Name: In Vitro ELISA Testi Kuduz Aşısı Potens Değerlendirmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Öğrenin kuduz aşısı potens değerlendirmek için in vitro ELISA yöntemini. Bu teknik, hayvan testlerini azaltarak yüksek duyarlılıkta ve bir günde sonuç verir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Sylvie Morgeaux ve Dr. Jean-Michel Chapsal, aşı serileri konusunda ELISA titreşmelerini oluşturmak ve uluslararası çalıştaylar ve işbirlikçi çalışmalar düzenlemek için temel katılımları için kabul edilmelidir. Sabrina Kali'ye el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Dr. Pierre Perrin mAb-D1'in izolasyon ve karakterizasyonundan sorumluydu. Bu çalışma ağırlıklı olarak Institut Pasteur finansmanı tarafından desteklenmiştir.

1. Güvenlik önlemleri
NOT: Bu yöntem hem canlı RABV hem de inaktive aşı için geçerlidir.
<ol><li>İyi Laboratuvar Uygulamaları ve Güvenlik prosedürleri kullanın.</li>
	<li>Tek kullanımlık palto, eldiven, maske, gözlük vb. dahil olmak üzere yeterli Kişisel Koruma Ekipmanı (PPE) giyin.</li>
	<li>Canlı virüs titre edildiğinde, sınıf II biyolojik güvenlik kabini kullanın.<ol>
<li>Numunelerle temas eden herhangi bir malzemeyi (reaktifler, yıkama solüsyonları, vb.) enfeksiyöz malzeme olarak düşünün.</li>
		<li>Dekontaminasyon için 30 dakika boyunca çamaşır suyu çözeltisi (sodyum hipokloritin %2,5'i) içine daldırarak kirlenmiş malzemeyi tedavi edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İyi Laboratuvar Uygulamasına uygun olarak kimyasalları sapla.</li>
</ol>2. Hazırlık
<ol><li>Mümkün olduğunca analitik sınıf reaktifler kullanın.</li>
	<li>Kaplama tamponu/karbonat tamponu, passiv tamponu, dilüent ve sitrat tamponunun(Tablo 1),0,45 veya 0,22 μm filtrelerden süzülüğe taze çözeltiler hazırlayın ve analitik saflıklarını korumak için kullanımdan önce 4 °C'de bir gün saklayın.</li>
	<li>Reaktiflerin kullanımdan 30 dk önce oda sıcaklığına (+18 °C ila +25 °C) ulaşmasını bekleyin ve kullanımdan önce hafif bir karıştırma ile homojenize olun.</li>
</ol>3. Mikroplaka duyarlılığı
NOT: Yüksek miktarda İmmünoglobulin bağlamak için optimize edilmiş 96 iyi adsorpsiyon immünoassay plakası kullanın (örn. Bkz. Malzeme Tablosu).
<ol><li>Her kuyuiçin, karbonat tamponunda seyreltilmiş monoklonal antikor (mAb-D1) 200 μL ekleyin. NOT: Yaklaşık 1 μg/mL'lik optimal konsantrasyon deneysel olarak belirlendi ve saflaştırılmış mAb-D1'in yaklaşık 1/2000 seyreltilmesine karşılık gelmektedir. Bu önerilen konsantrasyon her mAb-D1 toplu iş için gösterilir ve periyodik olarak pozitif kontrol ile doğrulanmalıdır.</li>
	<li>Plakayı yapışkan bir filmle kaplayın ve mikro plakayı nemli bir atmosferde 37 °C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuyu içeriğini dikkatlice aspire edin ve %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.</li>
	<li>Mikroplakaters ve 5 dakika oda sıcaklığında bir adsorbent kağıt üzerinde kurumaya bırakın.</li>
</ol>4. Mikroplaka passivation
<ol><li>Her kuyuya, passivation arabelleği 300 μL ekleyin.</li>
	<li>Plakayı yapışkan bir filmle kaplayın ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>İyi içeriği dikkatlice aspire edin ve %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.</li>
	<li>Mikroplakaters ve 1 dakika oda sıcaklığında bir adsorbent kağıt üzerinde kurumaya bırakın. NOT: Mikroplaka, kullanıma kadar 3 ay süreyle -20 °C'de kullanılabilir veya saklanabilir.</li>
</ol>5. ELISA tsası
NOT: Referans aşının kontrol eğrisinin oluşturulması için Adım 5.3 gerekli değildir; test edilen aşıyı titreetmek için tüm Adımlar 5.1 ile 5.6 arasında gereklidir.
<ol><li>Hassaslaştırılmış mikroplakanın yıkanması<ol>
<li>Her kuyuya 300 μL yıkama tamponu ekleyin.</li>
		<li>İyi içeriği dikkatlice aspire edin ve %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.</li>
		<li>Duyarlı plakayı kapsamlı bir şekilde yıkamak için 5.1.1 ve 5.1.2 adımlarını beş kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>Mikroplakaters ve 1 dakika oda sıcaklığında bir adsorbent kağıt üzerinde kurumaya bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kontrol eğrisi için referans aşının seyreltilmesi<ol>
<li>1 mL distile su daki referans aşıyı (doğrulama antijeni Lot 09) yeniden oluşturmak, kuduz virüsü glikoproteininin 10 μg/mL konsantrasyonuna karşılık gelen distile suyun.</li>
		<li>Kuduz virüsü glikoproteininin 1 μg/mL'sine ulaşmak için seyrelticide yeniden oluşturulmuş referans aşının on kat seyreltilmesini hazırlayın.</li>
		<li>Tablo 1'debelirtildiği gibi seyreltici de bu referans aşının 6 seri iki kat seyreltme hazırlayın.</li>
		<li>Boş bir denetim olarak hizmet vermek için 200 μL'lik ayrıştırmayı yinelenen (kuyu1H/2H) dağıtın.</li>
		<li>Her referans aşı seyreltme kuyusu başına 200 μL'yi yinelenen olarak dağıtın (G1/G2'den A1/A2'ye kadar olan kuyular).</li>
	</ol></li>
	<li>Titrasyonu için test edilen aşının seyreltmeleri<ol>
<li>Seyreltici de test edilen aşının on kat seyreltilmesini hazırlayın.</li>
		<li>Test edilen aşının 7 iki kat seri seyreltmelerini Tablo 2'debelirtildiği gibi seyreltici olarak hazırlayın.</li>
		<li>Her test aşısı seyreltme kuyusu başına 200 μL'yi yinelenen olarak dağıtın (H3/H4'tan A3/A4'e kadar olan kuyular).</li>
	</ol></li>
	<li>ELISA plakasının Kuluçka/Yıkama<ol>
<li>Mikro plakayı yapışkan bir filmle kaplayın ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Filmi çıkarın, dikkatlice aspire edin ve her kuyunun içeriğini %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.</li>
		<li>Her kuyu için 300 μL yıkama tamponekleyin.</li>
		<li>Aspire dikkatle ve her kuyunun içeriğini% 2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.</li>
		<li>Bağlanmamış antijeni çıkarmak ve kaplanmış antikora bağlı G protein düzelticilerini (mAb D1) korumak için 5.4.3 ve 5.4.4 adımlarını beş kez tekrarlayın.</li>
		<li>Mikroplakaters ve 1 dakika oda sıcaklığında bir adsorbent kağıt üzerinde kurumaya bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Peroksidaz konjuge mAb-D1'in bağlanması<ol>
<li>Önerilen seyreltme kuyubaşına 200 μL (1/2000) peroksidaz etiketli mAb-D1'i seyreltici olarak dağıtın (yaklaşık 1μg/mL konsantrasyonu). Önerilen konsantrasyon her mAb-D1 toplu iş için gösterilir ve periyodik olarak pozitif kontrol ile doğrulanmalıdır.</li>
		<li>Mikro plakayı yapışkan bir filmle kaplayın ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Filmi çıkarın, dikkatlice aspire edin ve her kuyunun içeriğini %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.</li>
		<li>Her kuyuya, 300 μL yıkama tamponu ekleyin.</li>
		<li>Aspire dikkatle ve her kuyunun içeriğini% 2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.</li>
		<li>Bağlı olmayan peroksidaz etiketli antikorları (mAb D1) çıkarmak için 5.5.4 ve 5.5 adımlarını beş kez tekrarlayın.</li>
		<li>Mikroplakaters ve 1 dakika oda sıcaklığında bir adsorbent kağıt üzerinde kurumaya bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir substrat-kromojen kullanarak vahiy<ol>
<li>Substrat-kromojen çözeltisi kuyubaşına 200 μL dağıtın.</li>
		<li>Bir film ile mikroplaka mühür ve 30 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Sarı-turuncu renk, bağlı peroksidaz etiketli antikor (mAb D1) miktarıile orantılı olan yoğunluğu nu geliştirir.</li>
		<li>Kuyu başına 50 μL durdurma çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun.</li>
		<li>Mikroplakanın altını dikkatlice silin ve kullanılan tüm kuyuların 492 nm'deki optik yoğunluğunu (OD) belirlemek için bir spektrofotometreye yerleştirin: negatif kontrol (boş), referans aşı ve test edilmiş aşı.</li>
		<li>Analiz için OD verilerini .xls veya .xlsx dosya biçimi olarak toplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Referans aşı eğrisi, trimerik glikoprotein içeriği, optik yoğunluğu (492 nm) bir fonksiyonu olarak çizin<ol>
<li>Referans aşının farklı seyreltmelerinde her yineleme için ortalama OD'yi 492 nm olarak hesaplayın (Tablo 2'dekiG1/G2'den A1/A2'ye kadar)</li>
		<li>Hesaplanan her ortalama OD'den Boş 'un (kuyular, Tablo 2'dekiH1/H2) ortalama OD'sini çıkarın.</li>
		<li>Ortaya çıkan OD değerlerini dikey eksen (doğrusal ölçek) ve glikoprotein düzelticilerde (ng/mL) yatay eksen (logaritmik ölçek) ile ilgili konsantrasyonu çizin.</li>
		<li>Noktaları birleştirerek referans eğrisiçizin (Şekil 1).</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

mAb-D1 tarafından tanınan epitop, rabv glikoproteininin antijenik bölgesi III'te yer alır ve bu sadece VNAb'lerin indüksiyonu için immündominant olmakla kalmamış, aynı zamanda nörovikurallılık, patojenite40,41 ve reseptör tanıma42'deyer almaktadır. Glikoprotein boyunca başka bir önemli antijenik site vardır, site II43, karşı birkaç MAbs mAb-WI-111235gibi izole edilmiştir. Bunlar benzer türde ...

50 yıldan fazla olduğundan, NIH testi1 toplu yayından önce kuduz aşısı gücünü değerlendirmek için altın standart bir yöntem olarak kullanılır. Bu test, 14 gün sonra kuduz virüsü (RABV) türü olan Challenge Virus Standard (CVS) ile birlikte test edilecek aşı ile fare gruplarının intraperitoneal bağışıklamalarından oluşur. Potens IC meydan hayatta farelerin oranında değerlendirilir. Who2 ve Avrupa Farmakopesi3 hala aşı potens değerlendirmek için NIH testi gerektirir rağmen, Bu test çeşitli engeller uğrar: sonuçlar son derece değişken4; enfeksiyöz RABV meydan okuma sırasında kullanılır ve bu hem teknik beceri hem de sıkı biyogüvenlik önlemleri gerektirir; hayvanların çok sayıda kullanılır ve meydan şiddeti ciddi etikendişeleri5 yükseltir. Bu testin daha az ciddi bir varyasyonu geliştirilmiştir: intra-periton bağışıklama iki hafta sonra, fareler IC tarafından meydan değil ama kanama lı ve serumda spesifik RABV nötralize antikorların varlığı için test edilmiştir (VNAbs) bir in vitro nötralizasyon testi kullanarak. Ancak, bu test hala veteriner aşıları için kullanımda olmasına rağmen laboratuvar farelerin çok sayıda kurban gerektirir6,7 ve insan aşıları için kabul edilmiştir8.
Şu andan itibaren, hem Uluslararası9 hem de Avrupa10 önerisi, üreticileri ve Ulusal Kontrol Laboratuvarlarını (Official Medicine Control Laboratories - OMCLs) 3R stratejisi olarak adlandırılan laboratuvar hayvan testlerinin değiştirilmesi, azaltılması ve iyileştirilmesi konusunda teşvik etmektedir. Avrupa Direktifi 2010/63/EU (2013/01/01 yılından bu yana yürürlükte) hayvanların korunması ve refahı ile ilgili de kuduz aşılarının Kalite Kontrolü ile ilgili aşı üreticileri ve laboratuvarları için kısıtlamaları güçlendirdi yanı sıra kuduz araştırma11. Sonuç olarak, alternatif in vitro yaklaşımların geliştirilmesi, doğrulanması ve kullanımı artık bir öncelik haline gelmiştir. Bu sadece etik olarak sağlam değil, aynı zamanda toplu test maliyetlerini azaltabilir ve hafta yerine saat sonuçları için süre kısaltmak3.
RABV parçacığının yüzeyinde, glikoprotein trimerik formu benimser12,13,14,15,16. Kuduz aşısında, bu yerli trimerik form vnabs indükleyen büyük immünojen oluşturur17 ise monomerik, çözünür veya denatüre glikoproteinler kötü immünojenik18,19. Bu nedenle, aşı üretim süreci boyunca glikoprotein düzelticilerin korunması optimal immünojenik potansiyelin korunması için iyi bir göstergedir. Antikor-bağlayıcı-test20,,21, tek radyal immünodiffüzyon (SRD) testi22 ve ELISA testi23,24,,25,26,,27 gibi çeşitli immünokimyasal yöntemler, kuduz aşılarında antijen içeriğini ölçmek için WHO Teknik Rapor Serisi2 ve Avrupa monografisi3 tarafından tavsiye edilir.24 Bu aşı üretiminin tutarlılığını izlemek için üreticiler tarafından kullanılan ve OMCL tarafından insan aşıları28toplu tutarlı formülasyon değerlendirmek için, NIH testi hala potens için kabul olsa bile.
Ancak, tüm bu immünokimyasal yöntemler eşdeğer değildir. SRD testi membran demirli süsleyiciler değiştirebilir ve glikoprotein,22,29çözünür veya denatüre formu neden olabilir bir ön tedavi gerektirir. Bu nedenle, SRD bir aşı çok immünojenite kusurlu bir değerlendirme ile sonuçlanan immünojenik ve non-immünojenik glikoproteinler arasında ayrım çok verimli değildir. Buna karşılık, ELISA testi dahaduyarlıdır 22, glikoproteinin doğal yapısını korur, ve glikoprotein doğal katlanmış trimers içeriğini belirlemek için daha uygundur. ELISA testi tavşan poliklonal veya fare monoklonal anti-glikoprotein antikorları saflaştırılmış veya amonyum sülfat ile konsantre kullanabilirsiniz. Çalışmalar, NIH testi ile aşılarda ELISA tarafından değerlendirilen antijen içeriği arasında iyi bir uyum olduğunu göstermiş ve ELISA yöntemlerinin in vitro potens testi için uygun olduğu sonucuna varmıştır. Bu ELISA testleri en azından ek olabilir ya da hatta NIH testi4,26,27,30,31,32,33değiştirebilirsiniz savunucuları ., Bugün, Avrupa Farmakopesi NIH testi3alternatif olarak doğrulanmış serolojik veya immünokimyasal tahlillerin kullanılmasını önerir. Aşı potens için hayvan kullanımıtam kaçınma gerçekçi bir bakış açısı haline gelmiştir.
Aşağıda sunulan yöntem, trimerik RABV glikoprotein15,34antijenik siteleri III (aa 330-338) tanır bir fare monoklonal antikor klonu (mAb-D1) kullanarak dolaylı bir ELISA sandviç immünoyakalama dayanmaktadır. Bu yöntem başlangıçta Institut Pasteur26geliştirilmiştir ,30 sonra optimize edilmiş ve Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé tarafından doğrulandı (ANSM) laboratuvar, yani, Fransız OMCL4,33. mAb-D1 hem plakayı algılamak hem de yakalanan antijeni tespit etmek için kullanılır. Bu glikoprotein düzelticiler, yani, immünojenik RABV antijeninin spesifik niceliklenmesine olanak sağlar. Algılama için kullanılan mAb-D1 peroksidaz ile etiketlenir, hangi substrat ve kromojen varlığında ortaya çıkar. Test edilen aşı ve referans aşı için ölçülen emiciliğin karşılaştırılması immünojenik glikoprotein içeriğinin belirlenmesine olanak sağlar. RABV glikoprotein35'infarklı antijenik bölgelerini tanıyan farklı mAb'ler için aynı tip bir titreşme uygulanabileceği dikkat ivedidir. Amonyum sülfat anti-glikoprotein poliklonal tavşan immünglobulinleri G (IgG) veya monoklonal fare globulinleri elde etme ve arındırma veya konsantre etme yöntemi, peroksidaz ile antikorları bir araya getirmek için kullanılan yöntemle birlikte daha önce36 olarak açıklanmıştır37.

<table><tbody><tr><td>Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10445753</td><td>canlı virüs titrasyonu yapılıyorsa</td></tr><tr><td>Şeffaf Düz Tabanlı İmmüno Steril Olmayan 96 Kuyulu Plakalar, 400 & L, MAXISORP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>439454 yüklü antikora bağlanmak için iyi</td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td>İmmünoloji Plakasının hazırlanması için<td>Labo Polipropilen Laboratuvar Çeker</td><td>Ocak, ThermoFisher Scientific</td><td>12576606</td> donatın</tr><tr><td>Güçlü Adsorpsiyon MAXISORP Düz Tabanlı Kuyusu F96</td><td>Dutscher</td><td>55303</td><td>yüklü antikora bağlanmak için iyi</td></tr><tr><td>Mikroplaka Sızdırmazlığı Bant (100 yaprak)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka ve nbsp; tek modlu okuyucu Sunrise</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka çalkalayıcı-inkübatör</td><td>Dutscher</td><td>441504</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka yıkayıcı Wellwash</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5165000</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet (30-300 ve mikro; L) 12 kanallı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4661180N</td> Tek Kanallı <td></td></tr><tr><td>pipetler (Kit 2: Finnpipettes F2 0.2-2 & mu; L mikro, 2-20 & mu; L, 20-200 &mu; L & 100-1000 & mu; L)</td> <td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>4700880</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro elisa testi kuduz aşısı potens değerlendirmek için

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Hayvan refahı için giderek artan küresel endişe üreticileri ve Ulusal Kontrol Laboratuvarları (OMCLs) Değiştirme, Azaltma ve Laboratuvar hayvan testleri arıtma için 3Rs stratejisi takip teşvik etmektedir. Kuduz aşısı nın gücünü değerlendirmek için NIH testine alternatif olarak dSÖ ve Avrupa düzeylerinde in vitro yaklaşımların geliştirilmesi önerilmektedir. Kuduz virüsü (RABV) partikülünün yüzeyinde glikoprotein indükleyicileri Viral Nötralize Antikorları (VNAb) oluşturmak için büyük immünojeni oluşturur. Monoklonal Antikorların (mAb-D1) glikoproteinin trimerik formunu tanıdığı bir ELISA testi, aşı serilerinin üretimiyle birlikte yerli katlanmış trimerik glikoproteinin içeriğini belirlemek için geliştirilmiştir. Bu in vitro potens testi NIH testi ile iyi bir uyum gösterdi ve RABV aşı üreticileri ve OMCLs tarafından ortak çalışmalarda uygun bulunmuştur. Hayvan kullanımından kaçınmak yakın gelecekte ulaşılabilir bir hedeftir.
Sunulan yöntem, trimerik RABV glikoproteininin iii (aa 330-338) antijenik bölgelerini tanıyan mAb-D1 kullanılarak dolaylı elisa sandviç immünoyakalamasına dayanmaktadır. mAb-D1, aşı da bulunan glikoprotein düzelticilerin hem kaplaması hem de tespiti için kullanılır. Epitop konformasyonel özellikleri nedeniyle tanındığından, potansiyel olarak denatüre glikoprotein (daha az immünojenik) mAb-D1 tarafından yakalanıp tespit edilemez. Test edilecek aşı mAb-D1 ile duyarlı bir plaka içinde kuluçkaya yatırılır. Bağlı trimerik RABV glikoproteinler tekrar mAb-D1 eklenerek tanımlanır, peroksidaz ile etiketlenir ve daha sonra substrat ve kromojen varlığında ortaya çıkar. Test edilen aşı ve referans aşı için ölçülen emiciliğin karşılaştırılması immünojenik glikoprotein içeriğinin belirlenmesine olanak sağlar.

Aşağıdaki örnekte saflaştırılmış inaktive kuduz virüs partiküllerinden (PV aşısı türü) oluşan referans aşı Lot 09 kullanılmaktadır. Bu nda glikoprotein düzelticiler (10 μg/mL) içeriği, toplam viral protein miktarının (BCA testi) belirlenmesi ve glikoprotein insiat yüzdesi SDS-poliakrilamid jel elektroforezi ile değerlendirildikten sonra oluşturulmuştur. Alternatif olarak, kuduz Aşısı için WHO6'ncı Uluslararası Standart (IS) (NIBSC kodu: 07/162) kalibre edilmiş bir referans aşı ...

Burada kuduz aşılarında immünojenik glikoprotein içeriğini belirlemek için dolaylı bir ELISA sandviç immünoyakalama açıklar. Bu test glikoprotein düzelticileri tanıyan nötralize monoklonal antikor (mAb-D1) kullanır. Üretim sırasında aşı potens tutarlılığını takip etmek için in vivo NIH testine alternatiftir.

In Vitro ELISA Testi Kuduz Aşısı Potens Değerlendirmek için

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Hayvan testlerini azaltmak ve NH testinin değişkenliği nedeniyle WHO, kuduz aşısının gücünü değerlendirmek için in vitro yaklaşımlar geliştirmeye teşvik eder. Bu ELISA testi glikoproteinin immünojenik formunu tanımada klasik NH testi ile iyi bir uyum gösterir, yüksek duyarlılık gösterir ve sadece bir gün içinde yapılabilir. Kuduz aşısı potensinin ELISA ile in vitro olarak değerlendirilmesi in vivo NH testine alternatiftir.Üreticiler ve ulusal kontrol laboratuvarları tarafından teşvik edilmektedir. Her seyreltme için çoğaltılmış hacimleri çoğaltmak ve yıkamadan sonra plakayı iyi kurutmak, bu prosedüre başlamak tan kaçınmak için, tek kullanımlık palto, eldiven, maske ve gözlük gibi yeterli kişisel koruma ekipmanı takmak çok önemlidir. Kirlenmiş maddeleri dekontaminasyon için 30 dakika boyunca %2,6 sodyum hipoklorit çözeltisi içine batırarak tedavi edin.Sonra, 96-iyi immünoassay plaka yola ve her kuyuya karbonat tampon seyreltilmiş monoklonal antikor 200 mikrolitre ekleyin. Plakayı yapışkan filmle kaplayın ve mikro plakayı nemli bir ortamda üç saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra dikkatlice aspire ve% 2.6 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya kuyu içeriği aktarın.Mikroplakayı ters çevirin ve oda sıcaklığında emici kağıda beş dakika kurutun. İlk olarak, her kuyuya 300 mikrolitre pasivasyon tamponu ekleyin. Plakayı yapışkan filmle kaplayın ve 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.Bundan sonra kuyunun içindekileri %2.6 sodyum hipoklorit solüsyonu içeren bir ekive aktarın. Plakayı yıkamak için, her kuyuya 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Daha sonra dikkatlice aspire ve% 2.6 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya iyi içeriği aktarın.Hassas plakayı kapsamlı bir şekilde yıkamak için bu yıkama işlemini beş kez daha tekrarlayın. Bundan sonra, mikroplaka ters ve bir dakika oda sıcaklığında emici kağıt parçası üzerinde kurumasına izin. Kuduz virüsü glikoproteininin son konsantrasyonunun mililitrede 10 mikrogram olması gibi bir mililitre distile suda referans aşıyı yeniden kurun.Mililitre başına bir mikrogram kuduz virüsü glikoprotein konsantrasyonuna ulaşmak için seyrelticide yeniden oluşturulmuş referans aşının 10 kat seyreltilmesini hazırlayın. Daha sonra, metin protokolütabloda belirtildiği gibi seyreltme bu referans aşı altı seri iki kat seyreltme gerçekleştirin. Yinelenen kuyularda seyreltici 200 mikrolitre dağıtın kör bir kontrol olarak hizmet ve çoğaltılmış her referans aşı seyreltme için iyi başına 200 mikrolitre.Daha sonra seyreltici de test edilen aşının 10 kat seyreltilmesini hazırlayın ve metin protokolünün ikinci tablolarında belirtildiği gibi seyreltici olarak test edilen aşının yedi iki kat seri seyreltmesini hazırlayın. Test edilen her aşı seyreltme 200 mikrolitresini mikroplakanın her kuyuya çoğaltılması için dağıtın. Mikro plakayı yapışkan filmle kaplayın ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, filmi kaldırın. Aspire dikkatle ve% 2.7 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya her kuyunun içeriğini aktarın. Plakayı yıkamak için, her kuyuya 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin, dikkatlice aspire edin ve her kuyunun içeriğini %2,6 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.Bağlanmamış antijeni çıkarmak ve kaplanmış antikora bağlı G-protein düzelticileri korumak için yıkama işlemini beş kez daha tekrarlayın. Yıkanmış mikroplakaters ve bir dakika oda sıcaklığında emici kağıt parçası üzerinde kurumasına izin. Daha sonra her kuyuya seyreltici olarak D1 monoklonal antikor etiketli peroksidaz önerilen seyreltme 200 mikrolitre dağıtmak.Mikro plakayı yapışkan filmle kaplayın ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra filmi çıkarın, dikkatlice aspire edin ve her kuyunun içeriğini %2,6 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın. Mikro plakayı yıkamak için, her kuyuya 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin.Aspire dikkatle ve her kuyunun içeriğini bir alıcıya transfer 2.6% sodyum hipoklorit çözeltisi içeren. Bağlı olmayan peroksidaz etiketli antikorkaldırmak için bu yıkama işlemini beş kez daha tekrarlayın. Yıkanmış mikroplakaters ve bir dakika oda sıcaklığında emici kağıt parçası üzerinde kurumasına izin.Daha sonra, her kuyuya 200 mikrolitre substrat-kromojen çözeltisi dağıtın. Mikro plakayı filmle kapatın ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra reaksiyonu durdurmak için her kuyuya 50 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin.Dikkatlice mikroplakanın alt silin ve spektrofotometre yerleştirin. Kullanılan tüm kuyular için optik yoğunluğu 492 nanometre olarak belirleyin. Bu verileri çözümleme için bir elektronik tablo dosyasında toplayın.Bundan sonra, hem referans aşı eğrisi hem de metin protokolünde belirtildiği gibi optik yoğunluk değerleri için çizimler oluşturun. Bu çalışmada kuduz aşısının gücünü değerlendirmek için in vitro ELISA testi kullanılmıştır. Tipik bir deneyden temsili optik yoğunluk değerleri burada gösterilmiştir.Bu değerler, referans aşının dikey eksenüzerindeki farklı seyreltmeleri ve glikoproteinin yatay eksen üzerindeki konsantrasyonu için ortalama optik yoğunluğu çizerek referans aşı eğrisini çizmek için kullanılır. Test edilen aşının glikoprotein içeriği bu eğri kullanılarak tahmin edilir. Değerlendirme, referans aşı eğrisinin astar alanında ortalama optik yoğunluk değerine sahip seyreltmeler için kesindir.Bir-40 seyreltme dikkate alınarak, x ekseni üzerinde OD 1534 dikey projeksiyon mililitre başına 500 nanogram karşılık gelir. Yani test edilen aşının mililitreglikoprotein başına 20 mikrogram olduğu tahmin ediliyor. In vitro potens kurulduğunda, uluslararası birimlerde kalibre referans altı WHO uluslararası standart için test aşısı karşılaştırmak için gereklidir.Aynı yöntem klasik olarak daha değişken veteriner aşıları kullanılanlar da dahil olmak üzere daha fazla aşı suşlarının tespitini büyütmek için diğer antikorlar ile birlikte kullanılabilir. Antikorlar da at veya insan serumantirabis antikorların titrasyonu için rekabet içinde kullanılabilir. İnaktive olmayan aşılar veya virüsler ile önlem alınmalıdır.Kişisel koruyucu ekipman kullandığınızdan, eldiven kullandığınızdan ve her şeyi düzgün bir şekilde dezenfekte etmeye özentin. Ayrıca, kanserojen ve asidik sodyum hipoklorit çözeltisi ile tabletler ile dikkatli olun.

in-vitro-elisa-test-to-evaluate-rabies-vaccine-potency

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, enfekte fare beyin dokusunda kuduz virüsü antijeni tespiti için immünohistokimya boyamayı göstermektedir. Süreç, deparafinizasyon ve alkol tedavisini, ardından antijen erişilebilirliğini artırmak için proteolitik tedaviyi içerir. İmmünohistokimya boyama, doku bölümünde kuduz antijenlerinin varlığını doğrulayan kırmızı çökeltileri ortaya çıkarır.

Kuduz Virüsü Antijenlerinin Saptanmasına Yönelik Bir İmmünohistokimya Boyaması

Bu video, aşılardaki immünojenik glikoprotein seviyelerini değerlendirmek için tasarlanmış dolaylı bir enzime bağlı immünosorbent testi veya ELISA sandviç immünocapture testini göstermektedir. Glikoproteine özgü antikorlar içeren tahlil plakası, referans ve test aşıları dahil olmak üzere seri olarak seyreltilmiş aşı numuneleri ile inkübe edilir, ardından test aşısındaki glikoprotein içeriğini ölçmek için immünolojik test yapılır.

Bir aşıdaki immünojenik glikoprotein içeriğini belirlemek için bir sandviç ELISA kullanmak

Bu çalışmada açıklar yüksek işlem hacmi, nötralize antikorlar respiratuvar sinsityal virüs (RSV) için belirli titresi belirlemek için görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil. Bu tahlil biçimi farklı örnek türleri üzerinde test edilmiştir.

Bir geliştirilmiş ve yüksek üretilen iş respiratuvar sinsityal virüs (RSV) mikro-nötralizasyon tahlil

Doğrudan hızlı immünhistokimyasal test (DRIT), kuduz tanısı için doğrudan floresan antikor (DFA) testine alternatif olarak tanınan hayvan sağlığı ve Dünya Sağlık Örgütü (OIS/WHO) için bir dünya organizasyonu sunmaktadır. Bu test, ışık mikroskobu kullanarak beyin gösterimleri üzerine yaklaşık 1 saat içinde gerçekleştirilebilecek alan tabanlı uygulamalar için izin verir.

Doğrudan hızlı Immünhistokimyasal testi kullanarak gelişmiş kuduz gözetimi

Bir Pan-Lyssavirus iç içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu özellikle tüm bilinen lyssaviruses algılamak için geliştirilmiştir. Farklı hayvan türlerinin kuduz beyin örneklerini kullanarak doğrulama Bu yöntemin altın standart floresan antikor testi için bir duyarlılık ve özgüllük eşdeğer olduğunu gösterdi ve rutin kuduz tanısı için kullanılabilir.

Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi

Beyin biyopsisi örneklemesinden son yoruma kadar hızlı immünokromattografik tanı testi (RIDT) ile alan koşullarında hayvan kuduzlarının postmortem tanısı için tam bir protokol salıyoruz. Ayrıca moleküler analiz ve viral genotipleme için cihazı kullanarak daha fazla uygulama açıklar.

Field Postmortem Kuduz Hızlı İmmünromatografik Tanı Testi Kaynak Sınırlı Ayarlar için Diğer Moleküler Uygulamalar ile

Burada formalin-sabit dokular için alternatif tanı testi olarak kuduz virüsü antijeninin tespiti için immünhistokinemya test protokolü sunuyoruz.

Formalin-Sabit Dokulardan Lyssavirüs Antijen Tespiti için İmmünohistokiniti Testi

Bu protokol, in vitro transkripsiyon kullanarak çeşitli sığır beyin anatomik yapıları içindeki kuduz virüsü nükleoprotein (N) gen kopya numarasını belirlemek için qRT-PCR tabanlı bir yaklaşım sunar.

Çeşitli Sığır Beyin Yapılarında Kuduz Virüsünün Nicelliği

Bu yöntem, kuduz antijeninin, önceden belirlenmiş bir gecikmeden sonra pulsatil salınımı sağlayan yapısal ve malzeme özelliklerine sahip biyolojik olarak parçalanabilir polimerik mikropartiküllere kapsüllenmesini açıklar. Partikül çekirdeğinden alınan antijenin enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) değerlendirmesi, partikül üretimi yoluyla bozulmamış trimerik kuduz virüsü glikoproteininin varlığını doğrulamaktadır.

Kuduz Antijenini Kapsülleyen Pulsatil Polimerik Mikropartiküllerin İmalatı

Bu makalenin amacı, kuduza özgü IgG ve IgM antikorlarının saptanmasında kuduz indirekt floresan antikor testinin kullanımını incelemektir.

Kuduz IgG ve IgM Antikorlarının Kuduz İndirekt Floresan Antikor Testi Kullanılarak Saptanması

Bu protokol, bazı kuduz olmayan lizavirüsler ve lagomorflar için test performansını iyileştirmek için primer dizileri ve formülasyonlardaki güncellemeler de dahil olmak üzere, doku toplamadan sonuç yorumlamaya kadar pan-lizavirüs LN34 gerçek zamanlı ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) testini gösterir. Ayrıca, tek kuyulu LN34 çoğullanmış (LN34M) formatı için tahlil kurulumunu da gösteriyoruz.

Güncellenmiş, Çoğullanmış LN34 Gerçek Zamanlı Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi ile Hayvanlarda Kuduz Postmortem Tanısı

Öğrenin kuduz aşısı potens değerlendirmek için in vitro ELISA yöntemini. Bu teknik, hayvan testlerini azaltarak yüksek duyarlılıkta ve bir günde sonuç verir.

In Vitro ELISA Testi Kuduz Aşısı Potens Değerlendirmek için

Daha fazla video keşfet