Name: Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Öğrenin, kondrositlerde mekanobiyolojiyi incelemek için pnömatik mikroakışkan sıkıştırma cihazının nasıl üretildiğini. Bu yöntem, 3D hidrojel kültürlerde çoklu sıkıştırma uygulayarak hücre davranışlarını analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Christopher Moraes ve Stephen A. Morin'e cihaz tasarımı ve imalatına verdikleri destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Nebraska-Lincoln Üniversitesi (UNL) ve Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi'nden (UNMC) İnsan Sağlığı için Biyomühendislik bursu ile desteklenmiş ve NIH/NIAMS'tan AR070242 hibesi verilmiştir. Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi'ndeki İleri Mikroskopi Çekirdek Tesisi'nden Janice A. Taylor ve James R. Talaska'ya konfokal mikroskopi konusunda yardımcı olduklarından dolayı teşekkür ederiz.

NOT: Bu protokoldeki her adım için eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyin.
1. Ana kalıp imalatı
NOT: Adım 1.1 - 1.3'ü duman kaputunda gerçekleştirin.
<ol><li>Cam işleme NOT: Adım 1.1 için yüz kalkanı, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.<ol>
<li>3:1 hacim oranı ile sülfürik asit (H2SO4)ve hidrojen peroksit (H2O2)karıştırılarak Piranha çözeltisi (60 mL) yapın. DİkKAT: Patlama tehlikesi nedeniyle piranha solüsyonu ve asetonu aynı duman kaputunda kullanmayın.</li>
		<li>Piranha çözeltisindeki cam plakayı (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) 40 °C'de 30 dk'ya yerleştirin.</li>
		<li>Cam plakayı deiyonize suyla (diH2O) durulayın.</li>
		<li>10 dakika oda sıcaklığında aseton cam plaka yerleştirin.</li>
		<li>Cam plakayı isopropanol ile durulayın ve azot (N2)gazıyla kurulayın.</li>
		<li>Cam tabağı 200 °C'de 20 dk sıcak bir tabakta pişirin. Sonraki tüm pişirme adımları sıcak bir tabak kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cam plaka üzerinde SU-8 tohum tabakası oluşumu<ol>
<li>SU-8 5'i cam plakaya tek kullanımlık pipetle yayarak plakanın yüzey alanının yaklaşık 2/3'ünü kaplayın.</li>
		<li>35 s (ilk iplik döngüsü) için 500 rpm SU-8 5 photoresists ile cam plaka spin ve daha sonra 2.500 rpm için 40 s (son iplik döngüsü) bir spin coater kullanarak. Sonraki tüm spin kaplama adımları aynı ilk dönme döngüsünü içerir.</li>
		<li>SU-8 5 kaplamalı cam plakayı 65 °C'de 2 dk, 95 °C'de 5 dk pişirin.</li>
		<li>SU-8 5 kaplamalı cam plakayı UV ışığına maruz bırakın (60 mW/cm2,UV lambası ile fotomaske arasındaki mesafe 20 cm, toplam UV ışık enerjisi miktarı = 60 mJ/cm2)1 s. NOT: UV maruzkalma süresi kullanılmış UV ışığının gücüne göre ayarlanmalıdır.</li>
		<li>SU-8 5 kaplamalı cam plakayı 65 °C'de 2 dk, 95 °C'de 5 dk pişirin.</li>
		<li>2 dakika su-8 geliştirici pişmiş cam plaka yerleştirin.</li>
		<li>SU-8 5 kaplamalı camı 180 °C'de 20 dk pişirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fotolitografi ile SU-8 kanal desen imalatı (Şekil 2a Adım 1-3)<ol>
<li>SU-8 100'ü SU-8 5 tohumlu cam plakaya dökün ve plakanın yüzey alanının yaklaşık 2/3'ünü kaplayın.</li>
		<li>38 s (, 90 μm kalınlığında) için 3.000 rpm SU-8 100 ile cam plaka spin.</li>
		<li>SU-8 100 kaplı cam plakayı 65 °C'de 10 dk, 95 °C'de 30 dk pişirin. Bu işlemden sonra SU-8 100 hala yapışkansa, SU-8 100 yapışkan olmayana kadar cam plakayı 95 °C'de daha uzun süre pişirin.</li>
		<li>SU-8 100 kaplamalı cam plakanın üzerine yüksek çözünürlüklü mikrokanallı fotomaske (25.400 dpi, Bkz. Ek Şekil 1)yerleştirin ve fotomaske kaplı cam plakayı 4 s (toplam UV ışık enerjisi miktarı = 240 mJ/cm2)UV ışığına maruz bırakın. NOT: UV maruzkalma süresi kullanılmış UV ışığının gücüne göre ayarlanmalıdır.</li>
		<li>Fotokopiyi cam plakadan çıkarın ve cam plakayı 65 °C'de 2 dk, 95 °C'de 20 dk pişirin.</li>
		<li>Bir kapta pişmiş cam plaka tutun, hangi alüminyum folyo ile sarılmış herhangi bir ışık engellemek için, gecede kür için.</li>
		<li>15 dakika boyunca SU-8 geliştiricisi cam plaka üzerinde SU-8 100 kanal desenleri geliştirin.</li>
		<li>SU-8 desenli cam plakayı (ana kalıbı) izopropil alkolle yıkayın ve N2 gaz ile kurulayın. Bu işlem sırasında beyaz parçacıklar kalırsa, adım 7'yi 5 dakika boyunca tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Pnömatik aktüasyon ünitesi
<ol><li>Mikrokanal katmanı (Katman 1) NOT: 2.1.1 - 2.1.2 adımlarını duman kaputunda gerçekleştirin.<ol>
<li>200 μL 'lik (Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane'i bir kapak kayması üzerine bırakın ve ana kalıbı olan bir vakum odasına yerleştirin.</li>
		<li>Odada 2 dakika vakum uygulayın ve kalıp silanization için 6 saat (veya bir gecede) bekleyin.</li>
		<li>5 dakika boyunca 10:1 (prepolymer:kür leme maddesi) ağırlık oranı ile PDMS karıştırın. NOT: Sonraki tüm PDMS döküm adımı aynı prepolimer ve kür ajan ağırlık oranını içerir (10:1).</li>
		<li>30 dakika boyunca bir vakum odasında ana kalıp ve degas PDMS üzerine PDMS dökün.</li>
		<li>Sandviç PDMS şeffaflık film bir parça ile.</li>
		<li>Yukarıdaki sandviç tertibatı cam plaka, köpük pedler ve pleksiglas plakalarla kelepçele(Şekil 2a Adım 4).</li>
		<li>80 °C'de bir fırında 6 saat boyunca PDMS'yi tedavi edin.</li>
		<li>PDMS katmanını (Katman 1) şeffaflık filmi ile sandviç yapısından yalıtın(Şekil 2a Adım 5).</li>
		<li>1 dk boyunca plazma temizleyici kullanarak Katman 1 ve temiz cam plaka (Cam plaka 1; 50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) yüzeyleri etkinleştirin. NOT: Plazma temizleme süresi kullanılmış bir plazma temizleyicisinin gücüne bağlı olarak değişebilir.</li>
		<li>Bond Layer 1 Cam plaka 1 üzerine ve 30 dakika boyunca 80 °C fırında yerleştirin.</li>
		<li>Saydamlık filmini Katman 1'den kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İnce PDMS membran (Katman 2)<ol>
<li>Spin kat 60 μm kalınlığında PDMS tabakası elde etmek için 1 dakika için 1.000 rpm bir şeffaflık filmi üzerinde PDMS uncured.</li>
		<li>80 °C'de 20-30 dk.</li>
		<li>1 dk plazma temizleyici kullanarak Cam plaka 1 ve Katman 2 Katman 1 etkinleştirin. NOT: Plazma temizleme süresi kullanılmış bir plazma temizleyicisinin gücüne bağlı olarak değişebilir.</li>
		<li>Katman 2'yi Katman 1'e bağlayın ve bir gecede 80 °C'de fırına koyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Boru bloğu<ol>
<li>Metal tüpleri bir petri kabına dikey olarak yerleştirin.</li>
		<li>Metal tüplerin yaklaşık 3/4'ünü batırmak için yavaşça çanağa PDMS dökün.</li>
		<li>60 °C'de 6 saat (veya bir gece) için fırında PDMS cure.</li>
		<li>Bir metal tüp içeren PDMS blok bir parça kesin.</li>
		<li>Giriş için Katman 2'de bir delik aç.</li>
		<li>1 dakika boyunca plazma temizleyicikullanarak PDMS bloğu ve Layer 2 etkinleştirin.</li>
		<li>PDMS bloğunu Katman 2'nin giriş kısmına takın ve tüm aktüasyon ünitesini bir gece boyunca 80 °C'de fırına yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Aljinat-kondrosit (veya boncuk) yapılar
<ol><li>Amino-silanized cam plaka<ol>
<li>Bir cam plakayı (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) iki yarım boyutlu cam plaka (50,8 mm × 38,1 mm × 1,2 mm) bir elmas karalama kullanarak kesin.</li>
		<li>Cam plakaları 0,2 M hidrojen klorür (HCl) içine yerleştirin ve bir gecede hafifçe çalkalayın (örn. 55 rpm).</li>
		<li>DiH2O ile cam plakaları durulayın.</li>
		<li>Cam plakaları 0,1 M sodyum hidroksit (NaOH) ile 55 rpm'de 1 saat çalkalayın ve diH2O ile durulayın.</li>
		<li>Cam plakaları %1 (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) ile 55 rpm'de 1 saat çalkalayın ve diH2O ile durulayın.</li>
		<li>Bir gecede bir duman başlık içinde amino-silanized cam plakaları kuru.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aljinat jel iper için Agarose jel kalıp<ol>
<li>DiH2O'da %5 (w/v) agarose ve 200 mM kalsiyum klorür (CaCl2)karıştırın.</li>
		<li>Bir mikrodalga fırın (veya sıcak bir tabak) ile agarose jel çözeltisi kaynatın. Kaynama süresi agarose jel çözeltisinin hacmine ve mikrodalga fırının gücüne (veya sıcak plakanın sıcaklığına) göre değişir.</li>
		<li>Bir alüminyum kalıp üzerine haşlanmış agarose jel çözeltisi dökün (Ek Şekil S2bakınız ), ve bir cam plaka ile sandviç.</li>
		<li>5 dk bekleyin ve alüminyum kalıp katılaşmış agarose jel unmold.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Büyüme plaka kondrosit hasat<ol>
<li>Yenidoğan farelerin arka uzuvlarından büyüme plakalarını izole edin.</li>
		<li>Hücre dışı matriksi (ECM) kaldırmak için büyüme plakalarını 37 °C'de bir kuvözde 3 saat için %0,25 kollajenaz ve %8 karbondioksit (CO2)şeklinde 1 mL'ye yerleştirin.</li>
		<li>Bir kondrosit pelet yapmak ve örnekten supernatant kaldırmak için 125 x g 5 dakika için sindirilmiş örnek santrifüj. Burada, 1 x g yerçekiminin ivmesidir.</li>
		<li>Dulbecco modifiye Kartal orta (DMEM) 1 mL kondrosit pelet resuspend.</li>
		<li>Hücre sayacı kullanarak DMEM'deki kondrosit sayısını sayın.</li>
		<li>DMEM'deki kondrositleri 125 x g'de 5 dk için santrifüj edin ve tekrar kondrosit peletyapın ve numuneden supernatant çıkarın.</li>
		<li>İsteğe bağlı olarak, 2 μM calcein içeren kondrosit kültür ortamı (CCM)34'teki kondrosit peletini yeniden askıya alın ve 30 dk.</li>
		<li>Kondrosit peletini istenilen ccm hacminde yeniden askıya alın ve kullanmadan önce 37 °C ve %8 CO2'de kuvözde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aljinat-kondrosit (veya boncuk) yapıları (Şekil 2c)<ol>
<li>Fosfat tamponlu salin (PBS) ile %1.5 (w/v) aljinat ile 5 mg/mL sulfo-NHS, 10 mg/mL 1-etil-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid hidroklorür (EDC) ile karıştırın.</li>
		<li>Aljinat jel çözeltisinin 1 mL'sine 8 x 106 kondrosit ekleyin [veya aljinat jel çözeltisinin 1 mL'sine 1 mL'lik 1 μm çapında floresan boncukların (542/612 nm) 3 μL'sini ekleyin (%0.3 (v/v)].</li>
		<li>Adım 3.1'de imal edilen amino silanlaştırılmış cam plakaüzerine aljinat-kondrosit (veya boncuk) çözeltisinin 150 μL'sini yerleştirin.</li>
		<li>3 dakika agarose jel kalıp ile aljinat jel çözeltisi kapağı.</li>
		<li>Bir jilet ile agarose jel kalıp taşan aşırı aljinat jel çözeltisi çıkarın ve agarose jel kalıp kaldırın. Daha sonra, silindirik aljinat-kondrosit (veya boncuk) yapıları amino-silanized cam plaka üzerinde elde edilir.</li>
		<li>Daha fazla polimerizasyon için 1 dk için çapraz bağlama çözeltisi (50 mM CaCl2 / 140 mM NaCl diH2O) aljinat-kondrosit yapıları yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cihaz montajı (Şekil 2d)
NOT: PDMS boşlukve 3D baskılı kelepçeler ayrı olarak hazırlanmalıdır.
<ol><li>Aktüasyon ünitesinin Katman 2'nin dört köşesinde 1 mm kalınlığında PDMS boşluk bulun.</li>
	<li>Katman 2'nin hava odalarını kapsayacak şekilde 700 μL CCM yerleştirin.</li>
	<li>Alginate-kondrosit (veya boncuk) yapılarını Katman 2'ye yerleştirin ve yapıları hava odalarıyla dikkatlice hizalayın.</li>
	<li>Cihazı 3D baskılı kelepçelerle kelepçele (Şekil 1c).</li>
</ol>5. Cihazın harekete girmesi
<ol><li>Bir hava pompasının çıkışını (Bkz. Malzeme Tablosu)silikon borulu bir solenoid vana girişiyle bağlayın.</li>
	<li>Solenoid valfin çıkışını, monte edilmiş cihazın girişine silikon bir boruyla bağlayın.</li>
	<li>Solenoid valfi bir fonksiyon jeneratörü ile bağlayın.</li>
	<li>Solenoid valfi, fonksiyon jeneratörü tarafından oluşturulan kare dalga (örn. 1 Hz) ile manipüle edin.</li>
	<li>Cihazı pnömatik olarak harekete geçirmek için hava pompasını açın.</li>
</ol>6. Cihazda kondrosit lerin görüntülenmesi
NOT: İyi bir görüntü kalitesi elde etmek için, genişletilmiş PDMS balonları ve hava odaları optik görüntüleri bozabilir, çünkü Cam plaka 2 ile aljinat jel görüntü kondrositler (veya floresan boncuklar). Görüntüleme için ters bir mikroskop kullanılıyorsa, glass plaka 2'nin aşağıya bakacak şekilde cihazın kurulumu gerekir.
<ol><li>Önceki bölümlerde gösterildiği gibi kondrositler (veya floresan boncuklar) ile cihazı hazırlayın.</li>
	<li>Kondrositlerin (veya floresan boncukların) sırasıylasıkıştırma öncesi ve altında konfokal mikroskopla z-yığın görüntülerini alın. Kullanılan konfokal görüntüleme sisteminin alan derinliğine göre zadım boyutu seçin.</li>
	<li>Kondrosityüksekliği (veya bir aljinat-boncuk yapı) önceki literatürde gösterilen otomatik görüntü işleme yöntemi ile ölçülebilir26,35.</li>
</ol>

<ol><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).</li>
<li>Malek, A. M., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+endothelial+cell+shape+change+and+cytoskeletal+remodeling+in+response+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress.</a> Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).</li>
<li>Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+meet+cell+biology%3A+bridging+the+gap+by+validation+and+application+of+microscale+techniques+for+cell+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays.</a> BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).</li>
<li>García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+arrays+for+high-throughput+screening+of+cellular+response+to+cyclic+substrate+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation.</a> Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).</li>
<li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).</li>
<li>Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+chondrocytes+cultured+in+agarose+in+response+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 71(2008).</li>
<li>Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compressive+mechanical+modulation+alters+the+viability+of+growth+plate+chondrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).</li>
<li>Ménard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamic+loading+reduces+bone+growth+without+histomorphometric+changes+of+the+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate.</a> Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).</li>
<li>Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+appositional+and+longitudinal+bone+growth+in+the+rat+ulna+by+applied+static+and+dynamic+force%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force.</a> Bone. 29 (2), 105-113 (2001).</li>
<li>Sergerie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+plate+explants+respond+differently+to+in+vitro+static+and+dynamic+loadings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings.</a> Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).</li>
<li>Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamic+bone+growth+modulation+is+less+detrimental+but+as+effective+as+static+growth+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation.</a> Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).</li>
<li>Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+response+of+the+intervertebral+disc+to+dynamic+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading.</a> Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).</li>
<li>Zimmermann, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+deformation+of+growth+plate+chondrocytes+in+stress-controlled+static+vs+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression.</a> Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).</li>
<li>Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+versus+dynamic+loading+in+the+mechanical+modulation+of+vertebral+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth.</a> Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).</li>
<li>Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+distraction+and+compression+on+proliferation+of+growth+plate+chondrocytes%3A+A+study+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthopaedica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits.</a> Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).</li>
<li>Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+and+cellular+morphological+changes+in+growth+plate+explants+under+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression.</a> Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).</li>
<li>Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+modulation+of+calf+tail+vertebral+growth%3A+implications+for+scoliosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Spinal+Disorders%22%5BJournal%5D)">Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression.</a> Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).</li>
<li>Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+static+compressive+loading+on+aggrecan+and+type+II+and+X+collagens+in+the+rat+growth+plate+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix.</a> Bone. 44 (2), 306-315 (2009).</li>
<li>Reich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weight+loading+young+chicks+inhibits+bone+elongation+and+promotes+growth+plate+ossification+and+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).</li>
<li>Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlargement+of+growth+plate+chondrocytes+modulated+by+sustained+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery%22%5BJournal%5D)">Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading.</a> Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).</li>
<li>Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+growth+plate+associated+with+growth+modulation+by+sustained+compression+or+distraction%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction.</a> Bone. 41 (2), 197-205 (2007).</li>
<li>Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+growth+plate+chondrocytes%3A+previous+approaches+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions.</a> Experimental Mechanics. , (2018).</li>
<li>Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+microfluidic+cell+compression+device+for+high-throughput+study+of+chondrocyte+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology.</a> Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).</li>
<li>Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compression-induced+changes+in+the+shape+and+volume+of+the+chondrocyte+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus.</a> Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).</li>
<li>Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+deformation+of+isolated+chondrocytes+in+agarose+subjected+to+cyclic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Engineering+%26+Physics%22%5BJournal%5D)">Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression.</a> Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).</li>
<li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+platforms+for+mechanically+dynamic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e224(2010).</li>
<li>Sim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li>
<li>Hosmane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valve-based+microfluidic+compression+platform%3A+single+axon+injury+and+regrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth.</a> Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).</li>
<li>Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+microfluidic+device+designed+for+cyclic+compression+of+single+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).</li>
<li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interconnectable+dynamic+compression+bioreactors+for+combinatorial+screening+of+cell+mechanobiology+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).</li>
<li>Erickson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable%2C+three-dimensional+in+Vitro+culture+model+of+growth+plate+cartilage+using+alginate+hydrogel+acaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).</li>
<li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li>
<li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Kompresif stresin büyüme plakası kondrositleri üzerindeki etkilerini test etmek için, 3D için aljinat hidrojel iskelesindeki kondrositlere çeşitli kompresif stres düzeyleri uygulamak için mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazını(Şekil 1)geliştirdik. yüksek iş verme yollarında kültür. Diğer araştırmacıların cihazıbenimsemelerine veya benzer cihazlar geliştirmelerine yardımcı olmak için, bu protokol makalesinde cihaz üretim adımlarının ayrıntılarını sağladık.
Bu p...

Mikro-mühendislik platformları moleküler, hücresel ve doku düzeyi biyolojisini incelemek için değerli araçlardır çünkü hem fiziksel hem de kimyasal mikroortamların dinamik kontrolünü sağlarlar1,2,3 ,4,5,6,7,8. Böylece, birden fazla hipotez aynı anda sıkı bir şekilde test edilebilir. Büyüme plaka kıkırdağı durumunda, büyüme plaka kıkırdak9,10,11eylem yoluyla kemik büyümesi modüle kompresör stres önemli bir rol artan kanıtlar vardır, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Ancak, kompresif stres eylem mekanizması - özellikle, nasıl stres büyüme plaka kondrosit sütunoluşumunu yönlendirir - kötü anlaşılmaktadır.
Bu protokolün amacı, büyüme plakası kondrositlerde mekanobiyolojinin mekanizmalarını açıklamak için pnömatik olarak harekete geçirici mikroakışkan kondrosit kompresyon cihazı26 oluşturmaktır (Şekil 1a-c). Cihaz iki bölümden oluşur: pnömatik aktüasyon ünitesi ve aljinat jel yapı. Mikroakışkan pnömatik aktüasyon ünitesi foto- ve yumuşak litografiye dayalı polidimetilsiloksane (PDMS) kullanılarak imal edilmistir. Bu ünite, çaplarına göre farklı şekilde şişirilebilen 5 x 5 dizi ince PDMS membran balon içerir. Aljinat jel yapısı aljinat jel silindir5 x 5 dizi gömülü kondrositoluşur, ve tüm aljinat-kondrosit yapıları aktüasyon ünitesi ile monte edilir. Aljinat jel yapıları pnömatik şişirilmiş PDMS balonları tarafından sıkıştırılır(Şekil 1b). Mikroakışkan cihaz, PDMS balon çapındaki farklılıklara bağlı olarak tek bir platformda aynı anda beş farklı düzeyde sıkıştırma oluşturabilir. Böylece birden fazla sıkıştırma koşullarında kondrosit mekanobiyolojisinin yüksek iş gücü testi mümkündür.
Bu protokolde tanımlanan mikroakışkan cihaz, dış fiksatörler14, 21,23 ve makroskopik sıkıştırma cihazları16gibi konvansiyonel sıkıştırma cihazına göre birçok avantaja sahiptir. 19.09.20 , 27.000 , 28 kondrosit mekanobiyolojisi çalışmak için: 1) Mikroakışkan cihaz, makroskopik sıkıştırma cihazından daha az miktarda numune tükettiği için uygun maliyetlidir, 2) Mikroakışkan cihaz zaman etkilidir, çünkü birden fazla test edebilir sıkıştırma koşulları aynı anda, 3) Mikroakışkan cihaz, mikrokanallardaki sınırlı karıştırmaya dayalı kimyasalların konsantrasyon gradyanı oluşturarak mekanik ve kimyasal uyaranları birleştirebilir ve 4) Çeşitli mikroskopi teknikleri (zaman atlamalı mikroskopi ve floresan konfokal mikroskopi) şeffaf PDMS'den yapılmış mikroakışkan cihaz ile uygulanabilir.
Biz kabul ve kondrosit sıkıştırma yüksek iş letme mechanobiology çalışmaları sağlamak için tek bir cihazda farklı kompresif stres düzeyleri oluşturmak için Moraes ve ark.7,29 yöntemini değiştirdi. Yaklaşımımız, üç boyutlu (3D) kültür ortamına ihtiyaç duyan hücreler (örneğin kondrositler) ve hücreleri sıkıştırdıktan sonra biyolojik tahliller için uygundur. Bazı mikroakışkan hücre sıkıştırma cihazları iki boyutlu (2D) yüzeylerde kültürlenmiş hücreleri sıkıştırabilse de30,31,32, 2D kültürlü kondrositler için kullanılamazlar, çünkü 2D kültürlü kondrositler defarklılaştırma. Fotopolimerize hidrojeller7,333D kültürlü hücreleri sıkıştırmak için mikroakışkan platformlar vardır, ancak fotopolimerize hücreleri izole çünkü sıkıştırma deneyleri sonrası hücreleri izole sınırlıdır hydrogel kolay değildir. Ayrıca, ultraviyole (UV) maruz ilerlik ve fotoğraf crosslinking başlatıcılarının hücreler üzerindeki etkilerinin de değerlendirilmesi gerekebilir. Buna karşılık, aljinat hidrojeller kalsiyum şelatörler tarafından hızlı bir şekilde depolimerize edilebilir, çünkü bizim yöntem post biyolojik tahliller için sıkıştırma deneyleri sonra hücrelerin hızlı izolasyon sağlar. Ayrıntılı cihaz üretim ve karakterizasyon yöntemleri bu protokolde açıklanmıştır. Mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazının imalatı için kısa bir prosedür Şekil 2'degösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropil) trietoksisilan (ATPES)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>741442-100ML</td><td></td></tr> <tr><td>(Tridekafloro-1, 1, 2, 2-Tetrahidrooktil) -1-Triklorosilan</td><td>Birleşik Kimya Teknolojileri</td><td>T2492-KG</td><td></td></tr><tr><td>Akrilik levha</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K354</td><td></td></tr><tr><td>Hava pompası</td><td>Schwarzer Precision</td><td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td><td>2015 yılında satın alınan modeli kullandık. Hava pompasının (SP 500 EC-LC) iç tasarımı ve performansı 2016 yılının başlarında değişti. Ayrıca, hava pompası performansı zaman içinde değişti. Bu nedenle, bir SP 500 EC-LC hava pompası tarafından üretilen hava basıncı, kullanımdan önce kalibre edilmelidir.</td></tr><tr><td>Aljinat tozu</td><td>FMC Corporation</td><td>Pronova UP MVG</td><td></td></tr><tr><td>Barb Düz Konnektörler (Metal tüp)</td> <td>Pnömadyne</td><td>EB40-250</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Invitrogen</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Boyalı kırmızı sulu floresan parçacıkları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0100</td><td></td></tr><tr><td>EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Köpük ped</td><td>TAHIL</td><td>Ürün # 5GCE8</td><td></td></tr><tr><td>Fonksiyon / Keyfi Dalga Biçimi Jeneratörü Keysight</td><td>Teknolojileri</td><td>33210A</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2633500</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil alkol</td><td>BDH1174-4LP</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-267-013</td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS)</td> <td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>Keysight Teknolojileri</td><td>E3630A</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Solenoid manifold</td><td>Pnömadin,</td><td>MSV10-1</td><td></td></tr><tr><td>Solenoid valf,</td><td>Pnömadin,</td><td>S10MM-30-12-3</td><td></td></tr>, <tr><td>Spin kaplayıcı</td><td>Laurell Teknolojileri</td>, <td>WS-650Mz-23NPPB</td><td></td></tr>, <tr><td>SU8, Geliştirici</td><td>MicroChem A.Ş.</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>SU8-100</td><td>MicroChem A.Ş.</td><td>Y131273 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8-5</td><td>MicroChem A.Ş.</td><td>Y131252 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Sülfo-NHS (N-hidroksisülfosüksinimid)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>EMD Millipore MSX12445</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dinamik sıkıştırma ile chondrocytes uyarıcı için bir mikroakışkan platform

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mekanik uyaranların hücre ve dokuların biyolojik fonksiyonlarını modüle etmek için bilinmektedir. Son çalışmalar, kompresif stresin büyüme plakası kıkırdak mimarisini değiştirdiğini ve çocukların uzun kemiklerinin büyüme modülasyonuna neden olduğunu ileri sürmüştür. Kemik büyümesinde kompresif stresin rolünü belirlemek için, aljinat hidrojel silindirlerine gömülü büyüme plakası kondrositlerini dinamik (veya statik olarak) sıkıştırmak için pnömatik basınçla aktive edilmiş mikroakışkan bir cihaz oluşturduk. Bu makalede, bu aygıtın üretilmesi ve karakterizasyonu için ayrıntılı yöntemler açıklanmıştır. Protokolümüzün avantajları şunlardır: 1) Beş farklı basınç büyüklüğü tek bir platformda beş teknik kopyada oluşturulabilir, 2) Geleneksel ışık mikroskobu ile hücre morfolojisini görselleştirmek kolaydır, 3) Hücreler hızla izole edilebilir sıkıştırma sonrası cihazdan aşağı tahlilleri kolaylaştırmak için, ve 4) Platform hidrojellerde büyüyebilir herhangi bir hücre tipi nin mekanobiyoloji çalışma için uygulanabilir.

Bu makalede, mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazı imalatının ayrıntılı adımları gösterilmektedir (Şekil 2). Cihaz silindirik aljinat-kondrosit yapıları 5 x 5 diziiçerir ve bu yapılar sıkıştırma beş farklı büyüklükleri ile sıkıştırılabilir(Şekil 1, Şekil 3 ve Şekil 4). Pnömatik mikrokanalın yüksekliği 90 μm civarındadır ve PDMS balon çapları sırasıyla 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 ve 2.0 mm'dir. Cihazın perform...

Bu makalede, kondrosit sıkıştırma için pnömatik olarak mikroakışkan bir cihaz imal etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı yöntemler sağlanmıştır.

Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Bu pnömatik olarak aktive mikroakışkan sıkıştırma cihazı büyüme plaka kondrositlerinin 3Boyutlu hidrojel kültürlerinde mekanobiyoloji yi incelemek için kullanılabilir. Mikroakışkan cihaz maliyet ve zaman açısından etkilidir, çünkü aynı anda küçük hacimlerde numuneler üzerinde sıkıştırmanın birden fazla büyüklüğünü üretebilir ve cihazla birlikte çeşitli mikroskobik görüntülemeler uygulanabilir. Yöntemimiz diğer hücre tiplerinin mekanobiyolojisi çalışmasına da uygulanabilir.Mikrokanal tabakasını kurmak için, ilk olarak 10 prepolimerlik ağırlık oranıyla pdms'yi beş dakika boyunca bir kür leme maddesine karıştırın. Sonraki yerde bir köpük ped üzerinde kalıp ve ana kalıp içine karışımı dökün. PDMS'yi 30 dakika boyunca vakum odasında degas edin ve gazdan arındırılmış PDMS'yi bir parça şeffaflık filmi ile sandviçleyin.Sıkıştırılmış montaj cam plaka, köpük pedleri ve pleksiglas plakalar ile. PDMS'yi 6 saat boyunca 80 santigrat derecede tedavi edin ve PDMS katmanını ve saydamlık filmini sandviç yapıdan izole edin. PDMS'nin yüzeylerini ve plazma temizleyicisi ile temiz cam plakayı bir dakika boyunca etkinleştirin ve PDMS'yi 80 derecelik santigrat fırındaki cam plakaya 30 dakika yapıştırın.Sonra şeffaflık filmini kaldırın. İnce PDMS membranının hazırlanması için, 60 mikrometre kalınlığında bir PDMS tabakası elde etmek için dakikada 1.000 dönüşte bir saydamlık filminde spin kat unred PDMS. Cam plaka üzerindeki mikrokanal PDMS tabakasını ve ince PDMS tabakasını bir dakika lığına etkinleştirmek için plazma temizleyicisini kullanmadan önce 80 derece lik spin kaplı PDMS'yi 20 ila 30 dakika boyunca kısmen iyileştirin.Daha sonra ince PDMS membran tabakasını mikrokanal PDMS katmanına bağlayın ve katmanları bir gecede 80 derecelik santigrat fırına yerleştirin. Boru bloğu hazırlama için, metal tüpleri bir petri kabının üzerine dikey olarak yerleştirin ve tüplerin yaklaşık 3/4'ü batırılıncaya kadar yavaşça kabın içine damlatılmış PDMS dökün. PDMS'yi bir vakum odasında 30 dakika gazdan çıkardıktan sonra, PDMS'yi 60 derecede 6saatten fazla bir süre fırında tedavi edin.Kürleme işleminin sonunda, bir tüp içeren bir PDMS bloğu parçasını kesin ve giriş için ince PDMS katmanında bir delik aç. PLAZMA temizleyici ile PDMS bloğunu ve ince PDMS tabakasını etkinleştirin. Bir dakika sonra, PDMS bloğunu ince PDMS tabakasının giriş deliğine takın ve tüm aktüasyon ünitesini bir gecede 80 derece fırında yerleştirin.Agarose jel kalıp hazırlama için, deiyonize suda% 5 agarose ve 200 milimolar kalsiyum klorür karıştırın ve kaynayana kadar agarose jel çözeltisi ısıtın. Bir alüminyum kalıp içine haşlanmış agarose jel çözeltisi dökün ve cam plaka ile kalıp sandviç. Beş dakika sonra, alüminyum kalıp katılaşmış agarose jel çıkarın.Aminosilanized cam plaka üzerine aljinat-kondrosit çözeltisi Plaka 150 mikrolitre ve üç dakika agarose jel kalıp ile çözelti kapağı. Kuluçka sonunda, aşırı aljinat jel çözeltisi kaldırmak ve plaka dan agarose jel kalıp kaldırmak için bir jilet kullanın. Sonra bir dakika için deiyonize suda 50 milimolar kalsiyum klorür ve 140 milimoler sodyum klorür içeren çapraz bağlama çözeltisi içine aljinat-kondrosit yapıları yerleştirin.Cihazı monte etmek için, aktüasyon ünitesinin ince PDMS tabakasının dört köşesine dört bir milimetre kalınlığında PDMS boşluk bulun. İnce PDMS tabakasının hava odalarını 700 mikrolitre kondrosit kültür ortamı ile kapatın. Stereo mikrosope kullanarak, aljinat-kondrosit yapısını ince PDMS tabakasına yerleştirin, yapıları hava odalarıyla hizaya getirmeye özen takın ve cihazı 3D baskılı kelepçelerle kıskaca alın.Cihazın harekete geçirmek için, bir hava pompasıçıkış bir solenoid vana girişi ile bağlamak için silikon boru bir parça kullanın. Solenoid valfin çıkışını monte edilmiş cihazın girişine bağlamak için ek bir boru parçası kullanın. Solenoid valfi bir fonksiyon jeneratörü ile bağlayın ve solenoid valf işlemek için fonksiyon jeneratörü tarafından oluşturulan bir hertz kare dalga kullanın.Daha sonra cihazı pnömatik olarak harekete geçirmek için hava pompasını açın. Mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazı silindirik aljinat-kondrosit yapılar beş beş dizi içerir ve bu yapılar sıkıştırma beş farklı büyüklükleri ile sıkıştırılabilir. Bu örnekte, jel sütunu en büyük PDMS balonu tarafından %33,8 oranında yüksekliğinde sıkıştırılmış ve jel yapılarının kompresif gerilimi 0,2 milimetrelik artış başına yaklaşık %5 ve PDMS balon çapı artmıştır.Kondrositlerin kompresif deformasyonu, jel yapı merkezinin yakınındaki 613'e 613'te 40-55 mikrometre hacmindeki hücrelerin görüntülenmesiyle belirlendi. Burada en büyük PDMS balonu tarafından %16 sıkıştırılmış bir kondrosit görüntüsü gösterilmiştir. Bu grafikte ölçülen hücre sıkıştırma gerilim değerlerinin dağılımı gözlemlenebilir.Bu analizde, hücreler daha büyük PDMS balonları tarafından genel olarak sıkıştırıldı. Birlikte ele alındığında, bu veriler aljinat jel ve kondrosit sıkıştırma miktarları 14 kilopascals sabit bir basınç altında PDMS balon çapı tarafından kontrol edilir öneririz. Cihaz performansının tekrarlanabilirliğini sağlamak için, sabit kalınlık ve elastikiyete sahip ince bir PDMS membran oluşturmak çok önemlidir.Bu prosedürü takiben, immünoresans ve in situ hibridizasyon gibi çeşitli biyolojik tahliller yapılabilir. Bu teknik kullanılarak, büyüme plaka veya eklem kondrositlerinde mekanotransdüksiyon ile ilgili birçok soru cevaplanabilir.

a-microfluidic-platform-for-stimulating-chondrocytes-with-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokolde, teknolojinin dayandığı dikey yerinden mesajların microactuator dizi imalat, ve nasıl bu temel teknoloji, yüksek verimli mekanik dinamik hücre kültürü, hem de iki boyutlu ve üç boyutlu kültür yapmak için değiştirilebilir göstermektedir paradigmalar.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Sinovyal sıvıda yüksek düzeyde insan eklem kondrosit kültür 3D sistemi açıklanmıştır. Sinovyal sıvı eklem kıkırdağı için en doğal mikroçevresinin yansıtır ve kolayca elde ve saklanabilir. Bu sistem, böylece kıkırdak rejenerasyon eğitim ve artrit tedavisi için tarama terapötikler için kullanılabilir.

Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi

Kondrositler tarafından kıkırdak ekstraselüler matriks biyosentezi mekanik uyaranlara uygulama etkilenebilir. Bu yöntem, 3D yapıları ve kondrosit metabolizması bağlı değişikliklerin değerlendirilmesi kapsüllü kondrositler dinamik basınç suşların uygulama tekniği anlatılmaktadır.

Kondrosit-agaroz Hidrojeller mekanik stimülasyonu

Biz eklem kıkırdağı kusur içine önce nakli için bir kıkırdak biokompozit için tek eksenli veya çift eksenli mekanik zorlanma uygulayabilirsiniz yeni bir mekanik yüklenme biyoreaktör tasarlanmıştır.

Doku Mühendisliği için iki eksenli Mekanik Yükleniyor Biyoreaktör tasarımı

Kıkırdak onarımı, karşılanmamış bir tıbbi zorluğu temsil eder ve insan eklem kıkırdağını tasarlamak için hücre temelli yaklaşımlar umut verici bir çözümdür. Burada, insan eklem kondrositlerinin genişlemesi ve olgunlaşması için ideal bir araç olarak üç boyutlu (3D) biyomimetik hidrojelleri tanımlıyoruz.

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Biz hücre ölümü yaralanma/olduğu gibi fare eklemlerin eklem yüzeyinde kayma ölçüde kontrollü mekanik yükler veya etkileri uygulamadan sonra değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, osteoartrit, genetik faktörler ve/veya farklı yükleme rejimleri içinde situ kondrosit güvenlik açığı nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir.

Gerçek zamanlı görselleştirme ve analiz nedeniyle tam olarak olduğu gibi fare kıkırdak Explants mekanik yükleme kondrosit yaralanma

Burada, bir laboratuvar-on-a-chip platformu içinde kemik remodeling analiz için protokoller sıyoruz. Bir 3D baskılı mekanik yükleme cihazı hücresel matris deforme ederek osteosit mekanostransdüksiyon neden platform ile eşleştirilmiş olabilir. Platform aynı zamanda osteoklastlar ve osteoblastlar (rezorpsiyon / oluşumu) kemik remodeling fonksiyonel sonuçları ölçmek için kullanılabilir.

Osteosit Mekanotransdüksiyonu Uyaran ve Kemik Remodeling Fonksiyonel Sonuçları Analiz için Bir Lab-On-A-Chip Platformu

İnsan diz eklemindeki kıkırdak, kemik, yağ yastığı ve sinovyumu özetlemek için kullanılan insan mezenkimal kök hücrelerinden dört tip doku üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Bu dört doku özelleştirilmiş bir biyoreaktöre entegre edilir ve mikroakışkanlar yoluyla bağlanır, böylece çip üzerinde bir diz eklemi oluşturur.

Eklem hastalıklarını modellemek ve ilaçları test etmek için çip üzerinde diz eklemi oluşturulması

Bu çalışma, hücreleri yerçekimi kullanarak düşük yapışma koşulları altında sferoidler halinde toplayarak ve ardından elde edilen sferoidleri mini biyoreaktörlerde kültürleyerek kondrositik sferoidlerin üretilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Yerçekimi ve Ev Yapımı Mini Biyoreaktörler Altında Düşük Yapışkan Koşullar Kullanılarak Çeşitli Kondrositlerden Sferoidlerin Üretilmesi

Öğrenin, kondrositlerde mekanobiyolojiyi incelemek için pnömatik mikroakışkan sıkıştırma cihazının nasıl üretildiğini. Bu yöntem, 3D hidrojel kültürlerde çoklu sıkıştırma uygulayarak hücre davranışlarını analiz etmeyi sağlar.

Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform

Daha fazla video keşfet