</a> Cell. 175, 1725-1727 (2018).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+m6A%2C+m6Am%2C+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali faiz bildirmek istiyorum.

Tüm dört çekirdekli adımlar in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil başarısı için önemlidir. Özellikle T7 Organizatör dizisi için primer tasarıma özel dikkat verilmelidir. T7 RNA polimeraz, 5 '-UTR dizisinden önce eklenen T7 promotör 'de ilk altı çizili G (ggg-5'-UTR-Aug-) den transkripsiyon başlar. Transkripsiyon başlangıç sitesi (TSS) 5 ' ucunda ilk g 'den başlaysa da, T7 Organizatör bölgesinde 3 ' ten az olan g sayısının azaltılması RNA verim/çıkışını in vitro transkripsiyondan düşürmüştür...

Orta dogma 'ya göre, genetik bilgiler DNA 'dan RNA 'ya ve sonunda protein1,2' ye akar. Genetik bilgi bu akışı yüksek mRNA çeviri3,4dahil olmak üzere birçok düzeyde düzenlenir. Bu süreçte yer alan düzenleyici mekanizmaların anlaşılması, Gen ifadesinin düzenlenmesini ölçmek için gazetecinin geliştirilmesi konusunda yardımcı olmaktadır. Burada poxvirus enfekte hücrelerde bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil kullanarak mRNA çeviri çalışması için bir protokol açıklanmaktadır.
Poxvirüsler birçok son derece tehlikeli insan ve hayvan patojenleri5oluşturur. Diğer tüm virüsler gibi, poxvirüsler sadece protein sentezi6,7,8için ana hücre makineleri güveniyor. Verimli viral proteinleri sentezlemek için, virüsler viral mrnas7,8çevirisi için yönlendirmek için hücresel translasyonel makine kaçırmak için birçok stratejiler gelişti. Virüsler tarafından yaygın olarak kullanılan bir mekanizma, kendi transkriptlerinde BDTetkili unsurları kullanmaktır. Önemli örnekler iç ribosome giriş sitesi (IRES) ve Cap-bağımsız çeviri artırıcı (CITE)9,10,11içerir. Bu BDTelemanları, çeşitli mekanizmalar aracılığıyla translasyonel makineleri alarak viral transkriptler bir translasyonel avantajı render12,13,14. 100 Over poksvirüs mrnas 'ın 5 '-untranslated bölgesi (5 '-UTR) içinde evrimsel olarak koruma altında olan bir eleman var: Bu mrnas15,16' nın çok 5 ' ucunda 5 '-Poly (a) lideri. Bu 5 ' Poly (A) liderlerin uzunlukları heterojen ve Transkripsiyon sırasında poxvirus kodlu RNA polimeraz kayma tarafından üretilir17,18. Biz, ve diğerleri, son zamanlarda keşfetti 5 '-Poly (A) lideri Vaccinia virüs ile enfekte hücrelerde bir mRNA bir çeviri avantajı confers (vacv), poxvirüsler Prototipik üyesi19,20.
İn vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz Reporter assay başlangıçta poksvirüs enfeksiyonu sırasında mRNA çeviri 5 '-Poly (A) lideri rolünü anlamak için geliştirilmiştir19,21. Plazmid DNA tabanlı Lusiferaz muhabiri olarak yaygın olarak kullanılan olsa da, poxvirus enfekte hücrelerde sonuç yorumu zorlaştıracak çeşitli dezavantajları vardır. İlk olarak, plazmids VACV enfekte hücrelerde çoğaltmak edebiliyoruz22. İkinci olarak, kriptik transkripsiyon genellikle Plasmid DNA18,23,24oluşur. Üçüncü olarak, VACV Promoter güdümlü transkripsiyon Poly (A) oluşturur-heterojen uzunlukları lideri sonuç olarak Poly (A)-bazı deneyler18lider uzunluğu kontrol etmek zor hale. Bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil bu sorunları circumvents ve veri yorumu basittir.
Bu yöntemde dört önemli adım vardır: (1) polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) in vitro transkripsiyon için DNA şablonunu oluşturmak için; (2) içinde vitro transkripsiyon mRNA oluşturmak için; (3) mRNA 'yı hücrelere teslim etmek için transfeksiyon; ve (4) tercüme göstergesi olarak Lusiferaz aktivitesinin tespiti (Şekil 1). Elde edilen PCR amplikon, 5 '-3 ' yönünde aşağıdaki unsurları içerir: T7-Promoter, Poly (a) lideri veya istenen 5 '-UTR dizisi, Firefly Lusiferaz açık okuma çerçevesi (ORF) ve ardından Poly (a) kuyruk. PCR amplikon, T7 polimeraz kullanarak mRNA 'yı in vitro transkripsiyon ile sentezlemek için şablon olarak kullanılır. İn vitro Transkripsiyon sırasında, m7G CAP veya diğer kapak analog yeni sentezlenmiş mRNA eklenmiştir. Capped transkriptler enfekte olmayan veya vacv enfekte hücrelere transfekte vardır. Hücre lysate transfeksiyon mRNA protein üretimini gösteren Lusiferaz faaliyetleri ölçmek için nakli sonra istenilen zamanda toplanır. Bu muhabir assay 5 '-UTR, 3 '-UTR veya bir mRNA diğer bölgelerinde BDTelemanı mevcut tarafından çeviri Yönetmeliği çalışmak için kullanılabilir. Ayrıca, in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı tahlil Cap-bağımlı başlatma, Cap-bağımsız başlatma, yeniden başlatma ve InAs gibi iç inisiyasyon dahil olmak üzere çeviri başlatma farklı mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Master karışımı</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3&akut;-O-Me-m7G(5 ')ppp (5') G RNA Kapak Yapısı Analog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td>Anti ters Kapak analog veya ARCA</td></tr><tr><td>Corning 96 Kuyu Yarım Alan beyaz düz tabanlı polistiren mikroplaka</td><td>Corning</td><td>3693</td><td>Opak duvarlı 96 kuyulu beyaz plaka, sağlam tabanlı</td></tr><tr><td>Çift Lusiferaz Raportör Test Sistemi</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Çift Lusiferaz Test Kiti (DLAK)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Döngü Saf Kiti</td><td>OMEGA BIO-TEK</td><td>D6492</td><td>PCR saflaştırma kiti</td></tr><tr><td>GloMax Navigator Mikroplaka Luminometre</td><td>Promega</td><td>GM2010</td><td>Çok modlu plaka okuyucu luminometre olarak anılır</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Hızlı Yüksek Verimli RNA sentez Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td>In Vitro transkripsiyon kiti</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Katyonik lipid transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>DNA ve RNA konsantrasyonunu ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Azaltılmış serum ortamı</td></tr><tr><td>Purelink RNA Mini Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>RNA arıtma kiti</td></tr><tr><td>Vaccinia Kapatma Sistemi</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080</td><td>Kapatma sistemi</td></tr></tbody></table>

in vitro transkripsiyonu rna tabanlı luciferase reporter assay poxvirus-virüslü hücrelerde çeviri yönetmeliği çalışma

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Viral DNA replikasyonu sonrasında yapılan her poksvirüs mRNA, 5 '-UTR ' a evrimsel olarak koruma altına alınan, templated olmayan 5 '-Poly (A) lideridir. Poksvirüs enfeksiyonu sırasında mRNA tercüme 5 '-Poly (A) lideri rolünü incelemek için biz bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil geliştirdi. Bu muhabir tahlil dört temel adımlardan oluşur: (1) PCR in vitro transkripsiyon için DNA şablonunu yükseltmek için; (2) T7 RNA polimeraz kullanarak mRNA oluşturmak için in vitro transkripsiyon; (3) hücrelerde in vitro transkripsiyonu mRNA 'yı tanıtmak için transfeksiyon; (4) tercüme göstergesi olarak Lusiferaz aktivitesinin tespiti. RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil burada açıklanan poxvirus enfekte hücreler ve plazmid gelen şifreli transkripsiyon plazmid çoğaltma sorunları circumvents. Bu protokol, poxvirus enfekte hücreler dışındaki sistemlerde 5 '-UTR ve 3 '-UTR dahil olmak üzere bir mRNA BDTelemanları tarafından çeviri düzenleme belirlemek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntem kullanılarak Cap-bağımlı, Cap-bağımsız, yeniden başlatma ve iç başlatma gibi farklı çeviri başlatma modları incelenebilir.

İn vitro transkripsiyon RNA tabanlı Lusiferaz Reporter tahlil dört adım: PCR In vitro transkripsiyonu için DNA şablonu oluşturmak için, mRNA üretmek için in vitro transkripsiyon, mRNA transfeksiyon, ve Lusiferaz ölçümü, şematik diyagramda görülebilir ( Şekil 1). Hem DNA şablonları (Fluc ve rluc) hem de çıkıntı uzantısı PCR genel şeması için astar tasarımı şematik olarak gösterilmiştir (Şekil 2a). PCR 'den sonra, doğru boyutlu PCR...

Biz poxvirus enfekte hücreler içinde vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir assay kullanarak mRNA çeviri Yönetmeliği çalışmak için bir protokol sunuyoruz. Tahlil, 5 '-untranslated bölgesi (UTR) ve 3 '-UTR dahil olmak üzere bir mRNA BDTelemanları tarafından çeviri Yönetmeliği eğitim için kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak farklı çeviri başlatma modları da incelenebilir.

In vitro transkripsiyonu RNA tabanlı luciferase Reporter assay Poxvirus-virüslü hücrelerde çeviri Yönetmeliği çalışma

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

RNA tabanlı luciferase testi nin transkripsiyonu için protokolümüz, çiçek virüsü enfekte hücrelerde çeviri regülasyonunun incelenmesine yardımcı olur. Ayrıca, Poly (A) litre özelleştirilmiş bir uzunluk çeviri üzerindeki düzenleyici etkileri incelenmesine olanak sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, mRNA'da 5'UTR ve 3'UTR gibi Cis elemanları tarafından çeviri düzenlemesinin incelenmesine ve geniş çeviri başlatma spektrumuna olanak sağlamasıdır.In vitro transkripsiyonlu RNA tabanlı luciferase muhabir testi, kap ve diğer modifikasyonlara değişiklik yapmak üzere uyarlanmış ve çeviri üzerindeki etkisini test etmek için kullanılabilir. Başlamak için, 5'to 3'yönünde aşağıdaki öğeleri içeren PCR amplicon oluşturmak için ileri ve geri astar tasarımı:T7-Promoter, Poly(A)litre, Firefly Luciferase ORF bir Poly (A) kuyruk T7_12A-Fluc olarak anılacaktır, ileri astar birkaç ekstra nükleotitler t7-Promoter Poly (A)litre veya istenen 5'UTR dizisi ve yaklaşık 20 nükleotit muhabir genin ORF 5'sonuna karşılık gelen takip içerir. Astar uzunluğunu, muhabir genin ORF'sinin 5'sonuna karşılık gelen erime sıcaklığına göre ayarlayın ve astardaki ilgili bölgenin genin duyu iplikçiği ile aynı olmasını sağlar.Daha sonra Poly(A) kuyruğu nuve yaklaşık 20 nükleotit içerecek şekilde ters astar tasarlayın. Muhabir genin ORF'sinin 3'ucuna karşılık gelen erime sıcaklığına göre ayarlayın, astarın ilgili bölgesinin genin antisense iplikçiği ile aynı olmasını ve Poli(A) kuyruğundan önce çerçeve içi durdurma kodonunun bulunmasını sağlar. İç kontrol için, 5'to 3'yönünde aşağıdaki öğeleri içeren başka bir astar kümesi tasarlayabilirsiniz: T7-Promoter, Kozak dizisini içeren rastgele bir 5'UTR kodlama dizisi, Renilla Luciferase ORF ve T7_Kozak-Rluc olarak adlandırılan Poli(A)kuyruk.Reaksiyonu ayarlamak için, bir PCR tüpüne aşağıdaki sırayla reaktifler ekleyin:DNase serbest su, 2Kat yüksek sadakatli DNA polimeraz, astar lar ve dizi onaylı luciferase şablonu DNA'sına. Bir DNA şablonu oluşturmak için standart bir üç adımpcr döngüsünden sonra, pcr reaksiyonunun %5-10'unu moleküler ağırlık standardı ile birlikte %1 agarose TAE jel elektroforezinde çalıştırarak PCR ürününü tespit edin. PCR ürününün boyutunu belirlemek için jeli uv aydınlatıcının altında görselleştirin.PCR ürünün doğru boyutunu belirledikten sonra, DNA'yı eleştirmek için 100 mikrolitre nükleaz içermeyen su kullanarak ticari olarak kullanılabilen PCR arıtma kitini kullanarak arındırın. Saflaştırılmış DNA konsantrasyonuna bir spektrofotometre kullanarak kontrol edin ve in vitro transkripsiyon için hemen kullanılmak üzere eksi 20 santigrat derecede saklayın. PCR ürününden RNA sentezlemek için aşağıdaki reaktifleri mikrosantrifüj tüpüne ekleyin:DNase-RNase serbest su, NTP tampon karışımı, kapak analogu, PCR ürün şablonu ve in vitro transkripsiyon kitinden T7-RNA polimeraz karışımı.Iyice karıştırın. İki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatve sonra bir RNA arıtma kiti kullanarak sentezlenen RNA'nın saflaştırılmasına devam edin. Saflaştırılmış RNA kontrol etmek için, ısı RNA beş dakika ikincil yapısı kaldırmak ve 1.5 agarose TBE jel üzerinde çalıştırmak için.Sonra bir UV aydınlatıcı altında jel görselleştirin. Bir spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış RNA konsantrasyonu kontrol edin. Aliquot ve eksi 80 santigrat derece de saklayın.Tohum HeLa hücreleri 24 iyi plaka içinde% 80-90 birleştiği gün elde etmek ve bir gece boyunca bir kuvöz de 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile kuluçka. Beş enfeksiyon çokluğu ile Vaccinia virüsü ile HeLa hücreleri enfekte ve karşılaştırma için enfekte olmayan HeLa hücreleri tutun. Sonra 10 ila 12 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece plaka kuluçka.Enfeksiyon sonrası istenilen saatlerden sonra, Firefly Luciferase mRNA taşıyan 12A dizisinin 480 nanogramını ve Renilla Luciferase mRNA'yı taşıyan 20 nanogram Kozak dizisini bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın. Başka bir mikrosantrifüj tüpünde, katyonik lipid transfeksiyon reaktifi 1.1 mikrolitre ekleyin. Her iki tüpe de 55 mikrolitre azaltılmış serum media ekleyin, oda sıcaklığında beş dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın.Daha sonra 55 mikrolitre katyonik lipid transfeksiyon reaktifi içeren azaltılmış serum media içeren mRNA içeren tüp ekleyin. Hafifçe ama iyice bir pipet ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçka ile karıştırın. Kuluçka sırasında, hücrelerden hücre kültürü ortamı kaldırmak ve iyi başına azaltılmış serum orta 400 mikrolitre ekleyin.Kuluçka tamamlandığında, karışım damla akıllıca ve 24 iyi plaka kuyu başına eşit 100 mikrolitre ekleyin. 12A Fluc ve Kozak Rluc mRNA ile beş saat sonra co-transfection, hücrelerden azaltılmış serum ortamı kaldırmak ve iki muhabir tahlilleri gerçekleştirme yeteneğine sahip Luciferase tahlil kiti 150 mikrolitre 1X lysis tampon ekleyerek hücreleri lyse. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkadan sonra, kauçuk ve steril şırınga kullanarak hücreleri kazıyın ve mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Hücre enkazını püskürtmek için, 12,000 kez g'de 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca lysat'ı santrifüj edin. Opak duvarlı 96 iyi beyaz bir deneme plakası ve sağlam bir alt ile kuyu başına supernatant 30 mikrolitre aktarın. El yazmasında açıklandığı gibi kinetik işlevini kullanarak çift Parlaklığı ölçmek için Luciferase tsay kitini ve çok modlu plaka okuyucu luminometresini kullanın.Luminescence okuma verilerini istenilen dosya biçimine dışa aktardıktan sonra, enfekte olmamış ve VACV enfekte HeLA hücrelerinde 12A Fluc mRNA'dan gelen göreli çeviri oranını, Fluc değerini iç kontrol Rluc değerine bölerek belirleyin. Bu test, enfekte olmayan ve VACV enfekte hücrelerde 5'Poly(A)litre içeren bir Fluc mRNA'nın çeviri verimliliğini test etmek için kullanılmıştır. Hem enfekte olmayan hem de VACV enfekte hücreler Fluc ve Rluc mRNA ile başarılı bir şekilde transfeced edildi.Fluc'un Rluc tarafından bölünmesi, hücrelerdeki RNA stabilitede transfeksiyon verimliliğini normalleştirdi. 5'Poly(A)litre mRNA içeren enfekte olmayan hücrelere göre VACV enfeksiyonu sırasında çevirisel bir avantaja sahiptir. RNA düzeyi enfekte olmayan ve VACV enfekte hücrelerde mRNA transfeksiyonundan beş saat sonra benzer olduğu için bu durum diferansiyel transfeksiyon verimi veya mRNA stabilitesine bağlı değildi.Bu sadece PCR reaksiyon verimliliğini değil, aynı zamanda güçlendirilmiş DNA gerektiren tüm downstream süreçleri etkileyebilir gibi astar tasarlarken özel dikkat edin. Bu yöntem, cis elemanları tarafından çeviri düzenlemesini hızlı bir şekilde test etmek için önemli bir testtir. Mümkünse, bu yöntem diğer tamamlayıcı deneyler le doğrulanmalıdır.Vaccinia virüsü kullanılırken önlem alınmalı ve ethidium bromür ve fenol gibi kimyasallara maruz kalmaktan kaçınılmalıdır.

in-vitro-transcribed-rna-based-luciferase-reporter-assay-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yöntem, Gaussia lusiferaz (GLuc) geni içeren lineerize edilmiş bir plazmidden hem kaplı hem de kaplanmamış mRNA'nın yüksek verimli in vitro sentezini tanımlamaktadır. RNA saflaştırılır ve kaplanmamış RNA'nın bir kısmı Vaccinia virüsü kaplama enzimi kullanılarak enzimatik olarak kaplanır. Son adımda, mRNA HeLa hücrelerine transfekte edilir ve hücre kültürü süpernatantları lusiferaz aktivitesi için analiz edilir.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Bu videoda, rekombinant lusiferaz ve floresan protein eksprese eden bi-raportör Influenza A virüsü kullanılarak fare modellerinde viral enfeksiyonları izlemek için bir yöntem gösterilmektedir. Bu yöntem, hem in vivo hem de ex vivo çalışmalara olanak tanıyarak araştırmacıların viral dinamikler ve müdahalelerin etkileri hakkında bilgi edinmelerini sağlar.

Viral Enfeksiyonları İzlemek için Bir Luciferase-Floresan Muhabir İnfluenza Virüsü

Bu video, poxvirus ile enfekte olmuş hücrelerde translasyon regülasyonunu incelemek için bir testi göstermektedir. Enfekte olmamış ve virüsle enfekte olmuş hücreler, ateşböceği lusiferaz (Fluc) ve Renilla lusiferaz (Rluc) kodlayan mRNA'larla birlikte transfekte edildi ve Fluc mRNA, 5' Poli(A) lider dizisi içeriyordu. Parçalanmış hücrelere biyolüminesan substratlar ekledikten sonra, lider dizi tarafından verilen virüs ile enfekte olmuş hücrelerde Fluc mRNA'nın translasyonel avantajını belirlemek...

Poxvirus ile Enfekte Hücrelerde Translasyon Regülasyonunu İncelemek İçin Bir Luciferase Reporter Testi

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Burada, hücre bazlı bir raportör gen tahlilini, 3' UTR aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kitaplıkları taramak için değerli bir araç olarak tanımlıyoruz.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Makrofaj hücre hattına, RAW264.7'ye transfeksiyon, hücrenin yabancı maddelere karşı doğal tepkisi nedeniyle zordur. Burada, lusiferaz raportör genlerini RAW264.7 hücrelerine transfekte etmek için nazik ama sağlam bir prosedür tanımladık.

Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte

Hücresel sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri belirlemek için bir vitro bioluminescence tahlil sunulur. Bu yöntem memeli hücre muhabir plazmid istikrarsızlığın luciferase dönem 2 gen düzenleyici denetimi altında ifade kullanır. Sirkadiyen ritim organ özgü etkileri değerlendirmek için diğer hücre tipleri için uyarlanabilir.

Vitro Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

Transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini belirlemek için, çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi kullanarak dizili lentiviral veya retroviral RNAi kitaplıklarını taramak için bir yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, tek bir deneyde yüzlerce adayı taramak için hızlı ve nispeten ucuz bir yol sunar.

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Keşfedin, poxvirus enfekte hücrelerde mRNA translasyon regülasyonunu in vitro transkripsiyonlu luciferase reporter assay ile nasıl çalışılacağını. Bu yöntem, 5'UTR ve 3'UTR gibi cis-elementlerin etkilerini analiz ederek viral translasyon mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

In vitro transkripsiyonu RNA tabanlı luciferase Reporter assay Poxvirus-virüslü hücrelerde çeviri Yönetmeliği çalışma

Daha fazla video keşfet