Name: Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Keşfedin, doygun mutagenez protokolü kullanarak düzenleyici RNA bağlayıcı proteinler için bağlayıcı siteleri nasıl belirleyeceğinizi öğrenin. Bu yöntem, gen düzenlemesi ve biyomedikal uygulamalarda yüksek zenginleştirme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazar, geçmiş fon için Ulusal Sağlık Enstitüleri teşekkür eder.

NOT: Şekil 1 yinelemeli seçim-amplifikasyon (SELEX) sürecindeki önemli adımların bir özetini sağlar.
1. Rasgele kitaplık şablonu oluşturma
<ol><li>İleri astar 5'- GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3' ve ters astar 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' bir DNA sentezleyicisi üzerinde kimyasal sentez ile sentezleyin. NOT: Astarlar ve rasgele kitaplık ticari olarak sentezlenebilir.</li>
	<li>Synthesize rasgele kütüphane oligonükleotid şablon u 5'- GGTGATCAGATTCTGATCCA(N1... N31)TGAAGCTTGGATCCGTCGC-3' kimyasal sentezile. Yukarıda N olarak gösterilen 31 randomize pozisyon için sentez sırasında dört fosforamiditin equimolar karışımını kullanın. NOT: Kitaplık şablonunun sırası, ileri ve geri astarların bağlanması için 31 rasgele nükleotit (N1-N31) ve yan diziler içerir. İleri astar, in vitro transkripsiyon için T7 RNA polimeraz promotör dizisini (altı çizili) ve klonlama için Bcl1 (italikleştirilmiş) bir kısıtlama sitesini içerir. Ters astar klonlama kolaylaştırmak için restriksiyon enzim siteleri BamH1 ve HindIII (italik) içerir.</li>
</ol>2. DNA rastgele kütüphane havuzunun üretimi
<ol><li>T7 RNA polimeraz promotörünün 1 μM DNA rasgele kitaplık şablonu, 1 μM'lik her astar, 20 mM Tris (pH 8.0), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.1 μg/μL asettylated büyükbaş hayvan serum albumini, 2 adet Taq] içeren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile kütüphaneye takın. /c1> polimeraz ve 200 μM her dNTPs (deoksiguanozin, deoksiadenozin, deoksisitin ve deoksitimidin trifosfat).</li>
	<li>Beş devir denatürasyon, annealing ve uzatma adımlarını (1 dk için 94 °C, 1 dk için 53 °C ve 1 dk için 72 °C) pcr'yi bir uzatma döngüsü (10 dk için 72 °C) kullanın.</li>
</ol>3. Havuz 0 RNA sentezi
<ol><li>100 μL transkripsiyon reaksiyonu12ayarlayın. Mix T7 transkripsiyon tamponu, 1 μM rastgele kütüphane havuzu DNA, 5 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM guanozin trifosfat (GTP), 1 mM her adenozin trifosfat (ATP), sitidin trifosfat (CTP) ve uridin trifosfat (UTP) ve 2 adet/μL T7 RNA polimerpolimeraz. NOT: RNA, T7 veya SP6 RNA polimeraz seçeneği ile ticari olarak kullanılabilen kitleri kullanarak in vitro olarak yazılabilir.</li>
	<li>Yukarıdaki reaksiyon karışımını mikrosentrifuge tüpünde 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Jel% 10 denaturing poliakrilamid jel RNA arındırMak.</li>
	<li>Transkripsiyon reaksiyonuna radyoaktivite (0,5 μL veya daha az α-32P UTP) ekleyerek jel üzerindeki transkriptlerin yerini metilen mavisi veya otoradyografi ile boyayarak belirleyin.<ol>
<li>Bir santrifüj tüp içinde jel dilim yerleştirin ve daha küçük parçalara kırmak, örneğin, bir homogenizer ucu ile. Jel parçalarını batırmak için proteinaz K (PK) tamponunu (100 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 12.5 mM EDTA, %1 Sodyum dodecyl sülfat) ekleyin. Oda sıcaklığında geceleme için 2 saat bir nutator üzerinde tüp bırakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jel enkaz kaldırmak ve tampon çözeltisi kurtarmak için oda sıcaklığında 5 dakika için yüksek hızlı mikrocentrifuge (14.000 rpm veya 16.873 x g) spin.</li>
	<li>Feol-kloroform eşit hacimli ve kloroform ile bir kez örnek girdap iki kez.</li>
	<li>Yukarıdan gelen sulu fazı onda bir sodyum asetat (3,0 M, pH 5,2), 10 μg tRNA veya 20 g glikojen ve etanol (-20 °C'de depolanan 2-3 cilt) ile karıştırın. Tüpleri -80 °C'de 1 saat bekletin.</li>
	<li>Çözeltiyi içeren tüpleri 4 °C'de mikrosentrifuge (14.000 rpm veya 16.873 x g) döndürün. Supernatant'ı dikkatlice atın. RNA peletini %70 etanol ile durula ve 2-5 dakika boyunca spin. Etanol etanolünü dikkatlice durula. RNA peletini hava kurutun.</li>
	<li>Metil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış 50 μL suda RNA peletini çözün. Numuneyi depolama için -20 °C'de bırakın. NOT: RNA'yı, şu anda daha yaygın olarak anonim radyoaktiviteyi kaldırmak ve RNA arınması için hızlı ve daha uygun bir alternatif olarak kullanılan ticari olarak kullanılabilen spin sütunları kullanarak arındırın. DİkKAT: Radyoaktiviteden korunmak için akrilik cam kalkan, eldiven ve diğer önlemleri kullanın.</li>
</ol>4. Protein bağlayıcı reaksiyon ve bağlı RNA ayrılması
<ol><li>Protein ve RNA'nın 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 hacminde 100 μL'lik bir hacimde bağlanmasını gerçekleştirin ve bu son konsantrasyonlara aşağıdaki maddeleri ekleyerek gerçekleştirin: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.09 μg/μL sığır serum albumini, 0.5 birim/μL RNasin, 0.15 μg/μL tNA , 1 mM EDTA ve uygun rekombinant protein (PTB) konsantrasyonu 30 μL. Uygun havuzdan RNA ekleyin. NOT: Birleştirme faktörü U2AF65 genellikle yaklaşık 1-10 nM'lik bağlayıcı bir yakınlığa sahip model intronlarin polipimiridin-yolu/3' splice bölgelerine bağlanır. Bu nedenle, bağlayıcı ilk iki tur kullanılan protein konsantrasyonu 10 kat Üzerinde Kd U2AF65için; SXL ve PTB proteinleri için, bu aralıktaki başlangıç konsantrasyonu sadece en iyi tahminimizdi. Bu, daha düşük yakınlık dizileri de potansiyel olarak bağlı olmasına rağmen, bağlanabilen istenilen RNA türlerini sağlamıştır. 3 ve 4. Bu art arda düşük yakınlık RNA türlerini ortadan kaldırmak için yapıldı.</li>
	<li>25 °C'de yaklaşık 30 dakika boyunca bağlayıcı reaksiyonlar içeren tüpleri bir sıcaklık bloğuna (veya buz üzerinde) yerleştirin.</li>
	<li>Aşağıdaki adımları kullanarak seçim-amplifikasyon ilk 4 tur için bağlı RNA bağlı RNA fraksiyona.<ol>
<li>Numuneyi (100 μL) oda sıcaklığında vakum manifolduna bağlı bir nitroselüloz filtreden süzün. NOT: RNA-protein kompleksi, ancak bağlı olmayan RNA, filtre üzerinde kalır.</li>
		<li>Tutulan RNA ile filtreyi steril bir jiletle parçalar halinde doğrayın; bunları bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Proteinaz K (PK) tamponuna batırılmış filtre parçalarıyla tüpü en az 3 saat (veya bir gecede) hafifçe yuvarlayarak RNA'yı kurtarın.</li>
		<li>RNA örneğini eşit hacimde fenol-kloroform (1:1) ve ardından kloroform un varlığında girdaplayarak deproteinize edin. Oda sıcaklığında 5 dakika yüksek hızda numunesantrifikasyon her zaman sulu faz kurtarın.</li>
		<li>Sodyum asetat (0,1 hacim 3,0 M, pH 5.2) ve etanol (2-3 hacim mutlak etanol, 200 kanıtı) ile karıştırın. Tüpü -80 °C'lik bir dondurucuda 30 dakika bekletin, 10 dakika yüksek hızda santrifüj edin ve yıkama ve kurutma adımlarını (3.8 adım) izleyerek, DEPC ile arıtılmış suda RNA'yı çözündürün. Bu adımlar yukarıda özetlenmiştir (3,6 ila 3,9 adımları).</li>
	</ol></li>
	<li>Proteine bağlı RNA fraksiyonlarını son 2 turiçin bağlanmamış fraksiyonlardan (5 ve 6. Yüksek afinite bağlama dizilerini zenginleştirmek ve tercihen düşük afinite dizilerini kaldırmak için ek seçim basıncı için bağlayıcı reaksiyondaki protein konsantrasyonu (adım 4.1) üç kat daha azaltın.<ol>
<li>Yukarıdaki RNA:protein bağlama (adım 4.1) reaksiyonunu ayarlamadan önce 0.5x TBE tamponunda (Tris-Borate-EDTA) yerli poliakrilamid jeli (%5 ile 60:1 akrilamid:bis-akrilamid oranı) önceden atın. Bu jeli soğuk bir odada (4 °C) 15 dk için 250 V uygulayarak elektrofore edin.</li>
		<li>Pipet yukarıdaki RNA:protein bağlama reaksiyonları (adım 4.1) bu jel farklı kuyulara. NOT: Protein -80 °C'de depolanır ve 20 mM 4-(2-Hidroksietil)piperazin-1-etanesülfonik asit (HEPES), pH 8.0, %20 gliserol, 0.2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), %0.05 NP-40 ve 1 mM dithiothreitol (DTT). 0.5-1.0 mM proteaz inhibitörü fenilmetan sülfonil florür (PMSF) eklenmesi isteğe bağlıdır. Bağlayıcı reaksiyonda, Bu tampon yaklaşık katkıda 6% gliserol, ayrı bir jel yükleme tampon ile karıştırma gerek kalmadan kuyulara numunelerin doğrudan yüklenmesi sağlar.</li>
		<li>250 V'de 250 V'de 1 ila 2 saat boyunca soğuk bir odada (4 °C) jel elektroforezkullanarak bağlanmamış RNA'dan bağlı RNA'yı kesirler. Bu süreç aynı zamanda jel hareketlilik vardiya sataşma olarak da bilinir. NOT: Elektroforez süresi RNA'nın özelliklerine ve bağlanmada kullanılan proteine bağlı olarak değişir.</li>
		<li>Jeli bir X-Ray filmine maruz bırakVe otoradyografi kullanarak bağlı RNA'nın yerini belirleyin. Bağlı RNA ile jel dilimikesi kesin ve bir tüp içine takın.</li>
		<li>3 saat veya bir gecede elüsyon için kullanılan PK tampon ezilmiş jel dilim kuluçka.</li>
		<li>Yukarıda özetlenen 3,5 ile 3,9 adımlarını tekrarlayın. Kısaca, girdap eluted RNA örnek şiddetle önce fenol-kloroform ve daha sonra kloroform ile.</li>
		<li>Kloroform ekstraksiyonundan sonra sodyum asetat ve etanol ile sulu fazı karıştırın. -80 °C'lik dondurucuda kuluçkadan sonra, RNA peletini toplamak için 4 °C'de 5-10 dk döndürün. RNA peletini etanolle yıkayın ve tüpün kapağını açık bırakarak hava kurutun. RNA'yı DEPC ile arıtılmış suda çözün. NOT: Fraksiyoniçin jel mobilite kayması tadına geçiş, örneğin, ilk turda kullanılan nitroselüloz filtresine (veya herhangi bir matrise) bağlanmak için zenginleştirilmiş olabilecek istenmeyen RNA türlerinin ortadan kaldırılmasını sağlar.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyonu
<ol><li>42 °C'de 20 μL reaksiyonu (2 μL 10x RT Tampon, 2 μL AMV ters transkriptaz, 1 μL ters astar, 10 μL RNA, RNa inhibitörü isteğe bağlı) kuluçkaya yatırarak ters transkriptaz ve ters astar kullanarak çözünmüş RNA'dan cDNA sentezin.</li>
	<li>2.1 adımda açıklandığı gibi 20-25 PCR döngüleri kullanarak cDNA'yı yükseltin.</li>
</ol>6. Transkripsiyon ve protein bağlanması
<ol><li>Yukarıdaki bölüm 3-5'te açıklandığı gibi RNA sentezi, protein bağlanması, protein bağlı ve bağlı olmayan fraksiyonun ayrılması işlemini tekrarlayın.</li>
</ol>7. RNA-protein etkileşimlerinin analizi
<ol><li>Her havuzda seçili havuzlar veya tek tek diziler için bağlayıcı yakınlık ve özgüllüğü belirlemek için jel mobilite kayması tayı (adım 4.4) veya filtre bağlama tayı (adım 4.3) kullanın (bkz. adım 8.3).</li>
	<li>Bağlı kesir ve bağlı olmayan fraksiyondaki bantları tespit etmek ve ölçmek için otoradyografografi veya fosfor görüntüleyici kullanın.</li>
</ol>8. Klonlama ve sıralama
<ol><li>Restriksiyon enzimleri Bcl1 ve HindIII ile son PCR DNA ürünlerini 1-2 saat sindirin, uygun şekilde sindirilmiş pGEM3 veya kısıtlama bölgelerini taşıyan diğer plazmidleri 2 saat ten geceye kadar sindirin, ligasyon ürünlerini yetkili bakteri hücrelerine dönüştürün standart moleküler biyoloji prosedürleri kullanılarak ısı şoku veya elektroporasyon13.</li>
	<li>Luria-Bertani (LB) orta ve ampisilin (50 μg/mL) ile agar plakaları üzerinde dönüştürülmüş hücreleri 37 °C'de kaplama kalarak bakterileri bir gecede büyütün. LB sıvı orta ve ampisilin içeren kültür tüplerini aşılamak için kolonileri seçin ve bir gecede sallayarak bir kuluçka makinesinde 37 °C'de büyüyün. Standart plazmid izolasyon protokolü13kullanarak DNA kesici uçları içeren plazmid DNA'ları arındırın. NOT: Plazmid arınması için ticari kitler mevcuttur.</li>
	<li>Dideoxy zincir sonlandırma protokolünü kullanarak, üreticinin14sıralama talimatını izleyerek plazmidleri DNA kesici uçlarla sırala. NOT: Sıralama evde yapılabilir veya ticari olarak yapılabilir.</li>
</ol>9. Sıra hizalama
<ol><li>Mevcut çevrimiçi hizalama araçlarını kullanarak dizileri hizala ve konsensüs bağlama sitesi(ler) edinin (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).</li>
</ol>

<ol><li>Pribnow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+an+RNA+polymerase+binding+site+at+an+early+T7+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).</li>
<li>Breathnach, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+expression+of+eucaryotic+split+genes+coding+for+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).</li>
<li>Wickens, M., Stephenson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+conserved+AAUAAA+sequence%3A+four+AAUAAA+point+mutants+prevent+messenger+RNA+3%27+end+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation.</a> Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+5%27-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li>
<li>Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAcompete+methodology+and+application+to+determine+sequence+preferences+of+unconventional+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins.</a> Methods. 118, 3-15 (2017).</li>
<li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+massively+parallel+SELEX+for+characterization+of+human+transcription+factor+binding+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities.</a> Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).</li>
<li>Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+molecular+discrimination+by+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution molecular discrimination by RNA.</a> Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).</li>
<li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li>
<li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%22">Molecular Cloning</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+polypyrimidine+tract-binding+protein+is+necessary+for+spermatid+individualization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).</li>
<li>Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+RNA+recognition+motif+3+of+U2+snRNA+auxiliary+factor+%28U2AF%2865%29%29+is+essential+in+vivo+but+dispensable+for+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro.</a> RNA. 10 (65), 240-253 (2004).</li>
<li>Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determinants+of+RNA-binding+specificity+of+the+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins.</a> J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).</li>
<li>Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+Sex-lethal+antagonizes+the+splicing+factor+U2AF+to+regulate+alternative+splicing+of+transformer+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA.</a> Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).</li>
<li>Wilson, C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+fluorophore-specific+DNA+aptamer+with+weak+redox+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity.</a> Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).</li>
<li>Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflections+of+a+Darwinian+Engineer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">Reflections of a Darwinian Engineer.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).</li>
<li>McKeague, M., Derosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913(2012).</li>
<li>Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Bind-n-Seq%3A+quantitative+assessment+of+the+sequence+and+structural+binding+specificity+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins.</a> Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).</li>
<li>Szeto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAPID-SELEX+for+RNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RAPID-SELEX for RNA aptamers.</a> PLoS One. 8 (12), e82667(2013).</li>
<li>Rohloff, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Ligands+With+Protein-like+Side+Chains%3A+Modified+Aptamers+and+Their+Use+as+Diagnostic+and+Therapeutic+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201(2014).</li>
<li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-based+multiplexed+proteomic+technology+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery.</a> PLoS One. 5 (12), e15004(2010).</li>
<li>Zhuo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+SELEX+Technology+and+Aptamer+Applications+in+Biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li>
<li>Blind, M., Blank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+Selection+Technology+and+Recent+Advances.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy.</a> Nucleic Acids. 4, e223(2015).</li>
<li>Jijakli, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+selection+world%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The in vitro selection world.</a> Methods. 106, 3-13 (2016).</li>
</ol>

Yazar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan eder.

Nükleik asit bağlayıcı proteinler hayvan ve bitki gelişiminin önemli düzenleyicileridir. SELEX prosedürü için önemli bir gereklilik protein bağlı ve bağlı olmayan RNA fraksiyonları ayırmak için kullanılabilecek bir titregeliştirilmesidir. Prensip olarak, bu töz filtre bağlayıcı tayoz, jel hareketlilik kayması tsay veya rekombinant proteinler, saflaştırılmış proteinler veya protein kompleksleri için bir matris bağlayıcı tsay19 gibi bir in vitro bağlayıcı tsay olabilir. Tsay da öncüleri ve ürünleri ...

Hücre biyolojisinde gen regülasyonu merkezi bir rol oynar. Gen ekspresyonu yolu boyunca bir veya birden fazla adımda genler düzenlenme potansiyeline sahiptir. Bu adımlar transkripsiyon (başlatma, uzama ve sonlandırma) yanı sıra birleştirme, poliadenilasyon veya 3' bitiş oluşumu, RNA ihracat, mRNA çeviri ve birincil transkript çürüme / lokalizasyon içerir. Bu adımlarda, nükleik asit bağlayıcı proteinler gen regülasyonlarını modüle eder. Bu tür proteinler için bağlayıcı alanların belirlenmesi gen kontrolü eğitiminin önemli bir yönüdür. Mutasyonel analiz ve filogenetik dizi karşılaştırması, promotörler, splice siteleri, poliadenilasyon elemanları ve çeviri sinyalleri 1 gibi nükleik asitlerdeki düzenleyici dizileri veya protein bağlayıcı alanları keşfetmek için kullanılmıştır1, 2.000 , 3.2.2 , 4 .
Pre-mRNA birleştirme gen ekspresyonu ve regülasyonu sırasında ayrılmaz bir adımdır. Memeli genlerinin çoğunda, insanlarda da dahil olmak üzere, intronlar vardır. Bu transkriptlerin büyük bir kısmı alternatif olarak birleştirilmiş olup, aynı gen veya primer transkriptten birden fazla mRNA ve protein isoformları üretilir. Bu isoformların hücre biyolojisinde hücreye özgü ve gelişimsel rolleri bulunur. 5' splice sitesi, şube noktası ve polipirimidin-yolu/3' splice sitesi, yönetmeliğe tabi kritik birleştirme sinyalleridir. Olumsuz düzenlemede, başka bir şekilde güçlü bir splice sitesi bastırılır, olumlu düzenlemede ise zayıf bir splice sitesi etkinleştirilir. Bu olayların bir kombinasyonu işlevsel olarak farklı isoforms bir bolluk üretir. RNA bağlayıcı proteinler bu alternatif birleştirme olaylarında kilit rol oynarlar.
Çok sayıda protein olan bağlayıcı site (ler) veya RNA hedefleri5,6tespit edilecektir bilinmektedir. Düzenleyici proteinleri aşağı biyolojik hedeflerine veya dizilerine bağlamak genellikle karmaşık bir süreçtir. Bu tür proteinler için, hedef RNA veya bağlayıcı sitenin belirlenmesi biyolojik fonksiyonlarını tanımlamada önemli bir adımdır. Bağlayıcı bir bölge tanımlandıktan sonra, standart moleküler ve biyokimyasal analizler kullanılarak daha da karakterize edilebilir.
Burada açıklanan yaklaşımın iki avantajı vardır. İlk olarak, ilgi bir protein için daha önce bilinmeyen bir bağlayıcı site belirleyebilirsiniz. İkinci olarak, bu yaklaşımın bir avantajı da aynı anda doygunluk mutagenezi sağlar, aksi takdirde ciltleme site içinde dizi gereksinimleri hakkında karşılaştırılabilir bilgi elde etmek için emek yoğun olacaktır. Böylece, RNA protein bağlayıcı siteleri tanımlamak için daha hızlı, daha kolay ve daha az maliyetli bir araç sunuyor. Başlangıçta, bu yaklaşım (EXponential zenginleştirme ile Ligands Sistematik Evrimi) bakteriyofaj T4 DNA polimeraz (gen 43 protein), kendi mRNA ribozom bağlayıcı site ile örtüşen bağlayıcı site için bağlayıcı site karakterize etmek için kullanılmıştır. Bağlama sitesi,analiz7 için 65.536 randomize varyantı temsil eden 8-baz döngü dizisi içerir. İkinci olarak, yaklaşım da bağımsız olarak farklı boyalar için belirli bağlama siteleri veya aptamers yaklaşık 1013 dizileri8bir havuzdan seçilebilir göstermek için kullanılmıştır. Aslında, bu yaklaşım geniş birçok farklı bağlamlarda aptamers tanımlamak için kullanılmıştır (RNA veya DNA dizileri) proteinler gibi çok sayıda ligands bağlamak için, küçük moleküller, ve hücreler, ve kataliz için9. Örnek olarak, bir aptamer kafein 10 bir metil grubunun varlığı ile farklı iki ksantin türevleri,kafein ve teofilin arasında ayrım yapabilirsiniz. Bu yaklaşımı (SELEX veya yinelemeli seçilim-amplifikasyon) aşağıdaki tartışmanın temelini oluşturacak olan RNA bağlayıcıproteinlerin 11'i birleştirme veya birleştirme düzenlemesinde nasıl işlediğini incelemek için yoğun olarak kullandık.
Rasgele kütüphane: Biz 31 nükleotit rasgele bir kütüphane kullanılır. Rasgele kitaplık için uzunluk dikkate gevşek genel birleştirme faktörü U2AF65 dal noktası sırası ve 3 'splice site arasında bir dizi bağlanır fikrine dayanıyordu. Ortalama olarak, metazoanlarda bu birleştirme sinyalleri arasındaki boşluk 20 ila 40 nükleotit aralığındadır. Başka bir protein Sex-lethal hedef öncesi mRNA, transformatör3 'splice site yakınında kötü karakterize düzenleyici dizi bağlamak için biliniyordu . Böylece, PCR amplifikasyonu ve in vitro transkripsiyon için T7 RNA polimeraz organizatörü ek için izin vermek için restriksiyon enzim siteleri ile astar bağlama siteleri ile çevrili 31 nükleotit, rasgele bir bölge seçti. Teorik kütüphane boyutu veya karmaşıklığı 431 veya yaklaşık 1018idi. Biz aşağıda açıklanan deneyler için rasgele RNA havuzu (~ 1012-1015)hazırlamak için bu kütüphanenin küçük bir kısmını kullandı.

<table><tbody><tr><td>Jel Elektroforez ekipmanları</td><td>Standart</td><td>Standart Cam</td><td></td></tr><tr><td>Plakalar</td><td>Standart</td><td>Standart</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz</td><td>Millipore</td><td>HAWP</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>PROTRAN</td><td></td></tr><tr><td>poliakrilamid jel çözeltileri</td><td>Standart</td><td>Standart</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant PTB</td><td>Laboratuvar Hazırlığı</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Ters Transkriptaz</td><td>NEB</td><td>M0277S</td><td></td></tr><tr><td>Vakum manifoldu</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX1002500</td><td>Milipore 25mm Cam Mikroanaliz</td></tr><tr><td>Vakum Filtresi Vakum manifoldu</td><td>Millipore</td><td>XX2702552</td><td>1225 Örnekleme Vakum Manifoldu</td></tr><tr><td>X-ışını filmleri</td><td>Standart</td><td>Standart</td><td></td></tr></tbody></table>

düzenleyici rna bağlayıcı proteinler için bağlayıcı siteleri belirlemek için sıra alanını keşfetmek

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gen regülasyonu tüm hücrelerde önemli bir rol oynar. Transkripsiyonel, transkripsiyon sonrası (veya RNA işleme), çevirive çeviri sonrası adımlar belirli genleri düzenlemek için kullanılır. Diziye özgü nükleik asit bağlayıcı proteinler, mekansal veya zamansal gen ekspresyonunu kontrol etmek için belirli dizileri hedef ler. Nükleik asitlerdeki bağlanma alanları tipik olarak mutasyonel analiz ile karakterizedir. Ancak, ilgi çok sayıda protein bu tür karakterizasyon için bilinen bir bağlayıcı site var. Burada RNA bağlayıcı proteinler için daha önce bilinmeyen bağlayıcı siteleri tanımlamak için bir yaklaşım açıklar. Randomize sıralı bir havuzla başlayan dizilerin yinelemeli seçimi ve amplifikasyonunu içerir. Bu adım-transkripsiyon, bağlama ve amplifikasyon-zenginleştirilmiş dizileri birkaç tur sonra tercih edilen bir bağlama site (ler) tanımlamak için sıralanır. Bu yaklaşımın başarısı in vitro bağlayıcı tahliller kullanılarak izlenir. Daha sonra, in vitro ve in vivo fonksiyonel tahliller seçilen dizilerin biyolojik alaka değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, proteine bağlı ve bağlı olmayan RNA'ları ayırmak için bir tizin bulunduğu herhangi bir RNA bağlayıcı protein için önceden bilinmeyen bir bağlayıcı sitenin(ler) tanımlanmasını ve karakterizasyonuna olanak tanır.

Aşağıdaki gözlemler başarılı seçim-amplifikasyon (SELEX) göstermektedir. İlk olarak, tekrarlayıcı seçilim-amplifikasyon yaklaşımı için kullanılan proteine bağlanmak için havuz 0 ve seçilen dizileri analiz ettik. Şekil 2, memeli polipirimidin yolu bağlayıcı proteininin (PTB) havuz 0 dizisine zar zor saptanabilir bir bağlanma gösterdiğini, ancak seçilen dizi havuzuna olan yakınlığın yüksek olduğunu göstermektedir. Seçilen havuz için kullanılandan 300 kat daha y...

Dizi özgüllüğü gen regülasyonu için çok önemlidir. Belirli dizileri tanıyan düzenleyici proteinler gen regülasyonu için önemlidir. Bu tür proteinler için fonksiyonel bağlama alanlarının tanımlanması zorlu bir biyolojik sorundur. RNA bağlayıcı protein için bağlayıcı bir alanın tanımlanması için yinelemeli bir yaklaşım burada açıklanmıştır ve tüm RNA bağlayıcı proteinler için geçerlidir.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Protokol, protein bağlayıcı bir alanın doygunluk mutagenezi için kullanılır. Protein bağlayıcı siteniz bilinmiyorsa, bu protokol kullanılarak tanımlanabilir. Bu tekniğin hastalık tanı ve tedavisi ile önemi vardır.Biyomedikal bilimlerdeki tüm potansiyelinin tamamen sömürülmeye devam ettiğine inanıyorum. Bu yöntem, istenilen moleküllerin istenmeyen moleküllerden ayrılabildiği herhangi bir protein veya reaksiyona geniş ölçüde uygulanabilir. Kitaplığın düzgün bir şekilde randomize olduğundan emin olun ve her bağlama ve ayırma adımı sırasında istenilen moleküllerin kat zenginleştirme yüksek olduğundan emin olun.Kelimelerle açıklansa daha iyi gösterilen birkaç adım ve birçok ayrıntı içerir. Bu videoyu izledikten sonra, rasgele bir kitaplık hazırlamak, bir başlangıç RNA havuzu sentezlemek ve yüksek yakınlık ve özel bağlayıcılar elde etmek için ayrı istenen ve istenmeyen molekülleriçin bağlayıcı bir reaksiyon gerçekleştirmek nasıl rahat olmalıdır. İlk olarak, bir DNA sentezleyici üzerinde kimyasal sentez ile ileri astar ve ters astar sentez.Ayrıca, 31 randomize pozisyonlar ile rasgele bir kütüphane oligonükleotid şablonu sentezleyin. Bir PCR tüpünde, tek mikromolar DNA rastgele kitaplık şablonu karıştırın, T7 RNA polimeraz promotörü ve ters astar içeren tek mikromolar ileri astar, pH sekizde 20 milimolar Tris, 1.5 milimolar magnezyum klorür, 50 milimolar potasyum klorür, 1 mikrogram-mililitre asetit esetit li sığır serum albumini, iki adet Takka polimeraz ve 200 mikromolar dNTP'ler. PCR makinesini beş döngü denatürasyon, annealing ve uzatma adımlarıyla ayarlayın ve ardından organizatörü DNA kitaplığına takmak için bir uzatma döngüsü izleyin.T7 transkripsiyon tamponu, tek mikromolar rastgele kütüphane havuzu DNA, beş milimolar DTT, iki milimolar GTP, ATP, CTP ve UTP'nin her biri bir milimolar ve mikrolitre başına iki adet T7 RNA polimeraz içeren 100 mikrolitrelik transkripsiyon reaksiyonu ayarlayın. Şimdi akrilik cam kalkan ve eldiven takın. Otoradyografi için transkripsiyon reaksiyonuna 5 mikrolitre veya daha az alfa-32P UTP ekleyerek radyoaktiviteyi tanıyın.Reaksiyon karışımını mikrosentrifuge tüpünde 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. RNA'yı jel-arındırmak için %10 denaturing poliakrilamid jeli hazırlayın. Numuneleri jelkuyularına yükleyin.Bir x-ray filmi jel maruz ve jel üzerinde transkript yerini belirlemek ve jel dilim kesip. Bir santrifüj tüp jel dilim yerleştirin ve bir homogenizer ucu ile daha küçük parçalara bölün. Jel parçaları batırmak için proteinaz K tampon ekleyin.Oda sıcaklığında en az iki saat boyunca bir nutator üzerinde tüp bırakın. Sonra jel enkaz kaldırmak ve tampon çözeltisi kurtarmak için oda sıcaklığında beş dakika boyunca yüksek hızlı bir mikrosantrifüj spin. Supernatant, girdap ve santrifüj ile tüp içine fenol-kloroform eşit hacimli ekleyin.Ekstraksiyonu fenol-kloroform ile bir kez daha tekrarlayın ve sonra bir kez daha kloroform ile. Daha sonra, proteinaz K tamponunun sulu fazını pH 5.2'de üç molar sodyum asetat 1/10 hacmi, 10 mikrogram tRNA veya 20 mikrogram glikojen ve eksi 20 santigrat derecede depolanan 2-3 cilt etanol ile karıştırın. Tüpü eksi 80 derecede bir saat bekletin.Çözeltiyi içeren tüpü mikrosantrifüjde dört santigrat derecede beş ila 10 dakika döndürün. Supernatant dikkatle atın ve RNA pelet durulamak için% 70 etanol ekleyin. 2-5 dakika dön.Etanol'ü dikkatlice aspire edin ve RNA peletini havayla kurutun. Daha sonra, RNA peletini solubilize etmek için DEPC ile arıtılmış 50 mikrolitre su ekleyin. Numuneyi depoiçin eksi 20 derecede bırakın.Protein ve RNA'yı 100 mikrolitrelik bir reaksiyon hacmine bağlamak için, ilk 50-milimolar potasyum klorür içeren pH 7.5 10-milimolar Tris hidroklorür hazırlamak, bir milimolar DTT, 09-mikrogram-başına mikrolitre sığır serum albumin, 5-adet-başına mikrolitre RNain, 15-mikrogram-başına mikrolitre tRNA, ve bir mili-milli milimomolar EDTA içeren. Daha sonra uygun havuzdan 30 mikrolitre rekombinant protein PTB ve 10 mikrolitre RNA ekleyin. Bağlayıcı reaksiyonları içeren tüpleri 25 santigrat derecede yaklaşık 30 dakika boyunca bir sıcaklık bloğuna yerleştirin.Ardından, bağlı RNA'yı bağlı RNA'yı dört tur seçim ve amplifikasyon ile kesirleyin. İlk olarak, oda sıcaklığındaki 100 mikrolitrelik numuneyi vakum manifolduna bağlı bir nitroselüloz filtreden filtreleyin. RNA-protein kompleksi filtrede kalır.Steril bir jiletle filtreyi parçalara ayırın ve bunları bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Filtre parçalarını proteinaz K tamponuna batırın ve RNA'yı kurtarmak için en az üç saat veya bir gece boyunca bir bardak üzerine yerleştirin. RNA örneğini deproteinize etmek için, eşit hacimde fenol-kloroform, girdap ve oda sıcaklığında beş dakika yüksek hızda santrifüj ekleyin.Sulu faz elde ve kloroform ile tekrar ayıklayın. Bundan sonra, pH 5.2 ve mutlak etanol iki ila üç hacimli üç molar sodyum asetat 1/10 hacmi ile supernatant karıştırın. Tüpü eksi 80 derecelik bir dondurucuda 30 dakika bekletin ve sonra 10 dakika yüksek hızda santrifüj edin.Yıkama ve kurutma adımlarını %70 etanol ile tekrarlayın ve RNA'yı DEPC ile işlenmiş suda çözün. Filtre bağlama teşbinci ilk turdan sonra, üç tur daha gerçekleştirin. Daha sonra, proteine bağlı RNA fraksiyonlarını bağlanmamış fraksiyonlardan ayırmak için iki tur transkripsiyon, bağlama ve amplifikasyon gerçekleştirin.Precast 5x TBE tampon 60-bir akrilamid-bis-akrilamid oranı ile yerli% 5 poliakrilamid jel. Sonra RNA-protein bağlama reaksiyonu ayarlayın. Jeli, 5x TBE tamponu yla dolu bir elektroforez cihazına, 4 derece lik soğuk bir odada yerleştirin.15 dakika boyunca 250 volt uygulayın ve pipet farklı kuyulara bağlama reaksiyonu. Daha sonra bağlı RNA'yı bağlı RNA'dan 250 voltta 1-2 saat çalıştırarak kesirlendirin. Daha sonra, bir x-Ray filmi jel maruz ve otoradyografi kullanarak bağlı RNA yerini belirlemek.Bağlı RNA ile jel dilim kesip ve bir tüp içine takın. Jel dilimini ezin ve proteinaz K tamponuna üç saat veya bir gecede inkübedin. Daha önce açıklandığı gibi fenol-kloroform ve kloroform ile ekstraksiyon tekrarlayın.Çözünmüş RNA'dan cDNA sentezle. İki mikrolitre 10x RT tamponu, iki mikrolitre AMV ters transkriptaz, bir mikrolitre ters astar, beş mikrolitre su ve çözünmüş RNA'nın 10 mikrolitresi dahil olmak üzere 20 mikrolitre reaksiyon hazırlayın. 42 derecede 60 dakika kuluçkaya yat.Daha önce açıklandığı gibi 20 ila 25 PCR döngüleri kullanarak cDNA'yı yükseltin. RNA sentezi, protein bağlanması ve proteine bağlı ve bağlanmamış fraksiyonların ayrılması işlemini tekrarlayın. Protein bağlamaanaliz etmek için, her havuz içinde seçilen havuzları veya bireysel dizileri için bağlayıcı yakınlık ve özgüllük belirlemek için jel hareketlilik kayması analizi veya filtre bağlayıcı tsay kullanın.Bağlı kesir ve bağlı olmayan fraksiyondaki bantları tespit etmek ve ölçmek için otoradyografografi veya fosfor görüntüleyici kullanın. Klonlama ve sıra hizalama ile protokolü devam edin. Bu çalışmada başarılı bir seçim-amplifikasyon sağlanmıştır.300 kat daha yüksek protein konsantrasyonuna sahip memeli polipirimidin yolu bağlayıcı protein, havuz sıfır dizisine zar zor bağlanabildiğini ancak seçilen dizi havuzuna olan yakınlığı gösterir. RNA bağlayıcı proteinlerde tercih edilen veya konsensus bağlayıcı alana sahip seçici-amplifikasyon başarıyla saptanmadı. Rekombinant PTB eklenmesi, hangi bir upstream üç-prime splice siteye bağlanır, alternatif veya downstream üç-prime splice sitenin aktivasyonu yol açar.Buna karşılık, rekombinant hnRNP C eklenmesi her iki üç asal splice sitelerin inbastırılmasına yol açar. Rekombinant genel birleştirme faktörü U2AF65 eklenmesi hnRNP C aracılı üç asal splice site baskı ters. Bu iyi bir randomize kütüphane ve her bağlayıcı adımda yüksek kat zenginleştirme vermek uygun bağlama koşulları başarı için gerekli olduğunu hatırlamak önemlidir.Bu yaklaşımın sonucunu doğrulamak için uygun fonksiyonel tahliller ve in vivo testler kullanılabilir. Gen ekspresyonu alanında bu teknik kullanılarak çok sayıda proteinin işlevleri incelenmiştir. Poliakrilamid ve radyoaktivite ile çalışırken koruma için eldiven ve radyoaktif sızdırmazlık kullanmak önemlidir.

exploring-sequence-space-to-identify-binding-sites-for-regulatory-rna

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

RNA transkript trans etkili RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) çok sayıda aracılığı ile geniş posttranskripsiyonel düzenlemeye tabidir. Burada hassas ve transcriptome geniş bir ölçekte RBPs, RNA bağlayıcı siteleri tanımlamak için genellenememektedir bir yöntem mevcut.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

Bu videoda, ilgilenilen bir hedef protein için spesifik RNA bağlama dizilerini tanımlamak için üstel zenginleştirme (SELEX) yöntemiyle ligandların sistematik evrimini açıklıyoruz. Protein, geniş bir randomize RNA dizileri havuzu ile inkübe edilir ve protein bağlayıcı RNA dizileri izole edilir, PCR ile çoğaltılır ve protein bağlama bölgelerini tanımlamak için dizilenir.

RNA-Protein Etkileşimlerini Tanımlamak için SELEX Tabanlı İn Vitro Bağlanma Testi

Bir RNA açılan protokolü RNA bağlayıcı proteinlere (RBPS) ve kodlama yapmayan ve kodlama RNA arasındaki etkileşimin saptanması için optimize edilmiştir. androjen reseptörü (AR) için bir RNA fragmanı primer kahverengi adipositlerin lystate onun RBP almak için nasıl kullanılacağını göstermek için bir örnek olarak kullanılmıştır.

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile<em&gt; İn Vitro</emAdiposit Kültür&gt; RNA pull-down

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Belirli RNA dizilere protein gen ekspresyonu önemli rol oynarlar. Bu bağlama sitelerin detaylı karakterizasyonu gen düzenlemesi bizim anlamak için önemlidir. Burada, bir tek adım yaklaşım doygunluk mutagenesis RNA protein bağlayıcı sitelerin için kullanılmıştır. Bu yaklaşım RNA içinde tüm protein bağlayıcı siteleri için geçerlidir.

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Bu yöntemle, RNA bağlayıcı proteinlerin (RBPs) bağlayıcı benzeşimini, bakteriyel hücrelerde basit, canlı ve muhabir bir tahlil kullanarak bilat ve bileksiz bağlayıcı sitelere göre ölçeceğiz. Tahlil bir muhabir geni baskının dayanmaktadır.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

Burada, endojen RNA bağlayıcı siteleri veya RNA: protein (RNP) kompleksler "ayak izleri" mammalin hücrelerden zenginleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım RNP alt paketleri iki immünoprecipitations içerir ve bu nedenle tandem RNA immünopresipitasyon dubbed (ripit).

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

MAPS teknolojisi, belirli bir düzenleyici RNA in vivo'nun targetom'ını incelemek için geliştirilmiştir. İlgi çekici sRNA, RNA ortaklarının birlikte arındırılmasını ve RNA dizilimi ile tanımlanmasını sağlayan bir MS2 aptamer ile etiketlenmiştir. Bu modifiye protokol özellikle Gram-pozitif bakteriler için uygundur.

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Keşfedin, doygun mutagenez protokolü kullanarak düzenleyici RNA bağlayıcı proteinler için bağlayıcı siteleri nasıl belirleyeceğinizi öğrenin. Bu yöntem, gen düzenlemesi ve biyomedikal uygulamalarda yüksek zenginleştirme sağlar.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Daha fazla video keşfet