Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi
13 Mayıs 2019
Bakteriyel Fitness belirlenmesi için bu moleküler tabanlı yaklaşım dijital PCR üzerinden nicelik benzersiz genomik DNA barkodları kullanarak mikroorganizmaların kesin ve doğru algılanmasını kolaylaştırır. Protokol, Salmonella suşları için rekabetçi dizinin hesaplanmasında açıklanmaktadır; Ancak, teknoloji, herhangi bir genetiği değiştirilmiş organizmanın mutlak ölçümlerini gerektiren protokollere kolayca adapte olmaktadır.
Bu teknik, mikroorganizmaların hızlı ve yüksek verimli moleküler tabanlı teknikler kullanarak son derece benzer suşların karışık popülasyonundan doğru ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Sonuçta, suşları arasında yapılacak fitness karşılaştırmalar sağlayan. Tek bir havuzda aynı anda birçok suşları değerlendirme yeteneği, tüm suşları tam olarak aynı koşullara maruz olduğu için iyi-to-well veya organizma-organizma değişkenliğini önemli ölçüde azaltır.
Bu tekniğin uyarlanabilirliği, neredeyse genetik olarak şekillendirilebilir organizmalar ve mikropların doğru bir şekilde ölçülmesi gereken neredeyse tüm deneysel tasarımlar için kullanılmasını sağlar. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi, bakteri kromozomları üzerine genetik belirteçlerin mühendisliği ile başlayın. Biri hariç her barkodu içeren genomik DNA havuzu oluşturun.
Tek kalan barkod içeren genomik DNA ile seyreltme serisi gerçekleştirmek için seyreltici olarak bu havuzu kullanın. Prob tabanlı kimya için tasarlanmış bir dijital PCR supermix kullanmak için üreticinin önerilerine göre yinelenen dijital PCR için reaksiyonlar hazırlayın. Şablon DNA olarak birleştirilmiş genomik DNA'yı kullanın.
Ayrıca, metin protokolünde açıklandığı gibi 20 X primer sondası Master Mix ekleyin. Üreticinin önerilerine göre dijital PCR için çoğaltma kontrol reaksiyonları hazırlayın. Her sonda karışımı için denetim reaksiyonları Şablon yok denetimleri, negatif denetimler ve pozitif denetimlerden oluşmalıdır.
Her barkodlu genomik DNA örneği için dijital PCR reaksiyonları oluşturmak için bu adımları tekrarlayın. Üreticinin talimatlarına göre, bir damlacık jeneratör kullanarak her reaksiyon durumu için damlacıklar oluşturun. Yeni oluşturulan damlacıkları uygun 96 kuyu plakasına aktarın.
5 ile 50 mikrolitre lik çok kanallı pipette 200 mikrolitre lik pipet ucu kullanın. Tüm damlacıklar üretilip transfer edildikten sonra, plakayı folyo plakalı bir mühürle kapatın. Üretici bisiklet koşullarını gerçekleştirmek için termal döngücün tavsiye sini kullanın.
Termobisiklet yapılırken, veri analiz yazılımını örnek ad, deneme türü ve supermix gibi plaka kurulum bilgileriyle programlayın. Ayrıca Hedef 1 adı ve Hedef 1 türünün yanı sıra Hedef 2 adı ve Hedef 2 türünü de içerir. Termobisiklet tamamlandıktan sonra, tamamlanan reaksiyonları damlacık okuyucuya aktarın ve üreticinin talimatlarına göre okuma işlemini başlatın.
Tüm kuyular okunduğunda ve çalışma tamamlandığında, veri çözümleme yazılımını kullanarak QLP veri dosyasını açın. Aynı astar sondası Mastermix kullanan tüm kuyuları seçin. Damlacıklar sekmesinde, hem pozitif hem de negatif damlacıklar da dahil olmak üzere her kuyuda analiz edilen damlacıkların sayısını inceleyin.
10.000 toplam damlacıktan daha az olan kuyuları analizden hariç tut. 1B Genlik sekmesine geçin ve pozitif ve negatif damlacıkların genliklerini inceleyin. 2 farklı popülasyondan oluştuğundan emin olun.
Yazılım içinde, kullanılan her sonda için pozitif ve negatif damlacıklar arasında bir kesme yapmak için eşik özelliğini kullanın. Tüm kuyulara uygun eşikler uygulandıktan sonra, yazılım her reaksiyondaki DNA kopyalarının sayısını hesaplar. Daha fazla analiz kolaylaştırmak için verileri elektronik tabloya aktarın.
Bu değerleri kullanarak, örnekteki her bir benzersiz genomik barkodun ilk kopya numarasını hesaplayın. Negatif kontrol reaksiyonlarından ortalama yanlış pozitif oranı belirleyin ve bu değeri deneysel reaksiyonlarda elde edilen değerlerden çıkarın. Her denemeyi kurarken yapılan seyreltmelere göre değerleri gerektiği gibi çarpın.
Şimdi, rekabetçi endeksi hesaplayarak bir organizmanın göreceli uygunluğunu belirleyin veya barkodlu suş dijital PCR tabanlı niceleme rekabet endeksi iptal. Her zaman noktalarında her barkodlu zorlanma için bu adımı gerçekleştirin. AA barkodu içeren genomik DNA diğer tüm barkodlu genomik DNA'nın arka planında seyreltildi.
Kanal 1, AA barkodiçin FAM sondasını, Kanal 2 ise AO barkod için HEX sondasını temsil eder. Her sondanın sonuçları hem tek tek damlacık floresan genliği hem de seçilen kuyularda bulunan tüm damlacıkların floresan yoğunluğunun sıklığını temsil eden bir histogram olarak sunulur. Her durum için pozitif ve negatif damlacıklar 2 ayrı popülasyon oluşturmalıdır.
Popülasyonlar pozitif ve negatif damlacıkları tanımlamak için eşiközelliği kullanılarak ayrılmalıdır. Eşik değerleri kullanılan problara bağlı olarak değişir, ancak aynı prob karışımını kullanan tüm kuyular aynı eşiklere sahip olmalıdır. Seyreltilmiş AA durumunda, histogram pozitif damlacıklar önemli ölçüde negatif damlacıklar tarafından sayıca az olduğu için sadece tek popülasyon tasvir görünür.
Ancak, 2 farklı popülasyon lar sol panellerde damlacık floresan genliği inceleyerek hala görülebilir. AA barkodlu genomik DNA seyreltildikçe pozitif damlacıklarda azalma oldu, pozitif AO damlacıklarının sayısı sabit kaldı. Tüm kuyulara uygun eşikler uygulandıktan sonra yazılım her reaksiyondaki DNA kopyalarının sayısını hesaplar.
Araştırmanızın bir parçası olarak rutin olarak PCR yaparsanız, model organizmanızın zindeliğini değerlendirmek için bu tekniği gerçekleştirebilirsiniz. Bu yordam normalde upstream deneylerin sonunda sonuçlarını belirlemek için kullanılır. Onun gerçek yarar bakteriyel nicelik güveniyor herhangi bir deney için kolaylık ve çok yönlülük teşvik etmektir.
Biz enfeksiyon bir murine modelisalmonella fitness değerlendirmek için bu tekniği kullanıyoruz. Ayrıca bu teknik laboratuvarımızda diğer patojen mikroorganizmalarla kullanılmak üzere uyarlanmaktadır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu moleküler tabanlı yaklaşım, genomik DNA barkodlarını kullanarak benzer türlerden oluşan karışık popülasyonlardan mikroorganizmaların doğru ölçümünü sağlar. Protokol, türler arasındaki uygunluk karşılaştırmalarını kolaylaştırır ve çeşitli genetik olarak şekillendirilebilir organizmalar için uyarlanabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Moleküler Biyoloji
- Genetik Mühendisliği
Arka Plan
- Mikroorganizmaların ölçümü, rekabetçi uygunluğu anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler, türler arasında değişkenliği artırabilir.
- Dijital PCR, doğru ölçüm için yüksek verimli bir çözüm sunar.
- Genomik DNA barkodlama, türlerin benzersiz tanımlanmasını sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Bakteriyel uygunluğun kesin ölçümü için bir yöntem geliştirmek.
- Türler arasındaki deneysel koşullardaki değişkenliği azaltmak.
- Çeşitli deneysel tasarımlara uygulanabilen esnek bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Bakteryal kromozomlarda genetik markörlerin mühendisliği.
- Benzersiz barkodlu bir genomik DNA havuzu oluşturmak.
- Mikroorganizmaların ölçümü için dijital PCR kullanmak.
- Farklı Salmonella türleri arasındaki rekabetçi indeksleri değerlendirmek.
Ana Sonuçlar
- Mikroorganizmaların doğru ölçümü başarıldı.
- Uygunluk karşılaştırmalarında azaltılmış değişkenlik gözlendi.
- Yöntem, çeşitli genetik olarak şekillendirilebilir organizmalar için uyarlanabilir olduğunu kanıtladı.
- Yüksek verimlilik yetenekleri gösterildi.
Sonuçlar
- Bu teknik, mikrobiyal ölçümün doğruluğunu artırır.
- Türler arasındaki uygunluk karşılaştırmalarının anlamlı olmasını sağlar.
- Protokol, farklı deneysel ihtiyaçlar için esnektir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This digital PCR-based competitive index method addresses a key bottleneck in bacterial fitness assessment by enabling high-throughput, simultaneous quantification of multiple strains in a single competitive assay. By reducing well-to-well variability and eliminating dependence on phenotypic markers, the approach enhances predictive confidence in target validation and lead identification workflows. Its adaptability across genetically malleable organisms supports translational continuity from discovery through preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying fitness differences between wild-type and mutant strains under identical conditions.
- Operational Value: Reduces experimental variability by pooling strains, minimizing well-to-well and organism-to-organism differences.
- Predictive Value: Provides sensitive detection of both high- and low-fitness variants, supporting accurate strain prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, barcode-specific readouts that enable precise comparison of microbial abundance across conditions.
- Operational Value: Uses digital PCR to deliver absolute quantification with high sensitivity and precision across a wide dynamic range.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated barcoded strain pools for reproducible, high-throughput fitness screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports extrapolation from in vitro competition to in vivo models, as demonstrated in murine Salmonella infection studies.
- Mechanistic De-risking: Allows fitness assessment in complex biological contexts, reducing uncertainty in virulence and pathogenesis studies.
- Scalability: Easily adaptable to other pathogens and experimental designs requiring absolute microbial quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling fitness assessment after strain engineering and before lead optimization, particularly in antimicrobial and virulence target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring competitive fitness of isogenic strains in controlled environments.
- Screening: Enables multiplexed fitness profiling of strain libraries through barcode-based quantification.
- Analytics: Generates absolute DNA copy number outputs that feed into competitive index calculations for fitness ranking.
- Translational Research: Connects in vitro fitness data to in vivo pathogenesis models, as shown in murine infection applications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genomic barcoding platform applicable across multiple bacterial targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in fitness measurements by reducing technical noise and marker limitations.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput through standardized digital PCR workflows and pooled strain formats.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by delivering reliable fitness data with fewer replicates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on quantitative fitness profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic engineering to chromosomally integrate unique DNA barcodes without affecting fitness.
- Dependent on access to digital PCR instrumentation and compatible supermix for probe-based detection.
- Necessitates standardized thresholding and droplet analysis protocols across wells and experiments.
- Requires careful dilution series design and false positive rate subtraction from control reactions.
- Adaptation to new organisms depends on chromosomal modification efficiency and barcode insertion site neutrality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Validate the Sensitivity and Specificity of Each Primer-probe Set for Each Genomic Barcode Using Digital PCR
3:09
Analyze Digital PCR Data and Calculate Absolute Copy Numbers
4:52
Results: Representative Digital PCR Results of Diluted AA-barcoded gDNA
6:28
Conclusion
