CRISPR Plazmidlerinin Yapımı ve Çift Luciferase Muhabir Sistemi Ile Memeli Hücrelerinde Nakavt Etkinliğinin Saptanması
5 Aralık 2020
Burada, hem CRISPR enzimini hem de ilişkili tek kılavuz RNA'ları (sgRNA) ifade eden verimli plazmid üretimi için aerodinamik bir yöntemi açıklayan bir protokol salıyoruz. Memeli hücrelerinin bu sgRNA/CRISPR vektörü ve çift iplikli break onarımını inceleyen çift luciferase muhabiri vektörü ile birlikte transfeksiyonu nakavt etkinliğinin değerlendirilmesini sağlar.
Bu protokol, verimli sgRNA vektörlerinin üretilmesi ve optimizasyonundaki önemli adımları açıklar. Aday sgRNA'nın ön ivmesi göreceli zamanı ve çıkarımları hedeflemektedir. Bu protokolün en büyük avantajı, endojen genleri düzenlemeden her bir sgRNA için DNA kodlama gösterimlerinin analiz edilebilmektedir.
Bu ön seçim yöntemi, çift iplikli molalar yoluyla diğer gen düzenleme önlemlerine de uygulanabilir. Lyophilized oligonükleotidleri çift distile suda 10 mikromolar son konsantrasyonuna seyrelterek başlayın. İnce duvarlı PCR tüpünde ileri ve ters oligonükleotidleri bire bir oranında ekstra tampon eklemeden karıştırın.
Karışımı 95 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın, sonra sıcaklığı 10 dakika boyunca 72 dereceye düşürün. Oligonükleotid karışımını PCR makinesinden çıkarın ve oda sıcaklığında soğumasını bekleyin. Bbs1 ile pX330-xCas9 vektörü sindirmek için vektör, enzim ve sindirim tamponunu 50 mikrolitrelik bir hacimde birleştirin ve reaksiyonu 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın.
Hücre dönüşümü yaptıktan sonra, LB plakabeş ila 10 bakteri kolonileri seçin ve 1.5 mililitretüp 60 miligram ampisilin ile LB medya bir mililitre aşılamak için her birini kullanın. Sonra tüpleri bir döner çalkalayıcının üzerine 2-3 saat kuluçkaya yatırın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi rekombinant plazmidleri taramak için PCR'yi gerçekleştirin, ardından ürünleri 10 volt santimetrenin altında %2'lik Agarose jel üzerinde çalıştırın.
Pozitif plazmidleri tanımladıktan sonra, uygun bir hücre hattını eş-transfect için, bir muhabir vektörü ile birlikte kullanın. Hücreleri lyse için, kültürlü hücrelerden büyüme ortamı kaldırın. Kültür kabının yüzeyini PBS ile hafifçe yıkayın ve hücre mono tabakasını tamamen kapsayacak şekilde her kültüre 100 mikrolitre PLB dağıtın.
Plaka 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yada, daha sonra daha fazla işleme veya depolama için bir tüp veya şişe için lysate aktarın. Çift luciferase tayini gerçekleştirmek için, luminometreleri iki saniyeönceden okuma gecikmesi ve ardından 10 saniyelik bir ölçüm süresi sağlamak üzere programlayın. Daha sonra, 100 mikrolitre luciferase asay reaktifini uygun sayıda luminometre tüpüne dağıtın.
Luminometre tüpüne 20 mikrolitre hücre lisatını dikkatlice ekleyin ve iki veya üç kez borulandırarak karıştırın. Tüpü luminometreye yerleştirin ve okumayı başlatın. Örnek tüpü luminometreden çıkarın.
Karıştırmak için kısa bir süre stop reaktif ve girdap 100 mikrolitre ekleyin. Örneği luminometreye geri verin ve okumayı başlatın. Firefly Luciferase aktivitesine normalleştirilen Renilla Luciferase etkinliğini, özellikle ekranda görüntülenen oranın karşılıklı olarak kaydedin.
Bittiğinde reaksiyon tüpünü atın. Bu yöntem koyun DKK2 Exon 1 için üç sgRNA vektörü oluşturmak için kullanılmıştır. sgRNA ve xCas9 ifade vektörleri vektör omurgasının önceden sindirilmesi ve ardından çift iplikli DNA parçalarının annealing oligo çiftleri aracılığıyla bir dizi kısa, çift iplikli DNA parçasıile bağlanması ile oluşturulmuştür.
Yedi bakteri kolonisi spesifik primer çifti güdümlü PCR ile tarandı ve pozitif koloniler tespit edildi. pX330-xCas9 T1, T2 ve T3'ün gen hedefleme kapasiteleri aynı anda çift luciferase testi ile tespit edildi. Son sgRNA vektörü en yüksek algılama sinyalini sergiledi ve daha sonra koyun geni düzenleme araştırmalarında kullanıldı.
Bu protokolü takiben, bir T7EI tsay veya Ribonuclease test yapılabilir. Bu ek önlemler endojen genlerin düzenlenmesi daha doğru izlenimler verir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, CRISPR enzimi ve ilişkili tek kılavuz RNA'yı (sgRNA) eksprese eden plazmitlerin üretimi için basitleştirilmiş bir yöntem tanımlar. Çift lükferaz raportör vektörü ile birlikte transfeksiyon aracılığıyla nokta çıkartma etkinliğinin değerlendirilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gen düzenleme
- CRISPR teknolojisi
- Plazmid yapımı
Arka Plan
- sgRNA vektörlerinin verimli üretimi, gen düzenleme için kritik öneme sahiptir.
- Protokol, endojen genler düzenlenmeden DNA kodlama izlerinin analizini sağlar.
- sgRNA hedeflerinin ön seçilmesi düzenleme etkinliğini artırabilir.
- Bu yöntem çeşitli gen düzenleme önlemlerine uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Etkili sgRNA vektörleri üretmek için bir protokol sağlamak.
- Gen düzenleme sürecinde sgRNA etkinliği analizini kolaylaştırmak.
- Nokta çıkartma etkinliğinin değerlendirilmesi sürecini basitleştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Liofilizasyon edilmiş oligonükleotidlerin 10 mikromolar son konsantrasyonuna seyreltilmesi.
- İleri ve geri oligonükleotidlerin bir PCR tüpünde karıştırılması.
- Memeli hücrelerine sgRNA/CRISPR vektörü ve raportör vektörü ile birlikte eş-transfeksiyon.
- Çift zincir kırık onarım etkinliğinin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Protokol, sgRNA vektörlerinin verimli üretimine izin verir.
- Nokta çıkartma etkinliği etkin bir şekilde değerlendirilebilir.
- sgRNA hedeflerinin ön seçimi düzenleme sürecini artırır.
- Yöntem, diğer gen düzenleme stratejileri için uygulanabilir.
Sonuçlar
- Bu protokol, sgRNA vektörlerini üretmek için güvenilir bir yaklaşım sunar.
- Endojen genleri değiştirmeden gen düzenleme analizini kolaylaştırır.
- Yöntem, gen düzenlemede çeşitli uygulamalar için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Efficient sgRNA vector construction and rapid knockout efficiency assessment are critical for accelerating CRISPR-based target validation in early discovery pipelines. The dual luciferase reporter system enables quantitative, pre-endogenous screening of candidate sgRNAs, reducing time and resource expenditure before full-scale gene editing. This workflow supports portfolio triage by prioritizing sgRNAs with the highest editing potential for downstream applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid preselection of sgRNAs with high editing efficiency before endogenous gene targeting.
- Supports functional target validation by quantifying double-strand break repair via reporter assays.
- Reduces mechanistic ambiguity by isolating sgRNA performance in a controlled system.
- Facilitates predictive confidence in CRISPR reagent selection for subsequent studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative readout for sgRNA activity using dual luciferase ratios.
- Improves assay reproducibility and comparability across candidate sgRNAs.
- Enables scalable screening of multiple sgRNA constructs in parallel.
- Prepares validated sgRNA/CRISPR vectors for downstream gene editing workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sgRNA selection with translational goals by ensuring only high-efficiency reagents advance.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by minimizing failed edits in disease-relevant models.
- De-risks preclinical studies by front-loading sgRNA efficacy assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling efficient sgRNA selection prior to endogenous gene editing and downstream functional studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway interrogation by enabling rapid sgRNA efficacy screening.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible luciferase-based outputs for sgRNA comparison.
- Analytics: Provides normalized dual luciferase ratios to objectively rank sgRNA performance.
- Translational Research: Ensures only validated, high-performing sgRNAs progress to disease-relevant or preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for sgRNA validation across multiple gene targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in CRISPR reagent selection.
- Operational Value: Standardizes sgRNA screening and accelerates vector construction timelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by prioritizing high-efficiency sgRNAs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and reduces late-stage failure due to ineffective gene editing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell transfection, and luciferase assay execution.
- Needs access to PCR, gel electrophoresis, and luminometer instrumentation.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data normalization.
- Adaptable to various mammalian cell lines and gene targets with appropriate optimization.
- Dependent on accurate oligonucleotide design and vector preparation for reproducible results.
