Santral hücreleri ve bitki dokularının mekanik özelliklerini ve Turgor basıncını ölçmek için Atomic Force Microkopi kullanımı

Gelişmenin altında yatan mekanizmaları anlamaya çalışırken bitki hücrelerinin mekanik özelliklerinin göz önünde bulundurulması esastır. Atomik kuvvet mikroskobu bu özellikleri ölçmek için kullanılabilir, ve değiştiriş şeklini takip, organlar arasında, dokular, tüm gelişim sel aşamaları. Bu tekniğin temel avantajları, hiçbir invaziv olmasıdır, nispeten hızlı ve doğrudan canlı örnekleri uygulanabilir bu yüzden tedavi gerektirmez.

Bu prosedüre yeni bir kişi için, örneğin cis bölümü gerçekten çok önemlidir, bu nedenle numunenin doğru mekanik fiksasyonuna sahip olduğundan emin olun. Bu yordamın görsel gösterimi, örnek fiksasyonunun inceliklerini, koruyucuların kalite kontrolünü ve ölçüm kurulumunu daha iyi anlamak için önemlidir. Prosedürü gösteren Simone Bovio, bir mühendis ve Yuchen Long, benim laboratuvarda bir post doc olacaktır.

Başlamak için, beş santimetre çapında petri-çanak merkezine çift taraflı bant bir parça yerleştirin. Bir çiçek toybundan teyp için izole edilmiş genesyum bir örnek ekleyin. Hızlı bir şekilde dehidratasyon önlemek için örnek tamamen kaplı olana kadar çanak su ekleyin.

Ardından, örneği bir AFM aşamasına yerleştirin ve başı numunenin üzerine taşıyacak şekilde hareket ettirin. Kantilever kalibre ettikten sonra, yazılım, sistemin QI modunda olduğundan emin olun ve on beş nano newton bir set noktası kuvveti ile örnek yaklaşım. Ardından, dört mikron bir Z uzunluğu ayarlayın ve kırk tarafından kırk ayarlanmış piksel sayısı ile seksen mikron kare seksen olarak tonuyla tonu.

Ardından gelişmiş görüntüleme ayarları paneline gidin ve modu sabit hıza ayarlayın. Ayrıca, set saniyede iki yüz mikron için pist hızları genişletmek ve yirmi beş kilo hertz için örnek oranı. Parametreler ayarlandıktan sonra, ipucunu numunenin ilgi bölgesine taşıyın.

Taranan alanın enkazdan arınmış olduğunu doğrulayın, mümkün olduğunca düz bir bölgeyi bulun ve devreye alın, ardından tarayıp başlamayı ve numunenin hareket edip etmeyeceğini kontrol etmek için hızlı düşük kuvvet taramasını kullanın. Bir kez ilgi alanı olarak konumlandı, kırk altmış altmış Micron kare tarafından kırk bir bölge seçin ve mikron başına iki piksel piksel sayısını artırın. Daha sonra, 100 ila 200 nano metre lik bir girinti elde etmek için set noktasını beş yüz nano newtona yükseltin.

Z uzunluğunu iki mikrona düşürün ve uzatma yolu hızlarını saniyede yüz mikrona çıkarın, ardından numune oranını elli kilohertz'e çıkarın ve numuneyi taramaya başlayın. Tamamlandığında, çıktıyı hem görüntü hem de veri dosyası olarak kaydedin. Veri işleme yazılımını açın ve veri dosyasını yükleyin.

Haritanın tüm eğrilerinde aynı parametreleri kullanmak için toplu işleme düğmesi için bu haritayı kullanın, ardından önceden tanımlanmış işlemi yüklemek için gidin ve hertz fit'i seçin. Ardından, değiştirilebilir taban çizgisi işlemine gidin ve artı eğimi dengelemek için çıkarma ayarlayın ve X dk yüzde kırk ila altmış arasında. Dikey uç konumu sekmesinde, ham veriler üzerinde çalışmayı tercih ediyorsanız, düz sıkı seçeneğini belirleyin.

Uygun uygun modeli seçmek için, elastikiyet sığdırma sekmesine gidin ve beklenen yapışma gücüne göre seçeneklerden birini seçin. Hiçbir veya zayıf yapışma varsa, o zaman yaklaşım eğrisi ni kullanın ve hertz isnader modelini kullanmayı tercih edin. Daha güçlü yapışma durumunda, Dergen Milia Dortoprov veya DMD modelini kullanın ve bir gerizeka eğrisi üzerinde çalışın.

Şimdi nominal uç şekline göre uç geometrik parametreleri ayarlayın. Bu deneyde kullanılan uç küresel bir uç, yarıçapı dört yüz nano metre. Ardından, Poisson oranını 0,5'e ayarlayın ve kaydırma eğrilerini seçin.

Ana penceredeki simgeye tıklayarak ikinci bir elastikiyet sığdırma yordamı ekleyin ve aynı parametre ayarlarını yineleyin. Son olarak, X min'de istenen girintiyi belirtin ve ardından haritanın tüm eğrilerinde önceki adımları doğrulamak için herkese uygulayın. Nokta tsv dosyasında görüntü elde etmek için sonuçları kaydedin.

Hızlı çözelti değişiklikleri ile ölçmek için, yapışkan sakız küçük bir parça tutarak, bir petri kabına bir örnek monte. Sakız ve numune tabanı arasındaki boşluğu biyouyumlu tutkalla hızlı bir şekilde kapatın. Tutkal katılaşmak için bekleyin ve daha sonra sıvı apeks kültür orta, yüzde 0,1 bitki koruma karışımı içeren örnek batırın.

Sistemi kalibre ettikten sonra, satın alma yazılımını açın ve önce çek parametresi penceresine gidin. Orada cantilever's imal bahar sabiti veya belirlenen bahar sabiti için yay sabiti ayarlayın. Daha sonra, uç yarıçapını dört yüz nano metreye, numune poisson oranını 0,5'e, numune hattını hızlı kazanım sağlamak için yüz yirmi sekize, tazyik hızını 0,2 hertz'e ve tbmkör boyutunu bir mikrona ayarlayın.

Sonra rampa penceresine gidin ve rampa boyutunu beş mikrona, trigonometri eşiğini maksimuma ve numune sayısını dört bin altı yüz sekize ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandıkça, numuneye el ile dikkatle yaklaşın. Sonda örnek yüzeyine nispeten yakın olduğunda, yaklaşmayı tıklatın.

Temas üzerine, numuneye veya uca zarar vermeden istenilen dengeye ulaşılıncaya kadar, taramayı kademeli olarak artırın ve tetkik hızını değiştirin. Ölçüm bölgesi istenildiği gibi değilse tazyikin yerini değiştirin. Memnun olduğunuzda, nokta başlatmak ve pencere ateş etmek için düğmesini tıklatın, işaret ve ateş.

Kaydet dizinini ve dosya adını belirtin. Ardından, kaydı başlatmak için bir sonraki tbmm'de rampa'yı tıklatın. Tbmm tamamlandığında, yazılım arabirimi rampa penceresine yönlendirilir.

Girintiniz ekipozisyonları belirtmek için taranan resmin üzerine tıklayın. Böğürtlen merkezinin yakınındaki hücre başına en az üç girintinlik görüş alanı seçin, girintiyi her iki tarafta üç kez tekrarlayacak şekilde ayarlayın ve ardından rampa ve yakalama'yı tıklatın. Analiz yazılımında, nokta MCA dosyasını açın, bu taranmış görüntüüzerinde her kuvvet eğrisikonumunu gösterir.

Sonra analiz edilecek bir kuvvet eğrisi açın. Taban çizgisi düzeltme düğmesini tıklatın ve kaynak taban çizgisi startını genişlete ve kaynak taban çizgisi durmasını genişletene kadar veya sırasıyla yüzde 0 ve yüzde 80'de olana kadar kuvvet eğrisindeki mavi çizgi çizgilerini sürükleyin. Sonra execute tıklayın.

Ardından kutu araç filtresi düğmesini tıklatın ve kuvvet eğrisini düzeltmek için çalıştır'ı tıklatın. Ardından girinti düğmesini tıklatın. Giriş penceresinde, etkin eğriyi genişletmek için ayarlayın, doğrusallaştırılmış modele beşinci yöntem, maksimum kuvvet sığdırsınır yüzde 99, min kuvveti yüzde 75 sınırı sığdır ve sertliğe uygun model.

Kuvvet eğrilerini bir toplu iş halinde analiz edin. Bunu başarmak için, çalışma geçmişi düğmesini tıklatın, rapor dizini belirtin ve aynı tedavi gerektiren diğer kuvvet eğrileri ekleyin. Bittiğinde çalıştır'ı tıklatın.

K değeri toplu iş takıldığında, geçmiş'e tıklayın ve girintin pencereye dönmek için beş girintileme gidin. Bir kez var, maksimum kuvvet yüzde on ve min kuvvet uyum sınırı yüzde bir e göre değiştirin. Sonra Hertzian için uygun model ayarlayın.

Ardından, farklı taranmış kanalları görüntülemek için uygun dosyayı açın. Yüksek kanal penceresinde, bölüm düğmesine tıklayın. Bu turgor basınç kesintisi için gerekli olan örnek yüzey eğriliği ölçümü sağlayacaktır.

Ardından bir hücrenin uzun ekseni boyunca bir çizgi çizin, çizgi çizgi sınırlarını hücre kenarlarına taşıyın ve yarıçap değerini kaydedin. Son olarak metin protokolü boyunca, ortalama genç modülü, bahar sabiti, E, K ve her hücre için turgor basıncı hesaplamak için izleyin. Soldaki görüntü, sağdaki görüntü ilk yüz nano metre girintinin analizinin sonucunu gösterirken, sağdaki görüntü, kullanıcı tanımlı kuvvet kümesi noktasına kadar tüm girintini analiz ederek elde edilen genç modülünün haritasıdır.

Burada, iki harita son derece benzer ancak, girinti derinliği varyasyonu daha iyi yer belirlemek veya iç yapıların davranışı hakkında bilgi sağlamak için yararlı olabilir örnek heterojenleri vurgulamak için bazı durumlarda yol açabilir. Bu haritalardaki her nokta için altta yatan bir kuvvet eğrisi vardır. Burada gösterilen eğri, kayda değer iki etkisi vardır.

Her şeyden önce, kuvvet eğrisinin yaklaşma kısmı 500 nano newtonla biterse. Aşağı doğru uç hareketi devam ediyor. Yani ucun uyguladığı son kuvvet beklenenden daha yüksektir.

Dikkat edilmesi gereken ikinci şey, elips tarafından vurgulanan geri çekme eğrisi üzerindeki dalgadır. Bu tür sallama, ucun hareketi altında hareket eden veya titreşen numunenin bir göstergesi olabilir ve farklı bir fiksasyon yöntemine geçmek gerekebilir. Bu makalede belgelenen yordam kullanılarak, hücre duvarı kalınlığı dışında bir turgor basınç kesintisi için tüm temel parametreler AFM taramaları ve girintiler alınabilir.

Kırmızı haç pozisyonundaki derin girintilerin kuvvet eğrisi, hücre duvarının genç modülüve eğrinin farklı rejimlerinde numunenin belirgin sertliğini tanımlar. Örnek fiksasyon çok önemlidir. Ölçüm işlemi sırasında, numune kararsızlığı belirtilerine dikkat edin.

Dik girintiyi sağlamak için düz yüzeye sahip bir bölgeyi dikkatlice seçin. Bu prosedürü takiben, zaman ve farklı koşullar da mekanik özellikleri izleyebilirsiniz. Bir de korelasyon çalışmaları için konfokal görüntüleri ile mekanik ölçümler bindirme olabilir.

Bu teknik, biyomekaniğin fizyoloji gelişimi ve diğer biyolojik süreçlerle bağlantı kurmasının önünü açmaktadır.