Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Protokol, protein bağlayıcı bir alanın doygunluk mutagenezi için kullanılır. Protein bağlayıcı siteniz bilinmiyorsa, bu protokol kullanılarak tanımlanabilir. Bu tekniğin hastalık tanı ve tedavisi ile önemi vardır.

Biyomedikal bilimlerdeki tüm potansiyelinin tamamen sömürülmeye devam ettiğine inanıyorum. Bu yöntem, istenilen moleküllerin istenmeyen moleküllerden ayrılabildiği herhangi bir protein veya reaksiyona geniş ölçüde uygulanabilir. Kitaplığın düzgün bir şekilde randomize olduğundan emin olun ve her bağlama ve ayırma adımı sırasında istenilen moleküllerin kat zenginleştirme yüksek olduğundan emin olun.

Kelimelerle açıklansa daha iyi gösterilen birkaç adım ve birçok ayrıntı içerir. Bu videoyu izledikten sonra, rasgele bir kitaplık hazırlamak, bir başlangıç RNA havuzu sentezlemek ve yüksek yakınlık ve özel bağlayıcılar elde etmek için ayrı istenen ve istenmeyen molekülleriçin bağlayıcı bir reaksiyon gerçekleştirmek nasıl rahat olmalıdır. İlk olarak, bir DNA sentezleyici üzerinde kimyasal sentez ile ileri astar ve ters astar sentez.

Ayrıca, 31 randomize pozisyonlar ile rasgele bir kütüphane oligonükleotid şablonu sentezleyin. Bir PCR tüpünde, tek mikromolar DNA rastgele kitaplık şablonu karıştırın, T7 RNA polimeraz promotörü ve ters astar içeren tek mikromolar ileri astar, pH sekizde 20 milimolar Tris, 1.5 milimolar magnezyum klorür, 50 milimolar potasyum klorür, 1 mikrogram-mililitre asetit esetit li sığır serum albumini, iki adet Takka polimeraz ve 200 mikromolar dNTP'ler. PCR makinesini beş döngü denatürasyon, annealing ve uzatma adımlarıyla ayarlayın ve ardından organizatörü DNA kitaplığına takmak için bir uzatma döngüsü izleyin.

T7 transkripsiyon tamponu, tek mikromolar rastgele kütüphane havuzu DNA, beş milimolar DTT, iki milimolar GTP, ATP, CTP ve UTP'nin her biri bir milimolar ve mikrolitre başına iki adet T7 RNA polimeraz içeren 100 mikrolitrelik transkripsiyon reaksiyonu ayarlayın. Şimdi akrilik cam kalkan ve eldiven takın. Otoradyografi için transkripsiyon reaksiyonuna 5 mikrolitre veya daha az alfa-32P UTP ekleyerek radyoaktiviteyi tanıyın.

Reaksiyon karışımını mikrosentrifuge tüpünde 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. RNA'yı jel-arındırmak için %10 denaturing poliakrilamid jeli hazırlayın. Numuneleri jelkuyularına yükleyin.

Bir x-ray filmi jel maruz ve jel üzerinde transkript yerini belirlemek ve jel dilim kesip. Bir santrifüj tüp jel dilim yerleştirin ve bir homogenizer ucu ile daha küçük parçalara bölün. Jel parçaları batırmak için proteinaz K tampon ekleyin.

Oda sıcaklığında en az iki saat boyunca bir nutator üzerinde tüp bırakın. Sonra jel enkaz kaldırmak ve tampon çözeltisi kurtarmak için oda sıcaklığında beş dakika boyunca yüksek hızlı bir mikrosantrifüj spin. Supernatant, girdap ve santrifüj ile tüp içine fenol-kloroform eşit hacimli ekleyin.

Ekstraksiyonu fenol-kloroform ile bir kez daha tekrarlayın ve sonra bir kez daha kloroform ile. Daha sonra, proteinaz K tamponunun sulu fazını pH 5.2'de üç molar sodyum asetat 1/10 hacmi, 10 mikrogram tRNA veya 20 mikrogram glikojen ve eksi 20 santigrat derecede depolanan 2-3 cilt etanol ile karıştırın. Tüpü eksi 80 derecede bir saat bekletin.

Çözeltiyi içeren tüpü mikrosantrifüjde dört santigrat derecede beş ila 10 dakika döndürün. Supernatant dikkatle atın ve RNA pelet durulamak için% 70 etanol ekleyin. 2-5 dakika dön.

Etanol'ü dikkatlice aspire edin ve RNA peletini havayla kurutun. Daha sonra, RNA peletini solubilize etmek için DEPC ile arıtılmış 50 mikrolitre su ekleyin. Numuneyi depoiçin eksi 20 derecede bırakın.

Protein ve RNA'yı 100 mikrolitrelik bir reaksiyon hacmine bağlamak için, ilk 50-milimolar potasyum klorür içeren pH 7.5 10-milimolar Tris hidroklorür hazırlamak, bir milimolar DTT, 09-mikrogram-başına mikrolitre sığır serum albumin, 5-adet-başına mikrolitre RNain, 15-mikrogram-başına mikrolitre tRNA, ve bir mili-milli milimomolar EDTA içeren. Daha sonra uygun havuzdan 30 mikrolitre rekombinant protein PTB ve 10 mikrolitre RNA ekleyin. Bağlayıcı reaksiyonları içeren tüpleri 25 santigrat derecede yaklaşık 30 dakika boyunca bir sıcaklık bloğuna yerleştirin.

Ardından, bağlı RNA'yı bağlı RNA'yı dört tur seçim ve amplifikasyon ile kesirleyin. İlk olarak, oda sıcaklığındaki 100 mikrolitrelik numuneyi vakum manifolduna bağlı bir nitroselüloz filtreden filtreleyin. RNA-protein kompleksi filtrede kalır.

Steril bir jiletle filtreyi parçalara ayırın ve bunları bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Filtre parçalarını proteinaz K tamponuna batırın ve RNA'yı kurtarmak için en az üç saat veya bir gece boyunca bir bardak üzerine yerleştirin. RNA örneğini deproteinize etmek için, eşit hacimde fenol-kloroform, girdap ve oda sıcaklığında beş dakika yüksek hızda santrifüj ekleyin.

Sulu faz elde ve kloroform ile tekrar ayıklayın. Bundan sonra, pH 5.2 ve mutlak etanol iki ila üç hacimli üç molar sodyum asetat 1/10 hacmi ile supernatant karıştırın. Tüpü eksi 80 derecelik bir dondurucuda 30 dakika bekletin ve sonra 10 dakika yüksek hızda santrifüj edin.

Yıkama ve kurutma adımlarını %70 etanol ile tekrarlayın ve RNA'yı DEPC ile işlenmiş suda çözün. Filtre bağlama teşbinci ilk turdan sonra, üç tur daha gerçekleştirin. Daha sonra, proteine bağlı RNA fraksiyonlarını bağlanmamış fraksiyonlardan ayırmak için iki tur transkripsiyon, bağlama ve amplifikasyon gerçekleştirin.

Precast 5x TBE tampon 60-bir akrilamid-bis-akrilamid oranı ile yerli% 5 poliakrilamid jel. Sonra RNA-protein bağlama reaksiyonu ayarlayın. Jeli, 5x TBE tamponu yla dolu bir elektroforez cihazına, 4 derece lik soğuk bir odada yerleştirin.

15 dakika boyunca 250 volt uygulayın ve pipet farklı kuyulara bağlama reaksiyonu. Daha sonra bağlı RNA'yı bağlı RNA'dan 250 voltta 1-2 saat çalıştırarak kesirlendirin. Daha sonra, bir x-Ray filmi jel maruz ve otoradyografi kullanarak bağlı RNA yerini belirlemek.

Bağlı RNA ile jel dilim kesip ve bir tüp içine takın. Jel dilimini ezin ve proteinaz K tamponuna üç saat veya bir gecede inkübedin. Daha önce açıklandığı gibi fenol-kloroform ve kloroform ile ekstraksiyon tekrarlayın.

Çözünmüş RNA'dan cDNA sentezle. İki mikrolitre 10x RT tamponu, iki mikrolitre AMV ters transkriptaz, bir mikrolitre ters astar, beş mikrolitre su ve çözünmüş RNA'nın 10 mikrolitresi dahil olmak üzere 20 mikrolitre reaksiyon hazırlayın. 42 derecede 60 dakika kuluçkaya yat.

Daha önce açıklandığı gibi 20 ila 25 PCR döngüleri kullanarak cDNA'yı yükseltin. RNA sentezi, protein bağlanması ve proteine bağlı ve bağlanmamış fraksiyonların ayrılması işlemini tekrarlayın. Protein bağlamaanaliz etmek için, her havuz içinde seçilen havuzları veya bireysel dizileri için bağlayıcı yakınlık ve özgüllük belirlemek için jel hareketlilik kayması analizi veya filtre bağlayıcı tsay kullanın.

Bağlı kesir ve bağlı olmayan fraksiyondaki bantları tespit etmek ve ölçmek için otoradyografografi veya fosfor görüntüleyici kullanın. Klonlama ve sıra hizalama ile protokolü devam edin. Bu çalışmada başarılı bir seçim-amplifikasyon sağlanmıştır.

300 kat daha yüksek protein konsantrasyonuna sahip memeli polipirimidin yolu bağlayıcı protein, havuz sıfır dizisine zar zor bağlanabildiğini ancak seçilen dizi havuzuna olan yakınlığı gösterir. RNA bağlayıcı proteinlerde tercih edilen veya konsensus bağlayıcı alana sahip seçici-amplifikasyon başarıyla saptanmadı. Rekombinant PTB eklenmesi, hangi bir upstream üç-prime splice siteye bağlanır, alternatif veya downstream üç-prime splice sitenin aktivasyonu yol açar.

Buna karşılık, rekombinant hnRNP C eklenmesi her iki üç asal splice sitelerin inbastırılmasına yol açar. Rekombinant genel birleştirme faktörü U2AF65 eklenmesi hnRNP C aracılı üç asal splice site baskı ters. Bu iyi bir randomize kütüphane ve her bağlayıcı adımda yüksek kat zenginleştirme vermek uygun bağlama koşulları başarı için gerekli olduğunu hatırlamak önemlidir.

Bu yaklaşımın sonucunu doğrulamak için uygun fonksiyonel tahliller ve in vivo testler kullanılabilir. Gen ekspresyonu alanında bu teknik kullanılarak çok sayıda proteinin işlevleri incelenmiştir. Poliakrilamid ve radyoaktivite ile çalışırken koruma için eldiven ve radyoaktif sızdırmazlık kullanmak önemlidir.