Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Bu protokol, hastalıklarla bağlantılı insan genlerinde yanlış anlama varyantlarının protein fonksiyonunu etkileyip etkilemediğini belirlememize olanak sağlar. Bu, en son teknoloji algoritmalarla bile hesaplamalı olarak gerçekleştirmek zordur. Bu teknik, omurgalı model organizmalara göre daha hızlı ve daha uygun maliyetli bir in vivo sistemi Drosophila melanogaster kullanarak insan proteinlerinde yanlış algısal varyantların hızlı bir analiz sağlar.

Belirli bir varyantın protein fonksiyonunu doğrudan etkilediğini göstermek nadir hastalıkların tanısına katkıda bulunur ve hastalık mekanizması analizi ve potansiyel tedaviler için bir başlangıç noktası görevi görür. Bu protokol özellikle nadir hastalıklarla bağlantılı varyantları incelerken yararlıdır, ancak otizm ve kanser gibi daha yaygın hastalıklara uygulanabilir. Sineklerde protein fonksiyonunu yansıtan tekrarlanabilir fenotiplerin belirlenmesi zor olabilir.

Fenotipler genden gene değişebilir ve ince olabilir. Drosophila kullanan insan proteinlerinin varyantlarının fonksiyonel çalışmaları kurtarma deneyleri veya aşırı ifade çalışmaları dayalı yapılabilir. İşleme başlamadan önce, ilgi insan geni ve model organizma ortologlar hakkında bilgi toplamak.

Sinek görme sisteminde referans ve varyant insan proteinlerini aşırı ifade ederek varyant işlevini test etmek için, Gal4 upstream aktive sırası veya UAS sisteminin kontrolü altında referans veya varyant insan cDNA'larını ifade eden transgenik sinekler üretir. Belirli bir sinek dokusundaki insan proteinlerini ifade etmek için belirli bir Gal4 çizgisi seçmek için, Gal4 hattından üç ila beş bakire dişi, tek şişelerde veya kopyalarda UAS insan cDNA transgenik çizgilerinin her birinden üç ila beş erkek le geçinin. Haçları her iki ila üç günde bir aktararak tek bir haçtan mümkün olduğunca çok sayıda hayvan elde edin ve referans ve varyant suşları arasındaki farkları belirlemek için eclosed hayvanı bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin.

Görünür bir kusur varsa, fenotipleri belgelemek için sinekleri görüntüleyin. Görme sistemindeki fonksiyonel kusurları test etmek için sinekler oluşturmak için, rodopsin 1 Gal4 hattından erkeklere referans veya varyant UAS insan cDNA transgenes ile çapraz bakire kadın fotoreseptörleri R1 ile R6 sinek retinasında ilgi insan proteinleri ifade etmek için. Sinekler kapanmaya başladıktan sonra, taze şişeler halinde soyundan toplamak ve görsel sistemin olgunlaşmasını sağlamak için ek bir üç gün için uygun deneysel sıcaklık seti bir kuluçka için şişeleri geri dönün.

Kuluçka sonunda, uygun bir anestezi yöntemi ile sinekimmobilize ve yavaşça bir cam mikroskop slayt üzerine her sinek bir tarafı yapıştırın. Bir elektroretinogram teçhizatı kurduktan sonra, bir iğne çekmeceiçine 1,2 milimetrelik cam kılcal yerleştirin ve 0,5 milimetreden daha az çapa sahip iki keskin oyuk konik elektrot elde etmek için kılcal tüpü kırın. Hava kabarcıkları önlemek ve gümüş tel elektrotlar üzerinde cam kılcal slayt dikkat alarak 100 milimolar tuzlu çözelti ile kılcal damarlar doldurun.

Kılcal damarları yerinde kenetleyin ve oda sıcaklığında en az 10 dakika boyunca karanlığı tamamlamak için sineklere alışın. Alışkanlığın sonunda, sinekleri içeren kaydırağı kayıt cihazına yerleştirin ve referans taşıyan mikromanipülatörleri ve kayıt elektrotlarını ilgi nin sineğine yaklaştırın. Elektrotun ucunu izleyerek, referans elektrotunu midyeye nüfuz eden sineğin toraksıniçine dikkatlice yerleştirin ve kayıt elektrotunun göz yüzeyine yerleştirin.

Başarılı elektroretinogram kayıtları için, göz delmeden küçük bir gamze neden böylece kayıt elektrot için basınç uygun miktarda uygulamak için dikkat edin. Elektrotlar yerleştirildiğinde, sinekleri karanlık ortama yeniden alıştırmak için birincil ışığı üç dakika lığına kapatın. Yeniden alışma süresinin sonunda, aynı elektrotları kullanarak her koşul başına her döl başına en az 15 sinekten elektroretinogramları kaydederek saniyede bir kez deklanşörü açın ve kapatın.

Referans ve varyant sineklerden elde edilen kayıtlar tamamlandığında, farklılıkları değerlendirmek için referans, varyant ve kontrollerden elektroretinogram kayıtlarını karşılaştırın. Daha sonra elektroretinogram verilerini geçici değişiklikler, depolarizasyon, geçici ler ve repolarizasyon lar için değerlendirin. Bu temsili deneyde, insan referansı TBX2'nin ortolog sinek genini işlevsel olarak değiştirememesi ve kurtarma tabanlı stratejileri imkansız hale getiremediği için TBX2 için aşırı ekspresyon temelli çalışmalar yapılmıştır.

Referans insan TBX2 gözsüz Gal4 kullanarak gelişmekte olan göz ve beynin parçaları aşırı ifade edildiğinde, aşırı ifade yaklaşık% 85 öldürücülük ve göz boyutunda önemli bir azalma ile sonuçlanır. Buna karşılık, varyant transgen öldürücü neden daha az güçlü ve varyant protein fonksiyonunu etkilediğini düşündüren aynı deneysel koşullar altında aynı sürücü kullanarak küçük bir göz fenotip neden olur. Buna ek olarak, bir referans insan TBX2 rodopsin Gal4 kullanarak fotoreseptörlerde aşırı ifade edildiğinde, aşırı ekspresyon elektroretinogram iz önemli bir değişiklik neden olur.

Varyant protein in vivo protein fonksiyonunu etkilediğine dair daha fazla kanıt sağlayarak ifade edildiğinde bu fenotip daha hafiftir. Her genin benzersiz olduğunu, bu nedenle hastalıkla ilişkili tüm varyantların etkisini değerlendirebilecek tek bir deney olmadığını belirtmek önemlidir. İnsan CD'leri ile çalışmaya ek olarak, varyantın ortolog sinek geninin evrimsel olarak korunmuş kalıntılarına benzer varyantlar ekleyerek işlevsel sonuçları olup olmadığını da belirleyebilirsiniz.

Bu yöntemi kullanarak, tanı konulmamış hastalık ağı ve diğer gruplarla işbirliği içinde bir dizi insan hastalığı gen keşif çalışmalarına katkıda bulunduk.