Rapamisin/mTOR etkileşimini incelemek için Yarı Kantitatif İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS)
27 Ağustos 2019
Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini geliştirdik. Etkileşimler iki eğriye çizilebilir: proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi. MTOR-rapamisin etkileşimini örnek bir vaka olarak kullandık.
İlaç afinite duyarlı hedef kararlılık, DARTS, yeni küçük moleküllü protein hedeflerinin tespiti için sağlam bir yöntemdir. Bilinen küçük moleküllü protein etkileşimlerini doğrulamak ve doğal ürünler için potansiyel protein hedeflerini bulmak için kullanılabilir. Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini daha da geliştiriyoruz.
Protein-ligand etkileşimleri iki eğri, bir proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi karşı çizilebilir. MTOR-rapamycin etkileşimini protokolümüzün kurulması için örnek bir örnek olarak kullandık. %10 fetal sığır serumu, iki milimolar glutamin ve %1 antibiyotik içeren DMEM kullanarak 293T hücreleri büyütün.
Kültürleri %5 karbondioksit insantininin 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kültür %80-90'lık birleştiğinde hücreleri soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri uygun miktarda soğuk hücre lisis tamponuna toplamak ve lysing hücrelerini 1,5 milimetrelik bir tüpe aktarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
Lysis tamponve lysing hücreleri iyice karıştırmak ve 10 dakika boyunca buz üzerinde tüp kuluçka ters. Tüpü 18,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant'ı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve buzüzerinde soğutulun.
Lysatların protein konsantrasyonu yaklaşık bca test gerçekleştirmek ve protein konsantrasyonu dayalı pronase seyreltme hesaplamak. İlk olarak, iki 1.5 mililitrelik tüpler, 99 mikrolitre her içine lysate aktarın. Lysate her aliquot için küçük moleküllü stok çözeltisi bir mikrolitre ekleyin ve sallayarak oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca iki tüp kuluçka.
Buz üzerinde, 1x TNC taze çözülmüş pronase çözeltisi seri seyreltme kurmak. Küçük molekül ile kuluçka sonra, beş tüpler halinde örneklerin 20 mikrolitre içine her aliquot bölün. Aynı sindirim süresini sağlamak için, her 30 saniyede bir belirli aralıklarla, numunelere hazırlanan pronase çözeltilerinin iki mikrolitresini ekleyin.
Bir kontrol grubu için, Iki mikrolitre TNC arabelleği ekleyin. Beş ila 20 dakika sonra, 30 saniyelik aralıklarla soğuk 20x proteaz inhibitör kokteyl iki mikrolitre ilave yoluyla altı tüplerin sindirim durdurmak. İyibir şekilde karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
Her numuneyi altı mikrolitre 5x SDS-PAGE yükleme tamponu ile seyreltin ve numuneleri 70 derecede 10 dakika kaynatın. Şimdi, Batı leke gerçekleştirmek için, uygun bir moleküler ağırlık belirteci ile birlikte, bir % 8 SDS-PAGE jel kuyularına protein eşit miktarda yükleyin. 80 volt 30 dakika jel çalıştırın, sonra 120 volt volta voltaj ı ayarlayın ve bir ila iki saat boyunca çalışmaya devam edin.
Küçük molekülün potansiyel hedef proteinlere doğrudan bağlanabilen ivedu. Bu protokolde, küçük molekül ile kuluçka proteoziz karşı koruma doğruladı. Üç bant araç kontrolü üzerinde rapamisin ile kuluçka ile korunduğu tespit edilebildi.
Batı lekeleme, düşük pronase ile protein oranlarında mTOR proteininin varlığını ve artan oranlarda azalma ve kaybını göstermiştir. Pronase tarafından mTOR proteolisisi açıkça rapamisin varlığı ile inhibe edildi ve rapamisin eklenmesi proteolitik eğribelirgin bir kayma üretti. Rapamisin doz-bağımlı mTOR düzeyini artırdı, rapamisin tedavisi ile mTOR artan istikrar düşündüren.
Hedef protein bandı yoğunluklarının ölçülmesi mTOR'un rapamisinin hedef proteini olduğunu göstermiştir. En iyi stepwise etkisi elde etmek için, bu deney protein oranları üzerinde pronase uygun bir dizi elde etmek için birkaç kez tekraredilmesi gerekebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, DARTS deneyinin veri analiz yeteneklerini, protein stabilitesi değişikliklerini izleyerek ve protein-ligand etkileşimi afinitelerini tahmin ederek geliştirir. mTOR-rapamycin etkileşimi, bu analizin örnek bir durumu olarak hizmet eder.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyokimya
- Farmakoloji
Arka Plan
- DARTS, küçük molekül protein hedeflerini tespit etmek için bir yöntemdir.
- Bilinen küçük molekül protein etkileşimlerini doğrular.
- DARTS, doğal ürünler için potansiyel protein hedeflerini tanımlayabilir.
- Protein-ligand etkileşimleri, özel eğriler aracılığıyla görselleştirilebilir.
Çalışmanın Amacı
- DARTS deneylerinde veri analizini geliştirmek.
- Protein stabilitesindeki değişiklikleri izlemek.
- Protein-ligand etkileşimlerinin afinitelerini tahmin etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Protein stabilitesi değişikliklerini izlemek.
- Protein-ligand etkileşim afinitelerini tahmin etmek.
- Etkileşimleri proteolitik ve doza bağlı eğrilerde çizmek.
- mTOR-rapamycin'i bir vaka çalışması olarak kullanmak.
Ana Sonuçlar
- DARTS'ta protein stabilitesinin geliştirilmiş analizi.
- Protein-ligand etkileşim afinitelerinin başarılı tahmini.
- Etkileşimlerin özel eğriler aracılığıyla görselleştirilmesi.
- Yöntemin mTOR-rapamycin kullanılarak gösterilmesi.
Sonuçlar
- Çalışma, DARTS metodolojisini daha iyi analiz için geliştirir.
- Protein stabilitesi ve etkileşim afiniteleri etkili bir şekilde izlenebilir.
- Bulgular, yeni protein hedeflerinin tanımlanmasına yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The enhanced DARTS assay provides a label-free, native-state approach to validate small-molecule target engagement, supporting early-stage target de-risking. By quantifying binding affinity through proteolytic and dose-dependent curves, it enables mechanistic confidence in hit-to-lead progression. This method aids in prioritizing compounds with validated target interactions, reducing attrition due to false positives in downstream screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms direct target engagement of small molecules like rapamycin with mTOR in native lysates.
- Operational Value: Uses unmodified compounds, avoiding artifacts from tags or labels that may alter binding.
- Predictive Value: Enables affinity estimation to triage hits based on target residence and stability shifts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative proteolytic and dose-response curves for hit confirmation.
- Reproducibility: Standardized workflow with defined pronase titration and inhibitor quench points.
- Scalability: Compatible with multi-well formats for testing compound libraries against purified or cellular targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Validated target engagement in cellular lysates supports extrapolation to intact systems.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes specific binding from nonspecific proteolysis inhibition via dose-dependent stabilization.
- Preclinical Alignment: Confirmed mTOR-rapamycin interaction provides a benchmark for pathway-targeted compound evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between primary hit confirmation and lead optimization, offering biophysical validation before cellular functional assays.
- Discovery Biology: Tests target hypothesis by measuring ligand-induced stability shifts in native protein pools.
- Screening: Confirms target engagement of hits from biochemical or phenotypic screens using endogenous protein.
- Analytics: Provides affinity estimates from dose-dependence curves and stability changes from proteolytic profiles.
- Translational Research: Uses cellular lysates to maintain native protein complexes and post-translational states.
- Enterprise Reuse: Platform adaptable to diverse targets and ligands without reagent redesign.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Direct measurement of target stabilization enables objective assessment of ligand efficacy.
- Operational Value: Simple workflow using standard lysis, protease digestion, and Western blot infrastructure.
- Strategic Value: Reduces false advancement by confirming target binding early in the discovery cascade.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions based on quantitative target engagement metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Western blotting and quantitative band analysis.
- Dependent on access to pronase and protease inhibitor cocktails for controlled digestion.
- Needs standardization across labs for consistent pronase:protein ratios and incubation times.
- Adaptation to membrane or complex targets may require optimization of lysis conditions.
- Practical limitation: Semi-quantitative nature requires replicate runs for reliable affinity estimation.
