Konveksiyon ile Murine beyin içine antikorların teslimi-gelişmiş teslimat
July 18th, 2019
Konveksiyon-geliştirilmiş teslimat (CED) büyük doku hacimleri doğrudan perfüzyon ile beyin içine terapötik etkili teslim sağlayan bir yöntemdir. Prosedür kateterler ve optimize enjeksiyon prosedürü kullanımı gerektirir. Bu protokol, bir antikor, bir fare beyninde CED için bir metodoloji açıklanmaktadır.
Bu protokol, hedef beyin bölgelerinin ayarlanabilir tek tip perfüzyonu için bir adım kateter sistemi kullanarak küçük kemirgenlerde konveksiyonla geliştirilmiş teslimatı gerçekleştirmek için kullanılabilir. Konveksiyon la geliştirilmiş doğumun avantajı, çok az doku hasarı veya reflü ile kan-beyin bariyerini atlayarak ilgi bölgesine maddelerin teslimine izin verilmesidir. Bu teknik öncelikle beyne antikorlar gibi terapötik maddelerin teslimi için yararlıdır.
Ve bu nedenle birçok nörolojik koşulları hedeflemek için kullanılabilir. Prosedürü gösteren Michal Beffinger, benim laboratuvar bir post-doc olacaktır. 0.1 milimetre iç çapı ve 30 milimetre uzunluğunda 0.325 milimetre lik bir duvar kalınlığı ile erimiş silika kılcal boru bir parça keserek başlayın.
Çatlaklar için boru inceledikten sonra boru açıklıkları pürüzsüz bir yüzeye sahip olduğundan emin olmak için uçları parlatmak için bir mikroforge kullanın. Daha sonra, 10 mikro litrelik şırınganın üzerine 27 kalibrelik bir iğne yerleştirin ve şırıngayı stereotaktik bir robota yerleştirin. Sert bir yüzey üzerinde şırınga taşımak ve iğne ucu ile yüzeye dokunmak için robot kullanın.
Bu pozisyonda nettikten sonra iğnenin içine erimiş silika kılcal damarlarının yerleştirilmesini sağlamak için iğneyi yükseltin ve böylece 20 milimetrelik kılcal damar çıkıntısı iğneden çıkar. Metal iğneden başlayarak ve kapiller alt ucundan on milimetre yukarıda bitirme kılcal üzerinde yüksek viskozite siyanoakrilat yapıştırıcı iki mikrolitre eşit yaymak için bir pipet kullanın. İğneucu referans yüzeyinin üzerinde bir milimetre metal iğne ucundan bir milimetre lik metal iğne ucundan bir milimetre adım oluşturan metal iğne erimiş silika kılcal düzeltmek için metal iğne düşürmek için stereotaktik robot kullanın.
Kateter adımEkim önlemek için metal iğne sonunda oluşan herhangi bir fazla tutkal çıkarın. Tüm fazla tutkal kaldırıldı onaylamak için bir mikroskop altında ucu kontrol edin. Daha sonra yapıştırıcının sertlemesini ve kateterle şırıngayı robottan çıkarması için 15 dakika bekleyin.
Adım kateter testi için katılaşmış %0.6 agarose jel 20 milimetrelik bloklara bölünve adım kateter şırıngasını 10 mikrolitre filtrelenmiş 0,4 trippan mavi solüsyonu ile manuel olarak doldurun. Stereotaktik robotu kullanarak, fiksasyon işlemi sırasında kateterin basamağa sızdırmazlığı değerlendirmek için dakikada 0,2 mikro litre lik bir mikrolitre boya dağıtın. Trypan mavi çözeltisi sadece kateterin ucunda görülmelidir.
Boyayı kağıt mendille silin ve stereotaktik robota bir agarose bloğu yerleştirin. Robotu kalibre edin kateterin ucunun agarose bloğunyüzeyine atıfta bulunuldığını söyledi. Enjeksiyon hacimlerinin orantılı dizisini belirli deneysel plana göre ayarlayın.
Murine kaudate putamen içine çözelti enjekte etmek için, 3.5 milimetre derinlikte bregma konumundan bir milimetre frontal ve bir buçuk-iki milimetre lateral enjeksiyon ayarlayın. İğne pozisyonda yken konveksiyon geliştirilmiş teslimat prosedürüne başlayın ve agarose bloğuna beş mikrolitre trippan mavisi çözelti enjekte edin. Agarose'daki trypan mavi bulutunun şeklini ve kateter yolu boyunca olası sızıntıları değerlendirin.
Metal iğnenin ucu üzerinde büyük bir geri akış görünmemelidir. Enjeksiyondan sonra kateteri dakikada bir milimetre geri çekmeden önce kateteri iki dakika yerinde bırakın ve sıvının beyne doğru bir şekilde dağılmasını ve çıkarma sırasında enjeksiyon yollarının sızdırmazlık etmesini sağlayın. Robotun içine yeni bir agarose bloğu yerleştirin ve agarose içinde kateter tıkanmasını değerlendirmek için dakikada 0,2 mikro litre bir mikrolitre ikinci bir enjeksiyon başlatmak.
Trippan mavisi, enjeksiyon başladıktan hemen sonra kateterin ucundan tekrar bir bulut oluşturmalıdır. Daha sonra şırıngadaki artık hacmin 3 mikrolitreye karşılık gelip gelmediğini değerlendirin, çünkü herhangi bir varyasyon kateter montajı veya şırınga pistonu aracılığıyla sıvı sızıntısına işaret edebilir. Murine striatum içine antikor enjeksiyonu için bir anestezi Fare deri çimdik yanıt eksikliği onaylamak ve bir saç düzeltici ile baş tıraş.
İyot çözeltisi ile ıslatılmış pamuklu bezler ile cildi dezenfekte edin. Göz seviyesinde bitirme kranial orta hat boyunca 10 milimetrelik deri kesi yapmak için bir neşter kullanın. Burun kelepçesi ve kulak çubuklarını kullanarak stereotaktik çerçevedeki fareyi düzeltin ve kafatası yüzeyinin yatay ve sıkıca sabitlenmiş olduğuna dikkat edin.
Şırıngayı stereotaktik robota yerleştirin ve matkap ucunu kateterin ucuyla bir referans noktasına senkronize edin. Deriyi geri çekmek ve kafatası yüzeyinde bregma lokalize etmek için forceps kullanın. Matkap ucu nu kullanarak yazılım referans bregma ve bregma konumundan bir milimetre frontal ve iki milimetre lateral matkap taşıyın.
Dura mater zarar ve çapak deliğinden şırınga taşımak için dikkat eden bir çapak delik matkap. Kateterde hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için şırıngadan 0,5 ila bir mikrolitre dağıtın. Konveksiyon geliştirilmiş teslimat başlatın gösterildiği gibi, enjeksiyon noktadan sıvı geri akışı herhangi bir iz için kafatası yüzeyini gözlemleyerek.
Teslimat ve kateter çıkarılması sonunda enjeksiyon sırasında kateter tıkanma kanıt olup yok etmek için dakikada 0,2 mikro litre enjeksiyon pompası başlatın. Tıkanma meydana gelmiyorsa kateter ucundan gelen enjeksiyon karışımının hemen gözlendiği gözlenmelidir. Bir mikrolitre boyanın dakikada 0,5 mikro litre olarak enjeksiyonundan sonra oluşan trippan mavisi bulutunun bu görüntüsünde, konveksiyon gelişmiş kateter kullanılarak, kateter basamanın başlangıcında iğne yolu boyunca reflü görülmüyordu.
Ve dağınık bulut istenilen küresel şekli oluşturdu. Bu resimde künt bir uç iğnesi kullanılarak önemli reflü görülebilir. Özellikle, konveksiyon geliştirilmiş teslimat geleneksel enjeksiyon ile karşılaştırıldığında bir üniforma ve daha az doku zarar şekilde murine beyne büyük hacimlerde perfüzyon sağlar.
Her iki teslim türünde de korpus callosum üzerinde antikor ve dekstran parçacıkların tipik bir dağılım profili vardır. Ancak, enjekte edilen antikor dağılım profili konveksiyon gelişmiş doğum sonrası yüksek molekül ağırlıklı dextran için gözlenenden daha dağınık, farklı infusates arasındaki dağılım farklılıkları örnek. Kateter potansiyel beyin infüzyonu sırasında tıkanıklık gibi, yavaş yavaş infusate küçük bir hacim dağıtarak hemen sonra kontrol etmek önemlidir.
Bu prosedür beyne farmakolojik olarak aktif bileşikler sunmak için bir yol olarak hizmet verebilir ve hastalık belirtileri ve beklenen yan etkileri yakından izlenmesi takip edilmelidir. Bu teknik, antikorlar da dahil olmak üzere terapötik ile hassas bir beyin bölgesiin infüzyon sağlar, merkezi sinir sistemi hedefli tedavilerin gelişimi için yeni olanaklar açılması.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, beyne etkin terapötik madde ulaştırımı için konveksiyonla geliştirilmiş ulaştırım (CED) yöntemini araştırmaktadır, özellikle fare modelinde antikor ulaştırımını kullanarak. Yöntem, doku hasarını en aza indirerek kan-beyin bariyerinin aşılmasını sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Terapötik Ulaştırım
- Nöroteknoloji
Arka Plan
- Konveksiyonla geliştirilmiş ulaştırım, hedef beyin bölgelerine doğrudan perfüzyona izin verir.
- Bu teknik, antikorlar gibi terapötik maddelerin ulaştırılmasında avantajlıdır.
- Kan-beyin bariyerinin atlanması, nörolojik durumların hedeflenmesini artırabilir.
- Bir kateter sistemi ve optimize edilmiş enjeksiyon protokolleri gerektirir.
Çalışmanın Amacı
- Farelerin beyninde bir antikorun CED'si için bir yöntemi optimize etmek.
- Bu gelişmiş ulaştırım tekniğinin uygulanmasını göstermek.
- Olası sızıntıları değerlendirmek ve başarılı ulaştırımı doğrulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Küçük kemirgenlerde bir adım kateter sisteminin kullanımı.
- Terapotiğerin konveksiyonla geliştirilmiş ulaştırımını incelemek için fare modeli.
- Kritik adımlar kateter hazırlığı, konumlandırma ve enjeksiyon tekniklerini içerir.
- Ulaştırım etkinliğinin trypan mavisi kullanılarak değerlendirilmesi ve reflü ve tıkanma izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, beyinde minimal geri akış ve optimal dağılım ile hedefe yönelik ulaştırımı sağlar.
- Trypan mavisi bulutunun şekli aracılığıyla enjeksiyon etkinliğinin görsel olarak doğrulanması.
- Görevler sırasında kateter sızdırmazlığının korunmasını doğrulayan önemli sızıntı gözlenmedi.
Sonuçlar
- Çalışma, nörolojik araştırmalarda terapötik ulaştırım için etkin bir CED yöntemi gösterir.
- Bu teknik, çeşitli nörolojik bozuklukların terapötik müdahalelerini artırabilir.
- Sonuçlar, hedefe yönelik ilaç ulaştırımı metodolojilerinin geliştirilmesini içerir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Convection-enhanced delivery (CED) enables targeted perfusion of therapeutic antibodies into the murine brain by bypassing the blood-brain barrier, addressing a critical challenge in CNS drug development. This technique supports mechanistic de-risking by allowing precise regional delivery with minimal tissue damage, facilitating evaluation of target engagement and pharmacological activity in disease-relevant brain regions. CED provides a reproducible platform for preclinical assessment of biologics, improving predictive confidence in lead identification and portfolio prioritization for neurological indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by delivering antibodies directly to defined brain regions such as the caudate putamen.
- Operational Value: Supports functional target validation through controlled infusion of therapeutic agents with measurable dispersion patterns.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies by confirming delivery to sites of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts via visual assessment of infusate dispersion (e.g., trypan blue cloud shape) to evaluate catheter performance and sealing integrity.
- Operational Value: Standardizes delivery parameters through step catheter design and ramping injection protocols, enhancing reproducibility across experiments.
- Assay Readiness: Enables preparation of validated biological systems for downstream evaluation of antibody distribution and potential off-target effects.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models delivery of antibodies to striatum-associated circuits, supporting preclinical evaluation for neurological conditions involving motor or cognitive dysfunction.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by providing a scalable method for regional brain perfusion applicable to various therapeutic modalities.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming delivery fidelity and identifying risks such as catheter clogging or backflow prior to efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
CED integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, enabling consistent delivery of antibodies and other biologics to the brain.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing controlled delivery of antibodies to interrogate pathway modulation in specific brain nuclei.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with uniform perfusion, supporting reliable compound or antibody evaluation in vivo.
- Analytics: Provides quantitative and qualitative outputs including dispersion profiles, backflow assessment, and catheter patency checks to compare delivery conditions.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical validation by enabling repeated, standardized delivery of therapeutics to disease-relevant brain regions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable catheter-based platform adaptable to various infusates (antibodies, chemotherapeutics, viral particles) and infusion volumes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by confirming delivery of therapeutics to the brain parenchyma with minimal reflux.
- Operational Value: Improves standardization and scalability through defined catheter preparation, stereotactic positioning, and programmable infusion protocols.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk associated with inadequate CNS exposure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antibody candidates based on demonstrated delivery capability to target brain regions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, stereotactic navigation, and catheter fabrication using fused silica and adhesive bonding techniques.
- Depends on precision instrumentation including stereotactic robots, microforges, and programmable infusion pumps for consistent catheter placement and flow control.
- Necessitates cross-team standardization of catheter testing procedures (e.g., trypan blue dispersion in agarose) to ensure sealing integrity and prevent clogging.
- Involves adaptation considerations across model systems, including adjustments to catheter length, infusion volume, and target coordinates based on brain size and anatomy.
- Includes practical limitations such as potential catheter clogging during infusion, requiring post-delivery patency checks via slow infusate dispensing.
