Farede Birden Fazla Organdan Zika Virüsünün İzolasyon ve Nicelikselleştirilmesi

Bu videoda, zika enfeksiyonunun Murine modelini kullanarak viral bir enfeksiyonun etkisini ve bunun sonucunda ortaya çıkan immünolojik yanıtı sorgulamak için tasarlanmış bir dizi prosedürü açıklıyoruz. Bu protokol önemli, çünkü bir virüsün vücuda ne kadar yayıldığını belirleyerek, fiziksel engelleri tersine çevirerek ve dokulara erişerek mekanik bir enfeksiyon ve bağışıklık anlayışı geliştirmemize olanak sağlar. Bu teknikler viral patogenezin ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlar ve aşılar veya terapötikler tarafından sağlanan koruma mekanizmasını inceleme olanağı sağlar.

Burada farelerin Zika virüs enfeksiyonu kullanarak bu yöntemi göstermek, ancak bu yöntem Dang virüsü ve Chikungunya virüsü gibi alfavirüsler gibi diğer flaviviruses dahil viral enfeksiyonlar bir dizi uygulanabilir. Merkezi sinir sisteminin organları hasat zor olabilir, bu yüzden bir kişi için küçük bir deney planlamak için önemlidir, ve önceden teknikleri uygulamaya hazır olmak. Bu protokol, deneysel verileri görselleştirme, yakalama ve depolama yeteneği ile küçük hayvan modelleri içinde viral yayılmanın hızlı bir şekilde diseksiyonuna olanak sağlar.

Deneycinin merkezi sinir sistemi organlarını nasıl hasat edineceklerini anlamasını sağlamak için bu yöntemi görsel olarak göstermek önemlidir. Ayrıca hücre biraraya gelen düzeyini ve viral foci yoğunluğunu görmek önemlidir. Başlamak için, enfekte farenin postkaldırmak için forceps kullanın.

Makas ile farenin başını decapitate, kol ve bacaklar kaldırılması takip. Beyni hasat etmek için, tırtıklı La Grange makasını kullanarak kafatasını foramen magnumundan kes. Kafatasını ponplarla soyup spatulayla beyni dışarı çıkar.

Güçlü körplü makas kullanarak, omurga çevreleyen kemik kaldırmak, sonra lomber düzeyde vertebrafori açığa çıkarmak için pelvik kemik boyunca kesti. Sonra, omurilik çevreleyen mümkün olduğunca çok kas çıkarın. Dikkatle, iğnenin beli ucunu vertebraforamen'in içine yerleştirin, iğnenin omur gövdesine izinsiz girmesini önlemek için aşırı basınçtan kaçınArak.

Vertebral vücut ve iğne üzerinde baskı uygulamak için güçlü tutun ve petri kabına kordon uçıkarmak için şırınga piston basın. Hemen etiketli tüp omurilik transferi, ve daha fazla homojenizasyon için kuru buz banyosu yerleştirin. Homojenizasyon için, bir mililitre DMEM ekleyin ve numuneyi beadBeater'da homojenize edin.

Organların homojenleştirilmesini sağladıktan sonra, santrifüj ve aliquot örnekleri buz üzerinde ve eksi 80 santigrat derece de gerekli kadar saklayın. Test günü, eksi 80 santigrat derece dondurucudan homojenize örnekleri çıkarın ve çözülmelerine izin verin. Buz daki numunelerle, Zika virüsünü seyreltme plakasının ilk kuyusuna on kat seyreltin ve her seferinde uçlarını değiştirerek plakadan on kat seri seyreltme yapmak için çok kanallı bir pipet kullanın.

180 mikrolitre lik büyüme ortamına 20 mikrolitre numune ekleyerek, her seyreltme arasındaki pipet uçlarını değiştirin. Virohücreleri kaplayan hazırlanmış düz alt 96 kuyulu plakadan ortamı çıkararak odak şekillendirme plakasını hazırlayın. Tek katmanın kurumasını önlemek için viroplate'teki her kuyuya hemen 100 mikrolitre virüs seyreltme ekleyin.

En düşükten en yüksek konsantrasyona eklemek için aynı ipuçları kümesini kullanın. Kaya plakası yan yana 2-4 kez ve 37 santigrat derecede bir ila iki saat boyunca %5 karbondioksit le kuluçkaya yatırın. Oda sıcaklığına% 2 metilselüloz Kadar ısıtın.

Daha sonra, büyüme ortamındaki %2'lik metilselüloz çözeltisini yaklaşık 2'ye bir oranında seyreltin. Kuluçkadan sonra, 96 kuyulu plakaların her kuyuya 125 mikrolitre metilselüloz büyüme ortamı ekleyin. 32-40 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede tekrar kuluçkaya yat.

Virohücreleri düzeltmek için, bir biyogüvenlik kabininde 96-iyi plakalar her kuyuda metilselüloz tabakasının üstüne% 5 paraformaldehit 50 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 60 dakika kuluçkaya yat. Alternatif olarak, Parafilm ile plakaları kaplayın ve bir gecede dört derece santigrat yerleştirin.

Bundan sonra, bindirme kaldırmak için bir pipet kullanın ve biyogüvenlik kabini içinde tek kullanımlık bir kap içine hücreleri kapalı medya. Kuyu başına 150 mikrolitre PBS ile hafifçe yıkayın. PBS'yi plakalardan çıkarın ve plakayı biyogüvenlik kabininden çıkarın.

PBS yıkama iki kez tekrarlayın, sonra iyi bir kez FFA yıkama tampon başına 150 mikrolitre ekleyin ve sabit hücreleri permeabilize beş ila 10 dakika oda sıcaklığında bırakın. Daha sonra, enfeksiyonu tespit etmek için birincil Zika antikorkullanın. FFA boyama tamponu mililitre başına bir mikrogram konsantrasyonda birincil antikor 4G2 hazırlayın.

Flick FFA yıkama tampon plakaları, ve her kuyuya FFA boyama tampon birincil antikor 50 mikrolitre ekleyin. Sonra Parafilm, ya da plastik film ile plakaları mühür ve dört derece santigrat gecede kuluçka. FFA boyama tampon 1-5, 000 konsantrasyonda ikincil gitmek anti-fare HRP etiketli antikor hazırlayın.

Antikor çözeltisi çıkardıktan sonra, iyi başına 150 mikrolitre FFA yıkama tampon ile hücreleri üç kez yıkayın. Her seferinde lavaboya basarak yıkama tamponu çıkarın. Hücreleri FFA boyama tamponundaki ikincil antikorla iyi de 50 mikrolitre de lekelendirin ve oda sıcaklığında bir ila iki saat kuluçkaya yatırın.

Bundan sonra, FFA yıkama tampon ile hücreleri üç kez yıkayın, tekrar, lavaboya her zaman flicking tarafından yıkama tampon kaldırarak. Her kuyuya 50 mikrolitre TrueBlue Substrat ekleyin. Noktalar en az arka planla tam olarak tanımlanana kadar 2 ila 15 dakika bekleyin.

Lekeler görünür olduktan sonra, akan suyun kuvvetinden monolayer kalkan bir el kullanarak su ile yavaşça yıkayın. Kağıt havlular üzerine kuru dokunun. Kısa bir süre sonra, her kuyudaki noktaları el ile saymak için bir kesme dürbünü kullanın veya otomatik bir nokta sayacı kullanın.

ImmunoCapture yazılımında, her numune için kuyu başına 20 ila 200 arasında kolayca ayırt edilebilir bir foci ile seyreltme seçin ve yinelenen kuyuların ortalamasını kullanarak milimetre başına odak oluşturan birimlerde titreyi hesaplayın. Bu deneyde Ifnar farelere Zika virüsü deri altında verildikten sonra periferik ve merkezi sinir sistemi dokularında viral yük gösterilmiştir. Algılama sınırı organa bağlı olarak gram başına 100 ila 500 FFU arasındaydı.

Odak oluşturma testini gerçekleştirirken, teknik hatalar optimal olmayan sonuçlara neden olabilir. Organ toksisitesi, karaciğer yüksek konsantrasyontarafından tahrik, töz duyarlılığını değiştirdi. Ne zaman organda viral titretoksisite daha düşüktü, FFA doğru viral titreleri kaydedemedi.

Böbrek hücreleri yüksek organ konsantrasyonu ile toksisite resimli ama düşük organ konsantrasyonlarında viral titreyen tarafından üstesinden geldi. Güçlü pipetleme veya yıkama, tek katmanı kaldırarak, titresonuçlarının yanlış raporlanmasına neden olan verilerin kaybolmasına yol açabilir. Laboratuvar tezgah emici kağıt mevcut lifler veya tüyler, bireysel kuyular kontamine ve otomatik bir sayma programı kullanıyorsanız önemli hatalara neden olabilir.

Hücre yoğunluğu önemli ölçüde bir odak oluşturan tsay başarısını etkileyebilir başka bir konudur. Tetkikin başlangıcında yaklaşık %60'lık bir araya gelen hücreler, %90'lık bir kesişme noktasında ki hücrelerle karşılaştırıldığında, odak oluşturan tayı etkileyen dramatik bir fark göstermiştir. Organ hasadının verimli bir şekilde tamamlanması için deneyin boyutunu ve kapsamını planlamak, işlemin en önemli parçasıdır ve ardından yüksek kaliteli hücrelerle odak oluşturma telbettei başlar.

Bu prosedür birden fazla viral aileler için virüs ölçmek için kullanılmıştır. Bu protokol aynı zamanda terapötik bileşikler için ekrana adapte edilebilir ve nötralize antikor titreleri ölçmek. Bu teknikler canlı virüsü niçin ölçülebilir ve BMBL'de belirtilen kurallara uygun güvenlik adımları atılmalıdır.