Name: Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Keşfedin, Drosophila melanogaster kullanarak hastalıkla ilişkili nadir insan gen varyantlarının protein fonksiyonuna etkisini hızlı ve maliyet etkin şekilde in vivo analiz etme yöntemini. Bu teknik, nadir hastalıkların tanısına ve potansiyel tedavilere katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jose Salazar, Julia Wang ve Dr. Karen Schulze'ye el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Dr. Ning Liu ve Xi Luo'yu burada tartışılan TBX2 varyantlarının fonksiyonel karakterizasyonu için kabul ediyoruz. Teşhis Edilemeyen Hastalıklar Ağ Modeli Organizmatarama Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ortak Fonu (U54 NS093793) aracılığıyla desteklendi. H. T. C. daha NIH [CNCDP-K12 ve NINDS (1K12 NS098482)], Amerikan Nöroloji Akademisi (Nörobilim Araştırma hibe), Burroughs Wellcome Fonu (Kariyer Ödülü Tıp Bilim Adamları için Kariyer Ödülü), Çocuk Nöroloji Derneği ve Çocuk Nöroloji Vakfı tarafından desteklendi ( PERF Elterman hibe ve NIH Direktörü Erken Bağımsızlık Ödülü (DP5 OD026426). M. F. W. simons Vakfı (SFARI Ödülü: 368479) tarafından daha da desteklenmiştir. S. Y. daha NIH (R01 DC014932), Simons Vakfı (SFARI Ödülü: 368479), Alzheimer Derneği (Yeni Araştırmacı Araştırma Hibe: 15-364099), Naman Aile Fonu Temel Araştırma ve Caroline Wiess Hukuk Fonu araştırma tarafından desteklendi Moleküler Tıp. BCM'de konfokal mikroskopi kısmen NIH Grant U54HD083092 tarafından Entelektüel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi (IDDRC) Nörogörüntüleme Çekirdeği'ne desteklenmektedir.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Drosophila melanogaster kullanarak deneysel çalışmalar hastalık la ilişkili insan varyantları sonuçlarını değerlendirmek için sağlam bir araştırma sistemi sağlar. Bu bilgi ve son yüzyılda sinek alanında birçok araştırmacı tarafından oluşturulan çeşitli genetik araçların büyük vücut kaynaklanmaktadır89. Diğer deneysel sistem gibi, ancak, var olan uyarılar ve sınırlamalar kabul etmek önemlidir.
Veri Madenciliği ile İlişkili Uyarılar Bu protoko...

Nadir hastalığı olan hastalar genellikle doğru bir tanı elde etmek için "tanı odyssey" olarak adlandırılan zorlu bir yolculuk geçmesi1. En nadir hastalıkların güçlü bir genetik kökene sahip olduğu düşünülmektedir, klinik çalışma kritik unsurları genetik / genomik analizler yapma. Aday gen paneli dizileme ve kromozom mikrodizileri, bütün ekzom (WES) ve tüm genom dizileme (WGS) teknolojileri dayalı kopya numarası varyasyon analizi ek olarak son on yıl içinde giderek daha değerli araçlar haline gelmiştir2, 3 . Şu anda, WES ve WGS bilinen bir patojenik varyant ı belirlemek için tanı oranı ~ 25% (pediatrik vakalarda daha yüksek)4,5. Klinik WES/WGS'den sonra tanı konmamış olan vakaların çoğunda, yaygın bir sorun birçok aday gen ve varyantolmasıdır. Yeni nesil sıralama genellikle birçok gende yeni veya ultra nadir varyantları tanımlar ve bu varyantların hastalık fenomenilerine katkıda bulunup bulunmadığını yorumlamak zordur. Örneğin, genlerdeki çoğu saçma veya kare kayma mutasyonunun, kodlanmış transkriptin saçma aracılı çürümesi nedeniyle fonksiyon kaybı (LOF) alelleri olduğu düşünülse de, son ekonlarda bulunan kesilen mutasyonlar bu süreçten kaçar ve iyi huylu veya fonksiyon kazancı (GOF)alel6 .
Ayrıca, yanlış algılamalı alelin etkilerini tahmin etmek yıldırıcı bir görevdir, çünkü ilk olarak Herman Muller tarafından 1930'larda (yani, amorf, hipomorf, hipermorf, antimorf, neomorf veya izomorf) açıklandığı gibi farklı genetik senaryolar bir dizi neden olabilir 7 . Evrimsel koruma, amino asit değişiminin türü, fonksiyonel etki alanı içindeki konumu, genel popülasyondaki alel frekansı, ve diğer parametreler8. Ancak, bu programlar varyant yorumlama karmaşık sorunu çözmek için kapsamlı bir çözüm değildir. İlginçtir, yeni bir çalışmada beş yaygın olarak kullanılan varyant patojenik tahmin algoritmaları (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutasyon Taster) patojenite ~ 8% katılıyorum gösterdi . Özellikle, tüm algoritmalar kabul etse bile, patojenite nin %11'ine kadar yanlış bir tahminde bulunurlar. Bu sadece kusurlu klinik yorumlanmasına yol açmakla kalmıyor, aynı zamanda araştırmacıları yanlış bir şekilde iyi huylu olarak listeleyerek yeni varyantları takip etmekten caydırabilir. Silico modellemede mevcut sınırlamayı tamamlamanın bir yolu, varyant fonksiyonunun in vitro, ex vivo (örn. kültürlü hücreler, organoidler) veya in vivo etkisini gösteren deneysel veriler sağlamaktır.
MO nadir hastalık ilişkili varyantları in vivo fonksiyonel çalışmalar benzersiz güçlü13 var ve Amerika Birleşik Devletleri'nde Tanı konulmamış Hastalıklar Ağı (UDN) ve Nadir dahil olmak üzere dünya çapında birçok nadir hastalık araştırma girişimleri tarafından kabul edilmiştir Hastalıklar Modelleri ve Mekanizmaları (RDMM) Ağları Kanada, Japonya, Avrupa ve Avustralya14. MO araştırmacılarını ulusal ölçekte nadir hastalık tanısı ve mekanistik çalışmaların iş akışına entegre etmek için yapılan bu eşgüdümlü çabalara ek olarak, klinik ve MO araştırmacıları arasında yapılan bir dizi bireysel işbirliği çalışması keşfe yol açmıştır. ve birçok yeni insan hastalığı neden gen ve varyantları82,83,84karakterizasyonu .
UDN'de, merkezi bir Model Organizmalar Tarama Merkezi (MOSC) aday gen ve varyantların sunumlarını hastanın durumunun tanımıyla alır ve varyantın enformatik araçlar kullanılarak patojenik olup olmadığını değerlendirir ve in vivo Deney. UDN'nin Faz I'inde (2015-2018) MOSC, vakaları değerlendirmek için işbirliği içinde çalışan Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] ve Zebrafish Core'dan (Oregon Üniversitesi) oluşuyordu. Drosophila ve zebrabalığı nda bilişim analizi ve farklı deneysel stratejiler bir dizi kullanarak, MOSC şimdiye kadar 132 hastanın tanısına katkıda bulunmuştur, 31 yeni sendromlar belirlenmesi55, birkaç yeni insan keşfi hastalık genleri (örneğin, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) ve bilinen hastalığın fenotipik genişlemesi genler (örneğin, CACNA1A21, ACOX122).
MOSC Drosophila Core araştırmacıları, UDN içindeki projelere ek olarak, Mendelian Genomik Merkezleri ve diğer girişimlerle işbirliği içinde yeni hastalık gen keşiflerine katkıda bulunmuştur (örn. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) bilişim ve genetik aynı seti kullanarak UDN için geliştirilen stratejiler. Nadir hastalık tanısı üzerine MO çalışmalarının önemi göz önüne alındığında, MOSC UDN Faz II (2018-2022) için bir C. elegans Core ve ikinci Zebrafish çekirdek (Her ikisi de Washington Üniversitesi'nde St Louis) içerecek şekilde genişletildi.
Bu el yazması, udn MOSC Drosophila Core'da aktif olarak kullanılan in vivo fonksiyonel çalışma protokolünü açıklar. Protein. Bu protokolün amacı, MO araştırmacılarının klinik araştırma gruplarıyla işbirliği içinde çalışarak, ilgi çeken bir gendeki bir aday varyantın fonksiyonel sonuçları olduğuna dair deneysel kanıtlar sunarak klinik tanıyı kolaylaştırmaktır. Bu protokol en çok, drosophila araştırmacısının, ilgi çeken bir gende belirli bir aday varyantı olan nadir bir hastalık hastası olan bir klinik araştırmacı tarafından yaklaşıldığı bir senaryoda yararlıdır.
Bu protokol üç unsura ayrılabilir: (1) hasta fenotip ve Drosophilafonksiyonel bir çalışmanın fizibilite sorumlu olan ilgi varyantı olasılığını değerlendirmek için bilgi toplama , (2) toplama mevcut genetik araçlar ve yenilerini kurmak ve (3) in vivo fonksiyonel çalışmalar yapmak. Üçüncü öğe, bir ilgi varyantının işlevinin nasıl değerlendirilebileceğine (kurtarma deneyi veya aşırı ifade tabanlı stratejiler) göre iki alt öğeye ayrılabilir. Bu protokolün nadir monojenik hastalık araştırmaları dışında birçok senaryoya uyarlanabildiği ve optimize edilebildiği unutulmamalıdır (örn. yaygın hastalıklar, gen-çevre etkileşimleri ve terapötik hedefleri belirlemek için farmakolojik/genetik ekranlar). Varyantların işlevselliğini ve patojenliğini belirleyebilme becerisi sadece doğru moleküler tanı sağlayarak ilgi çeken hastaya fayda sağlamakla kalmamış, aynı zamanda hem çevirisel hem de temel bilimsel araştırmalar üzerinde daha geniş etkilere de yol açacaktır.

<table><tbody><tr><td>Drosophila UAS-insan cDNA transgenezi için stoklar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transgenez için enjeksiyon suşları (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24871</td><td>Spesifik Reaktif: VK33 (3. kromozom) Transgenez için enjeksiyon hattı</td></tr><tr><td>Enjeksiyon suşları (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24872</td><td>Spesifik Reaktif: VK37 (2. kromozom) Enjeksiyon hattı</td></tr><tr><td><güçlü>Plazmid DNA</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klonlama vektörü</td><td>Thermo Fisher</td><td>#12536-017</td><td>Spesifik Reaktif: pDONR221</td></tr><tr><td>Drosophila transgenez vektörü</td><td>Dr. Johannes Bischof ve Konrad Basler'den Hediye (Bischof ve diğerleri, 2013 PNAS)</td><td></td><td>Spesifik Reaktif: pGW-HA.attB</td></tr><tr><td><güçlü > Moleküler biyoloji kitleri ve reaktifleri < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A2790</td><td>Spesifik Reaktif: Agaroz (moleküler biyoloji sınıfı)</td></tr> <tr><td>Kimyasal Olarak Yetkin Hücreler ( coli )</td> <td>Thermo Fisher</td> <td># 18265017</td><td>Spesifik Reaktif: DH5 ve alfa;</td></tr><tr><td>DNA Jel Ekstraksiyon kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>#K210012</td><td>Spesifik Reaktif: PureLink Jel Ekstraksiyon Kiti</td></tr><tr><td>DNA İzolasyonu ve saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td> <td># 27104</td><td>Spesifik Reaktif: QIAprep Spin Miniprep Kiti</td></tr><tr><td>Yüksek Sadakatli Polimeraz</td><td>NEB</td><td>#M0491</td><td>Spesifik Reaktif: Q5 Polimeraz kiti</td></tr><tr><td>Rekombinaz aracılı klonlama sistemi</td><td>Thermo Fisher</td> <td># 11789020</td><td>Spesifik Reaktif: Ağ Geçidi BP Klonaz kiti</td></tr><tr><td>Rekombinaz aracılı klonlama sistemi</td><td>Thermo Fisher</td> <td># 11791100</td><td>Spesifik Reaktif: Ağ Geçidi LR Klonaz II Enzim kiti</td></tr><tr><td>Siteye Yönlendirilmiş Mutajenez kiti</td><td>Agilent</td> <td># 200523</td><td>Spesifik Reaktif: Hızlı Değişim II Mutajenez kiti</td></tr> <tr><td>< güçlü > Elektroretinogram Teçhizatı ile ilgili ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ERG Analizi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>N/A</td><td>Spesifik Reaktif: Axon pCLAMP 10 Veri Yazılım Paketi</td></tr><tr><td>ERG Veri Toplama</td><td>LabX</td><td>#R150358</td><td>Spesifik Reaktif: ISO-DAM İzole Biyolojik Amplifikatör</td></tr><tr><td>ERG Stimülatörü</td><td>Astro-Med</td><td>#S48</td><td>Spesifik Reaktif: Kare Nabız Stimülatörü</td></tr></tbody></table>

drosophila kullanarak hastalıkla İlişkili nadir İnsan varyantlarının vivo fonksiyonel Çalışmasında

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Sıralama teknolojisindeki gelişmeler, hem klinik tanı hem de son teknoloji insan genetiği araştırmaları için tüm genom ve tüm eknom veri kümelerini daha erişilebilir hale getirmiştir. Bu veri kümelerinde tanımlanan varyantların patojenitesini tahmin etmek için silico algoritmalarında bir dizi siliko algoritma geliştirilmiş olsa da, fonksiyonel çalışmalar, özellikle yanlış anlama için, spesifik genomik varyantların protein fonksiyonunu nasıl etkilediğini belirlemek için kritik öneme sahiptir. Türev -leri. Tanı konulmamış Hastalıklar Ağı 'nda (UDN) ve diğer nadir hastalık araştırma konsorsiyumlarında, Drosophila, C. elegans, zebra balığı ve fareler dahil olmak üzere model organizmalar (MO) aktif olarak putatif insan hastalığına neden olan fonksiyonu değerlendirmek için kullanılır Türev -leri. Bu protokol, UDN'nin Model Organizmalar Tarama Merkezi Drosophila Core'da kullanılan nadir insan varyantlarının fonksiyonel değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlamaktadır. İş akışı, birden fazla genel veritabanlarından insan ve MO bilgilerini toplamak, marrvel web kaynağını kullanarak varyantın hastanın durumuna katkıda bulunup bulunmadığını değerlendirmek ve mevcut temele dayalı etkili deneyler tasarlamak ile başlar. bilgi ve kaynaklar. Daha sonra, genetik araçlar (örneğin, T2A-GAL4 ve UAS-insan cDNA hatları) Drosophilailgi varyantlarının işlevlerini değerlendirmek için oluşturulur. Bu reaktiflerin geliştirilmesi üzerine, varyant işlevini değerlendirmek için kurtarma ve aşırı ifade deneylerine dayalı iki uçlu fonksiyonel tahliller yapılabilir. Kurtarma dalında, endojen sinek genleri referans veya varyant insan transgenleri ile ortolog Drosophila gen yerine "insancıl" vardır. Aşırı ifade dalında, referans ve varyant insan proteinleri dışsal dokuların çeşitli tahrik vardır. Her iki durumda da, herhangi bir çatlanabilir fenotip (örneğin, öldürücülük, göz morfolojisi, elektrofizyoloji) ilgi hastalığı ne olursa olsun, bir okuma olarak kullanılabilir. Referans ve varyant aleller arasında gözlenen farklılıklar varyanta özgü bir etki ve dolayısıyla büyük olasılıkla patojenite yi düşündürmektedir. Bu protokol, bilinen ve bilinmeyen işlevleri olan genlerin putatif insan hastalığına neden olan varyantlarının hızlı ve in vivo değerlendirmelerine olanak sağlar.

Nörogelişimsel Fenotilere Bağlı EBF3'te De novo Missense Varyantının Fonksiyonel Çalışması Hipotoni, ataksi, küresel gelişimsel gecikme ve anlamlı konuşma bozukluğu gibi nörogelişimsel fenotipleri olan 7 yaşındaki bir erkek, Ulusal Sağlık Enstitüleri Tanı konulmamış Hastalıklar Projesi'nde (UDP) hekimler ve insan genetikçileri EBF3'te (Erken B-Hücre Faktörü3) 15'te bir de novo missense varyantı (p.R163Q) saptandırılır, coe (Collier/Olfactory-1/Early B...

Bu protokolün amacı, insan hastalıkları ile ilişkili nadir gen varyantlarının fonksiyonel sonuçlarını değerlendirmek için Drosophila melanogaster'deki in vivo deneylerin tasarımını ve performansını ana hatlarını ortaya çıkarmaktır.

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Bu protokol, hastalıklarla bağlantılı insan genlerinde yanlış anlama varyantlarının protein fonksiyonunu etkileyip etkilemediğini belirlememize olanak sağlar. Bu, en son teknoloji algoritmalarla bile hesaplamalı olarak gerçekleştirmek zordur. Bu teknik, omurgalı model organizmalara göre daha hızlı ve daha uygun maliyetli bir in vivo sistemi Drosophila melanogaster kullanarak insan proteinlerinde yanlış algısal varyantların hızlı bir analiz sağlar.Belirli bir varyantın protein fonksiyonunu doğrudan etkilediğini göstermek nadir hastalıkların tanısına katkıda bulunur ve hastalık mekanizması analizi ve potansiyel tedaviler için bir başlangıç noktası görevi görür. Bu protokol özellikle nadir hastalıklarla bağlantılı varyantları incelerken yararlıdır, ancak otizm ve kanser gibi daha yaygın hastalıklara uygulanabilir. Sineklerde protein fonksiyonunu yansıtan tekrarlanabilir fenotiplerin belirlenmesi zor olabilir.Fenotipler genden gene değişebilir ve ince olabilir. Drosophila kullanan insan proteinlerinin varyantlarının fonksiyonel çalışmaları kurtarma deneyleri veya aşırı ifade çalışmaları dayalı yapılabilir. İşleme başlamadan önce, ilgi insan geni ve model organizma ortologlar hakkında bilgi toplamak.Sinek görme sisteminde referans ve varyant insan proteinlerini aşırı ifade ederek varyant işlevini test etmek için, Gal4 upstream aktive sırası veya UAS sisteminin kontrolü altında referans veya varyant insan cDNA'larını ifade eden transgenik sinekler üretir. Belirli bir sinek dokusundaki insan proteinlerini ifade etmek için belirli bir Gal4 çizgisi seçmek için, Gal4 hattından üç ila beş bakire dişi, tek şişelerde veya kopyalarda UAS insan cDNA transgenik çizgilerinin her birinden üç ila beş erkek le geçinin. Haçları her iki ila üç günde bir aktararak tek bir haçtan mümkün olduğunca çok sayıda hayvan elde edin ve referans ve varyant suşları arasındaki farkları belirlemek için eclosed hayvanı bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin.Görünür bir kusur varsa, fenotipleri belgelemek için sinekleri görüntüleyin. Görme sistemindeki fonksiyonel kusurları test etmek için sinekler oluşturmak için, rodopsin 1 Gal4 hattından erkeklere referans veya varyant UAS insan cDNA transgenes ile çapraz bakire kadın fotoreseptörleri R1 ile R6 sinek retinasında ilgi insan proteinleri ifade etmek için. Sinekler kapanmaya başladıktan sonra, taze şişeler halinde soyundan toplamak ve görsel sistemin olgunlaşmasını sağlamak için ek bir üç gün için uygun deneysel sıcaklık seti bir kuluçka için şişeleri geri dönün.Kuluçka sonunda, uygun bir anestezi yöntemi ile sinekimmobilize ve yavaşça bir cam mikroskop slayt üzerine her sinek bir tarafı yapıştırın. Bir elektroretinogram teçhizatı kurduktan sonra, bir iğne çekmeceiçine 1,2 milimetrelik cam kılcal yerleştirin ve 0,5 milimetreden daha az çapa sahip iki keskin oyuk konik elektrot elde etmek için kılcal tüpü kırın. Hava kabarcıkları önlemek ve gümüş tel elektrotlar üzerinde cam kılcal slayt dikkat alarak 100 milimolar tuzlu çözelti ile kılcal damarlar doldurun.Kılcal damarları yerinde kenetleyin ve oda sıcaklığında en az 10 dakika boyunca karanlığı tamamlamak için sineklere alışın. Alışkanlığın sonunda, sinekleri içeren kaydırağı kayıt cihazına yerleştirin ve referans taşıyan mikromanipülatörleri ve kayıt elektrotlarını ilgi nin sineğine yaklaştırın. Elektrotun ucunu izleyerek, referans elektrotunu midyeye nüfuz eden sineğin toraksıniçine dikkatlice yerleştirin ve kayıt elektrotunun göz yüzeyine yerleştirin.Başarılı elektroretinogram kayıtları için, göz delmeden küçük bir gamze neden böylece kayıt elektrot için basınç uygun miktarda uygulamak için dikkat edin. Elektrotlar yerleştirildiğinde, sinekleri karanlık ortama yeniden alıştırmak için birincil ışığı üç dakika lığına kapatın. Yeniden alışma süresinin sonunda, aynı elektrotları kullanarak her koşul başına her döl başına en az 15 sinekten elektroretinogramları kaydederek saniyede bir kez deklanşörü açın ve kapatın.Referans ve varyant sineklerden elde edilen kayıtlar tamamlandığında, farklılıkları değerlendirmek için referans, varyant ve kontrollerden elektroretinogram kayıtlarını karşılaştırın. Daha sonra elektroretinogram verilerini geçici değişiklikler, depolarizasyon, geçici ler ve repolarizasyon lar için değerlendirin. Bu temsili deneyde, insan referansı TBX2'nin ortolog sinek genini işlevsel olarak değiştirememesi ve kurtarma tabanlı stratejileri imkansız hale getiremediği için TBX2 için aşırı ekspresyon temelli çalışmalar yapılmıştır.Referans insan TBX2 gözsüz Gal4 kullanarak gelişmekte olan göz ve beynin parçaları aşırı ifade edildiğinde, aşırı ifade yaklaşık% 85 öldürücülük ve göz boyutunda önemli bir azalma ile sonuçlanır. Buna karşılık, varyant transgen öldürücü neden daha az güçlü ve varyant protein fonksiyonunu etkilediğini düşündüren aynı deneysel koşullar altında aynı sürücü kullanarak küçük bir göz fenotip neden olur. Buna ek olarak, bir referans insan TBX2 rodopsin Gal4 kullanarak fotoreseptörlerde aşırı ifade edildiğinde, aşırı ekspresyon elektroretinogram iz önemli bir değişiklik neden olur.Varyant protein in vivo protein fonksiyonunu etkilediğine dair daha fazla kanıt sağlayarak ifade edildiğinde bu fenotip daha hafiftir. Her genin benzersiz olduğunu, bu nedenle hastalıkla ilişkili tüm varyantların etkisini değerlendirebilecek tek bir deney olmadığını belirtmek önemlidir. İnsan CD'leri ile çalışmaya ek olarak, varyantın ortolog sinek geninin evrimsel olarak korunmuş kalıntılarına benzer varyantlar ekleyerek işlevsel sonuçları olup olmadığını da belirleyebilirsiniz.Bu yöntemi kullanarak, tanı konulmamış hastalık ağı ve diğer gruplarla işbirliği içinde bir dizi insan hastalığı gen keşif çalışmalarına katkıda bulunduk.

in-vivo-functional-study-disease-associated-rare-human-variants-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu protokol, canlı diseksiyonu tartışıyor.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Biz burada mRNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması için işlemler ve metabolitlerin...

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması<em&gt; Drosophila</em&gt; Kafaları

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve...

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Burada, birçok insan ve model organizma veritabanlarına verimli bir şekilde erişmek ve analiz etmek için bir protokol salıyoruz. Bu protokol, yeni nesil sıralama çalışmalarından tanımlanan hastalığa neden olan aday varyantları analiz etmek için MARRVEL kullanımını göstermektedir.

İnsan Genomik ve Model Organizma Genetiği Bilgilerini Entegre Eden Web Tabanlı Bir Araç olan MARRVEL'de Gezinme

Drosophila melanogaster'da nörodejenerasyon gösteren mutantlar için ekrana ileri genetik bir yaklaşım kullanarak bir protokol sunuyoruz. Bu bir tırmanma tahlil, Histoloji analizi, gen haritalama ve sonuçta nörokoruma süreci ile ilgili yeni genler belirlemek için DNA sıralaması içerir.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

Drosophila göz sistemi, özellikle insan nörodejeneratif hastalıkları olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir araçtır. Bununla birlikte, kaba göz fenotiplerinin manuel olarak ölçülmesi önyargılı ve güvenilmez olabilir. Burada, göz fenotipini tarafsız bir şekilde ölçmek için ilastik ve Flynotyper'ın kullanıldığı bir yöntemi açıklıyoruz.

Drosophila melanogaster Göz Fenotiplerinin Ölçülmesi: ilastik ve Flynotyper'ı Entegre Eden Hesaplamalı Bir Yaklaşım

Bu protokol klonal düzeyde genlerin büyük bir dizi ifadesini değerlendirmek açıklamaktadır. Tek hücreli RT-qPCR örnekleri ve yüzlerce genin için güçlü bir hassasiyetle oldukça güvenilir sonuçlar verir.

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Keşfedin, Drosophila melanogaster kullanarak hastalıkla ilişkili nadir insan gen varyantlarının protein fonksiyonuna etkisini hızlı ve maliyet etkin şekilde in vivo analiz etme yöntemini. Bu teknik, nadir hastalıkların tanısına ve potansiyel tedavilere katkı sağlar.

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Daha fazla video keşfet