Name: Gelişmiş Crosslinking Immünoprecipitation (eCLIP) fare testis protein bağlı RNA verimli tanımlaması için yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Öğrenin fare testisinde RNA bağlayıcı proteinlerin hedeflerini belirlemek için geliştirilmiş eCLIP yöntemini. Bu radyoaktif olmayan protokol, spermatogenez sırasında transkripsiyon sonrası düzenlemeyi anlamak için yüksek sinyal-gürültü oranı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz orijinal protokol ile yararlı rehberlik için Eric L Van Nostrand ve gene W Yeo teşekkür ederiz. K.Z. Ulusal anahtar R & D programı Çin (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) ve Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin (31771653) tarafından desteklenmektedir. Ly Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin (81471502, 31871503) ve yenilikçi ve girişimcilik programı Jiangsu Eyaleti tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pachytene+asynapsis+drives+meiotic+sex+chromosome+inactivation+and+leads+to+substantial+postmeiotic+repression+in+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids.</a> Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).</li>
<li>Turner, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+sex+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li>
<li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li>
<li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li>
<li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP%3A+a+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37 (4), 376-386 (2005).</li>
<li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+right+RNA%3A+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Acadamy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).</li>
<li>Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).</li>
<li>Zheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+MOV10L1+associates+with+Piwi+proteins+and+is+an+essential+component+of+the+Piwi-interacting+RNA+%28piRNA%29+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Acadamy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).</li>
<li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+Is+a+5%27+to+3%27+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3%27+UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).</li>
<li>Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coordinated+local+translational+control+point+at+the+synapse+involving+relief+from+silencing+and+MOV10+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation.</a> Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).</li>
<li>Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+RNASEH2+and+MOV10+controls+LINE-1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition.</a> Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).</li>
<li>Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+RNA+helicase+is+a+potent+inhibitor+of+retrotransposition+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1002941(2012).</li>
<li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capped+small+RNAs+and+MOV10+in+human+hepatitis+delta+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).</li>
<li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).</li>
<li>Messaoudi-Aubert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+MOV10+RNA+helicase+in+Polycomb-mediated+repression+of+the+INK4a+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).</li>
<li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160(2012).</li>
<li>Skariah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mov10+suppresses+retroelements+and+regulates+neuronal+development+and+function+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain.</a> BMC Biology. 15 (1), 54(2017).</li>
<li>Zheng, K., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+pachytene+piRNA+biogenesis+reveals+a+novel+requirement+for+maintaining+post-meiotic+germline+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity.</a> PLoS Genetics. 8 (11), e1003038(2012).</li>
<li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li>
<li>Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitored+eCLIP%3A+high+accuracy+mapping+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).</li>
<li>Huppertz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP%3A+protein-RNA+interactions+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution.</a> Methods. 65 (3), 274-287 (2014).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li>
<li>Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((uvCLAP+is+a+fast+and+non-radioactive+method+to+identify+in+vivo+targets+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 1142(2018).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre%2Flox+based+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnology. 11, 24(2011).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Customizable+Protocol+for+String+Assembly+gRNA+Cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR).</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+genome+browser+and+associated+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The UCSC genome browser and associated tools.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).</li>
<li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mili+and+Miwi+target+RNA+repertoire+reveals+piRNA+biogenesis+and+function+of+Miwi+in+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).</li>
<li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+is+an+RNA-binding+protein%2C+and+its+interactome+provides+a+link+to+neural+development+and+microtubule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly.</a> Cell. 158 (2), 368-382 (2014).</li>
<li>Meyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TIA1+RNA-Binding+Protein+Family+Regulates+EIF2AK2-Mediated+Stress+Response+and+Cell+Cycle+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression.</a> Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Vourekas, A., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+%28CLIP-Seq%29+for+mouse+Piwi+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Hem biyolojik hem de patolojik bağlamlar altında rbps evrensel rolünü anlamak artan, klip yöntemleri yaygın rbps moleküler fonksiyonunu ortaya çıkarmak için kullanılmıştır20,32,33, 34,35. Burada açıklanan protokol, fare testis için eCLIP yönteminin uyarlanmış bir uygulamasını temsil eder.
Testis içinde Eclip gerçekleştirme bir meyd...

Mammalian testis bir karmaşık hücre farklılaşma programı cyclically çok sayıda spermatozoa verim çalışır burada mükemmel bir gelişimsel model temsil eder. Bu modelin benzersiz bir değeri, genellikle Mayoz bölünmenin seks kromozom inaktivasyonu (MSCI)1,2 ve yuvarlak spermatids geçmesi zaman oluşur spermatogenesis belirli aşamalarında transkripsiyonel inaktivasyonu ortaya çıkması yatıyor spermiogenesis sırasında şiddetli nükleer sıkıştırma3. Bu ardışık transkripsiyonel olaylar, RNA bağlayıcı proteinlerin (rbps) transscriptome şekillendirme ve Erkek fertilitesini sürdürmek için önemli bir rol oynadığı transkripsiyon sonrası gen düzenlemesini gerektirmektedir.
Tek bir RBP in vivo ın bona fide RNA hedeflerini belirlemek için, çapraz immünoprecipitation (klip) yöntemi4,5, dayalı ancak normal RNA immünoprecipitation (RIP), istinaden geliştirilmiştir5/6 , ultraviyole (UV) Crosslinking, sıkı yıkama ve jel transferi dahil olmak üzere önemli adımlar eklenmesi ile sinyal özgüllüğü geliştirmek için. KLIBIN yüksek verimlilik sıralaması ile birlikte gelişmiş uygulaması, genom çapında8düzeylerinde PROTEIN-RNA etkileşiminin profiline büyük ilgi yarattı. RBP fonksiyonunda genetik çalışmalarda ek olarak, endojen proteinin ve RNA 'nın doğrudan etkileşimlerini belirleyen bu tür biyokimyasal Yöntemler, RBPs 'in RNA düzenleyici rollerini doğru bir şekilde elükte etmek için vazgeçilmez olmuştur. Örneğin, MOV10L1 erkek fertilite ve Piwi etkileşim RNA (piRNA) biyogenesis9için gerekli olan bir TESTIS özgü RNA helikaz olduğunu. Onun Parme MOV10 RNA biyoloji10,11,12,13,14 birden fazla açıdan roller ile bir her yerde ifade ve çok fonksiyonlu RNA helikazı olarak bilinir , 15 , 16 , 17 , 18. geleneksel klip-Seq istihdam ederek, biz MOV10L1 bağlar ve erken Pirna işleme19,20başlatmak için birincil Pirna öncüleri düzenler ve MOV10 mRNA 3 ' utrs ve yanı sıra kodlamayan RNA bağlar bulundu Testis germ hücrelerinde türler (veri gösterilmez).
Yine de, CLıP orijinal bir zahmetli, radyoaktif prosedür KLIPS etiketleri dikkat çekici bir kaybı ile dizi kitaplık hazırlama izledi. Geleneksel KLIPS 'de, her iki RNA ekstremitesinde birleştirilmiş adaptörler kullanılarak cDNA Kütüphanesi hazırlanır. Protein sindirimi sonrasında, çapraz bağlantılı kısa polipeptit RNA parçalarına bağlı kalır. Bu çapraz işareti kısmen blok ters transkriptaz (rtase) ilerlemesi cDNA sentezi sırasında, yaklaşık 80% cDNA Kütüphanesi21,22temsil eden kesilmiş cdnas sonuçlanan. Bu nedenle, yalnızca cDNA parçaları (okuma-through) çapraz bağlantı sitesi atlayarak RTase kaynaklanan sıralanmış. Son zamanlarda, PAR-CLıP, ıclip, eCLIP ve uvCLAP gibi çeşitli CLıP yaklaşımlar, yaşam hücrelerinde RBPs Crosslink sitelerini tanımlamak için istihdam edilmiştir. PAR-CLıP 365 Nm UV radyasyon ve photoactivatable nüklitid analogları uygulama içerir ve bu nedenle içinde-kültür yaşam hücrelerine özeldir, ve yeni sentezlenmiş transkriptler içine nükliside analogların birleşmesi önyargı üreten eğilimli RNA fiziksel olarak protein23,24ile etkileşime girer. Iclip 'de, sadece tek bir adaptör, çapraz bağlı RNA parçalarının 3 ' ekstremite için bağlanır. Ters transkripsiyon (RT) sonrasında, hem kesilmiş hem de okunan cdnas, intramolecularly döngülü ve yeniden doğruylama ile polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu tarafından elde edilir25,26. Ancak, intramoleküler devre verimliliği nispeten düşüktür. Eski CLIP protokolleri bir radyoizotop ile çapraz bağlı RNA etiketleme gerekir rağmen, ultraviyole çapraz ve yakınlık arıtma (uvclap), sıkı tandem benzeşme arıtma bir süreç ile, radyoaktivite27güvenmez. Yine de, uvclap tandem benzeşimi arıtma için 3x Flag-HBH etiketini taşıyan ifade vektörü ile transfekte olmalıdır kültürlü hücreler ile sınırlıdır.
ECLIP 'de, adaptörler ilk olarak RNA 'nın 3 ' ekstremite altında RT 'nin ardından, sonra da cDNAs 'ın 3 ' ekstremite içinde moleküllü bir modda bağlanıldı. Bu nedenle, eCLIP tüm kesilmiş ve okunan cDNA28ile yakalamak mümkün. Ayrıca, ne radyoaktif etiketleme sınırlıdır, ne de kendi ilkesine göre hücre hatları kullanarak, tek nüklemotid çözünürlüğü korurken.
Burada, fare testis için uyarlanmış bir eCLIP protokolünün adım adım açıklamasını sağlıyoruz. Kısaca, bu Eclip protokolü, testis tübüllerin UV çapraz ile başlar, kısmi RNase sindirim ve immünoprecipitation bir protein özgü antikor kullanarak izledi. Sonra, protein bağlı RNA dephosphorylated, ve adaptör 3 ' sonuna bağlanır. Protein jeli Elektroforez ve jel-membran transferinden sonra RNA, beklenen bir boyut aralığının membran alanını keserek izole edilir. RT sonra, DNA adaptörü PCR amplifikasyon tarafından izlenen cDNA 3 ' sonuna bağlandı. Yüksek verimlilik sıralamasının öncesinde subklonlar taraması Kütüphane kalite kontrolü olarak alınır. Bu protokol, iki testis ifade RNA helikazlar MOV10L1 ve MOV10 tarafından örneklenmiş rbps protein bağlı RNA büyük türlerin belirlenmesi, etkilidir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-fare MOV10 ve nbsp antikoru</td><td>Proteintech, Çin</td><td>10370-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare MOV10L1 antikoru</td><td>Zheng ve ark.20109</td><td>poliklonal antiserum UP2175</td><td>, P. Jeremy Wang laboratuvarı, Pennsylvania Üniversitesi</td></tr><tr><td>HRP Keçi Anti-Tavşan IgG ve nbsp;</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan IgG</td><td>Beyotime, Çin</td><td>A7016</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüjü</td><td>Eppendorf, Hamburg, Almanya</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>Dijital sonifier</td><td>BRANSON, ABD</td><td>BBV12081048A</td><td>450 Watt; 50/60 Hz</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Mıknatıs Canlandırıcı</td><td>, ABD</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini Blot Modülü</td><td>Invitrogen,ABD</td><td>B1000</td><td></td></tr><tr><td>Mini Jel Tankı</td><td>Invitrogen,ABD</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama inkübatörü</td><td>Eppendorf, Hamburg, Almanya</td><td>Thermomixer konforu&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Doku Öğütücü, Dounce</td><td>PYREX, ABD</td><td>yalnızca 1234F35</td><td>&nbsp; bu protokolde "gevşek" havaneli kullanılır</td></tr><tr><td>Profesyonel standart 96 Gradient</td><td>Biometra, Almanya</td><td>seri no.: 2604323</td><td></td></tr><tr><td>Tüp Revolver&nbsp;</td><td>Kristal, ABD</td><td>seri numarası: 3406051</td><td></td></tr><tr><td>UV ışıklı çapraz bağlayıcı</td><td>UVP, ABD</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC ile işlenmiş Kültür Kabı</td><td>Corning, ABD</td><td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Tüpler</td><td>Corning, ABD</td><td>430791</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Mikrotüpler tüpler</td><td>AXYGEN, ABD</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><güçlü>Reaktifler&nbsp; < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Asit fenol / kloroform / izoamil alkol & nbsp;</td><td>Solarbio, Çin</td><td>P1011</td><td>25:24:01</td></tr><tr><td>AffinityScript Enzyme</td><td>Agilent, ABD</td><td>600107</td><td></td></tr><tr><td>Antioksidan</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>DH5 ve alfa; yetkili bakteriler</td><td>Thermo Scientific, ABD</td><td>Bu</td><td>ekonomik hücrelerin >1 x 106 transformatörleri verdiğini 18265017 mikro; 50 & başına g kontrol DNA'sı; L reaksiyonu.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA Merdiven</td><td>İnvitrojeni, ABD</td><td>10416014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A&nbsp;</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>ECL reaktifi</td><td>Vazyme, Çin</td><td>E411-04</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche, ABD</td><td>04693132001</td><td>taze</td></tr><tr><td>Exo-SAP-IT</td><td>Affymetrix, ABD</td><td>78201</td><td>PCR Ürün Temizleme Reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP enzimi</td><td>Thermo Scientific, ABD</td><td>EF0652</td><td></td></tr><tr><td>LDS Örnek Tamponu</td><td>Thermo Scientific, ABD</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose&nbsp;</td><td>lonza, İsviçre</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>MiniElute jel Ekstraksiyonu</td><td>QIAGEN, Almanya</td><td>28604</td><td>sütunda 4 ?; tampon QG = jel çözme tamponu; tampon PE = yıkama tamponu (adım 14 için)</td></tr> <tr><td>MyONE Silan boncuklar</td><td>Thermo Scientific, ABD</td><td>37002D</td><td>nükleik asitler ekstraksiyon manyetik boncukları</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, ABD</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Protein Jelleri</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>NP0336BOX</td><td>%4 & %12, 1,5 mm, 15 kuyulu</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Tampon Kiti</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>NP0050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, ABD</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Faz Kilitli Jel (PLG) ağır tüp&nbsp; &nbsp;</td><td>TIANGEN, Çin</td><td>WM5-2302831</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix Uygulamalı</td><td>Biyosistemler, ABD</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>NEB, New England&nbsp;</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 PCR ana karışımı&nbsp;</td><td>NEB, New England&nbsp;</td><td>M0492L</td><td></td></tr><tr><td>RLT tamponu</td><td>QIAGEN, Almanya</td><td>79216</td><td>RNA saflaştırma lizis tamponu&nbsp;</td></tr><tr><td>RNA Temiz & Yoğunlaştırıcı-5 sütun&nbsp;</td><td>ZYMO RESEARCH, ABD</td><td>R1016</td><td>RNA saflaştırma ve konsantrasyon kolonları</td></tr><tr><td>RNaz I&nbsp;</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>RNase İnhibitörü</td><td>Promega, ABD</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNase</td><td>Promega, ABD</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Numune Azaltıcı Ajan</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>SDS Çözeltisi</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>15553027</td><td>% 10</td></tr> <tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>30970</td><td>koruyun hafif</td></tr><tr><td>T4 PNK enzimi</td><td>NEB, New England & nbsp;</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligaz 1 yüksek konc</td><td>NEB, New England&nbsp;</td><td>M0437M</td><td></td></tr><tr><td>TA / Kör-Sıfır Klonlama</td><td>Karışımı Vazyme, Çin</td><td>C601-01</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI Tampon</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech, Çin</td><td>A600198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, Çin</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>X-ray Filmleri</td><td>Caresteam, Kanada</td><td>6535876</td><td></td></tr></tbody></table>

gelişmiş crosslinking immünoprecipitation (eclip) fare testis protein bağlı rna verimli tanımlaması için yöntem

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

Spermatogenesis, memelilerde erkek germ hücresi farklılaşma yüksek sipariş edilen bir süreç tanımlar. Testis, transkripsiyon ve çeviri unoupled, RBPs tarafından düzenlenmiş Gen ifadesinin Post-transcriptional düzenleme önemini vurgulayarak. Bir RBP 'nin mekanik rollerini yenilemek için, endojen doğrudan RNA hedeflerini yakalamak ve gerçek etkileşim sitelerini tanımlamak için çapraz bağlama immünopresipitasyon (CLIP) metodolojisi kullanılabilir. Gelişmiş CLıP (eCLIP), geleneksel klipler üzerinde çeşitli avantajlar sunan yeni geliştirilen bir yöntemdir. Ancak, eCLIP kullanımı şimdiye kadar genişletilmiş uygulamalar için arama, hücre hatları ile sınırlı olmuştur. Burada, biz MOV10 ve MOV10L1, iki RNA-bağlayıcı helicases, fare testis okumak için eCLIP istihdam. Beklendiği gibi, biz MOV10 ağırlıklı olarak mRNA 3 ' tercüme edilmemiş bölgelere (UTRs) bağlar ve MOV10L1 seçmeli olarak Piwi-etkileşim RNA (piRNA) öncüsü transkriptler bağlar bulabilirsiniz. ECLIP yöntemimiz, alt klonların küçük ölçekli sıralaması ve böylece nitelikli kütüphanelerin kullanılabilirliği ile çeşitli RBPs 'lerin bağlı olduğu büyük RNA türlerinin hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar ve bu da derin sıralamaya devam etmek için bir emir olarak kullanılabilir. Bu çalışma, memeliyen testis içinde eCLIP için geçerli bir temel kurar.

Eclip prosedürü ve sonuçları Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4' te gösterilmiştir. Fareler karbondioksit ile ötenize edildi ve cerrahi makas kullanılarak alt karın içinde küçük bir kesi yapılmıştır (Şekil 2a,B). Fare testle...

Burada, testis 'teki RBP adaylarının büyük RNA hedeflerini belirlemek için bir eCLIP Protokolü sunuyoruz.

Gelişmiş Crosslinking Immünoprecipitation (eCLIP) fare testis protein bağlı RNA verimli tanımlaması için yöntem

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

RNA bağlayıcı proteinler hücresel fizyoloji için gereklidir. Daha da önemlisi, RBP yüksek spermatogenez boyunca ifade edilir ve iyi mikrop hücrelerinin tüm aşamalarında gerekli post-transkripsiyonel düzenleyiciler olarak belgelenmiştir. Bağlayıcı hedeflerin belirlenmesi RBP'nin mekanik rollerini açıklamak için çok önemlidir.Bu protokol, endojen direkt RNA hedeflerini yakalamak için eCLIP yönteminin uyarlanmış bir uygulamasını temsil eder ve memeli testlerinde eCLIP için geçerli bir temel oluşturur. Bu yöntemin en büyük avantajı, radyoaktif olmayan, daha az zaman yoğun olması ve boyut uyumlu giriş otantik hedefler için uygun bir arka plan olarak hizmet edeceği için daha güçlü bir sinyal-gürültü oranı sağlamasıdır. Son olarak, alt klonların küçük ölçekli sıralama derin sıralama aşağıdaki yararlı olduğunu düşünüyorum.Prosedürü gösteren Xu Qiushi, meslektaşım olacak. Bu prosedüre başlamak için, her immünoprepitasyon deneyi için uygun yaştaki farelerden yaklaşık 100 miligram testis hasat edin. Dokuları buz gibi PBS'ye yerleştirin.İnce uçlu cımbız bir çift kullanarak, yavaşça tunaica albuginea kaldırın. Bir doku öğütücüse üç mililitre buz gibi PBS ekleyin ve hafif mekanik kuvvetle doku triturate gevşek bir cam havaneli kullanın. Daha sonra, bir hücre kültür çanak doku süspansiyon aktarın ve altı mililitre kadar buz gibi PBS ekleyin.Sıvı eşit yemeğin alt kapakları böylece hızlı bir şekilde plaka sallayın. 254 nanometre kare santimetre kare 400 milijoule ile buz üzerinde süspansiyon üç kez Crosslink. Süspansiyonu her ışınlama arasında karıştırdığından emin olun.Daha sonra, 15 mililitrelik konik bir tüp içinde süspansiyon toplamak ve santrifüj 1, 200 kez g ve beş dakika boyunca dört derece. Supernatant çıkarın ve PBS bir mililitre pelet resuspend. Bundan sonra, 1.5 mililitrelik santrifüj tüp süspansiyon aktarın.Santrifüj 1, 000 kez g ve iki dakika boyunca dört derece santigrat, ve supernatant atın. İlk olarak, taze bir santrifüj tüpüne numune başına 125 mikrolitre protein ekleyin. Çözelti boncukayırmak için mıknatıs üzerine tüp yerleştirin.10 saniye sonra, supernatant çıkarın ve buz gibi lysis tampon bir mililitre ile iki kez boncuk yıkayın. 10 mikrogram eCLIP antikor ile 100 mikrolitre soğuk lysis tamponu boncukları yeniden askıya alın. Tüpleri oda sıcaklığında 45 dakika döndürün.Daha sonra boncukları bir mililitre buz gibi lysis tamponuyla iki kez yıkayın. Başlamak için, 50x EDTA içermeyen protein inhibitörü kokteyl22 mikrolitre ve RNase inhibitörü 11 mikrolitre içeren soğuk lysis tampon bir mililitre doku pelet resuspend. Örnekleri 15 dakika buzüzerinde inceleyin.Metin protokolünde belirtildiği gibi her örneği sonicate. Sonra, her tüp e dört mikrolitre DNase ekleyin ve iyice karıştırın. 1, 200 rpm sallayarak 10 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka.Bundan sonra, seyreltilmiş RNase 10 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın. 1, 200 rpm sallayarak beş dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Sonra, 15, 000 kez g ve lysate temizlemek için 20 dakika boyunca dört derece santigrat santrifüj.Supernatant'ı dikkatlice toplayın ve giriş örneklerini RWB ve RRI örnekleri için kaydedin. İlk olarak, hazırlanan boncuklara bir mililitre lysat ekleyin ve numuneleri iki saat veya gece boyunca dört derece olarak döndürün. Bundan sonra, manyetik bir stand ile boncuk toplamak ve supernatant atın.900 mikrolitre yüksek tuz tamponu yla boncukları iki kez yıkayın ve 900 mikrolitre yıkama tamponuyla boncukları iki kez yıkayın. Daha sonra boncukları 500 mikrolitre 1x defosforilasyon tamponu ile bir kez yıkayın. İlk olarak, supernatant atın ve herhangi bir kalıntı sıvı kaldırmak için ince pipet ipuçları kullanın.Her numuneye 25 mikrolitre üç asal ligasyon ana karışımı ekleyin ve karıştırmak için dikkatlice pipet. Her numuneye 2,5 mikrolitre RNA adaptörü X1A ve 2,5 mikrolitre RNA adaptörü X1B ekleyin. Pipetleme veya hareket ettirerek dikkatlice karıştırın.75 dakika boyunca 25 santigrat derecede kuluçkaya yatarak tüpün her 10 dakikada bir karıştırıldığından emin olun. Boncukları 500 mikrolitre soğuk yıkama tamponuyla bir kez yıkayın. Daha sonra, boncukları 500 mikrolitre soğuk yüksek tuz tamponu ve ardından 500 mikrolitre soğuk yıkama tamponu ile yıkayın.Bu yıkıntıların her ikisini de bir kez daha tekrarlayın. Boncukları manyetik olarak ayırın ve artık sıvıyı çıkarmak için ince pipet uçları kullanın. Soğuk yıkama tampon 100 mikrolitre boncuk resuspend ve RWB örnekleri olarak yeni tüpler için 20 mikrolitre taşıyın.Kalan numunelere 7,5 mikrolitre 4x LDS numune tamponu ve üç mikrolitre 10x numune azaltma maddesi ekleyin. 1, 200 rpm sallayarak 10 dakika boyunca 70 santigrat derecede kuluçka. Bundan sonra, bir dakika buz üzerinde örnekleri serin ve 1.000 kez g ve bir dakika için dört derece santigrat de santrifüj.RWB jel için, bir mıknatıs üzerine tüpler yerleştirin ve ayrı protein boncuklar eluate. Her kuyuya 15 mikrolitre numune yükleyin. Daha sonra, 500 mililitre 1x SDS çalışan tampon antioksidan 500 mikrolitre ekleyin.Jel i çalıştırın 200 volt, 1x SDS 50 dakika veya boya ön alt kadar tampon çalışan. Protein-RNA komplekslerini jelden nitroselüloz membrana 10 volt'ta 70 dakika boyunca 1x transfer tamponuna %10 metanol ile aktarın. Bir saat oda sıcaklığında TBST% 5 süt RWB membran blok.TBST membran durular ve dört santigrat derece tbst bir gecede birincil antikor ile inkübat. Bundan sonra, TBST ile iki kez yıkayın, her yıkama beş dakika süren. Bir saat oda sıcaklığında TBST ikincil antikor ile kuluçka.Daha sonra, TBST ile membran ı üç kez yıkayın. Daha sonra, eşit hacimlerde ECL tampon A ve tampon B.Bu karışımı membrana ekleyin ve bir dakika kuluçkaya yatırın. Membranı plastik sargı ile kapatın ve filmi geliştirmeden önce oda sıcaklığında 2-3 dakika x-ray filmine maruz bırakın.Bu çalışmada, RNase I ile erişkin yabani tip farelerin testislerinde MOV10 eCLIP çapraz bağlı lysate tedavi, hedef protein, yaklaşık 114 kilodaltons, başarıyla zenginleştirilmiştir. Çeşitli örneklerden 1-10 arasında seyreltilmiş cDNA'nın qPCR sonuçları çapraz bağlanmamış örneklerde azalmış RNA geri kazanımı olduğunu ortaya koymaktadır. Çapraz bağlı olmayan grubun Ct değerlerinin genellikle UV-crosslinked grubundan beş kat daha fazla olduğu gözlenmiştir.Agarose jel elektroforez ile PCR amplifikasyon ve boyut seçimi için temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. Astar-dimer ürün yaklaşık 140 baz çifti görünür. UCSC Genom Tarayıcısı'nın iki temsili subklon dizisi görünümü, MOV10'a bağlı eCLIP etiketlerinin Fto geninin üç asal UTR'si içinde bulunduğunu göstermektedir.Üç asal UTR hedeflerinin yaklaşık oranı %75'tir hek293 hücrelerindeki ve testislerde bulunan MOV10 hedeflerinin çoğuyla tutarlıdır. Buna karşılık, MOV10L1 bağlı eCLIP etiketleri bir piRNA kümesi içinde bulunan bulunur, MOV10L1 hedefleri piRNA öncüleri gösteren. PiRNA öncül hedeflerinin yaklaşık oranı önceki çalışmalardan gelen bir eğilimi yansıtan %42'yi oluşturmaktadır.MOV10L1 mililitre başına 40 birimlik RNase I sindirim ile eCLIP az 20 baz çiftleri ile nispeten daha fazla dizileri verir. Burada açıklanan bu protokol, RNA-RBP etkileşim bilgisinin yetersiz olduğu bir alan olan çoğaltmada eCLIP yönteminin istihdamını temsil eder.

enhanced-crosslinking-immunoprecipitation-eclip-method-for-efficient

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Transkript RNA bağlayıcı proteinlerin mekansal düzenleme, post-transkripsiyonel regülasyonunda önemli bir belirleyicisidir. Bu nedenle, bir RNA bağlayıcı protein bağlama bölgeleri hassas genom haritalama sağlar bireysel nükleotid çözünürlük UV crosslinking ve immunoprecipitation (iCLIP) geliştirdi.

iCLIP - Bireysel Nükleotid Çözünürlük protein-RNA Etkileşimleri Transcriptome geniş Haritalama

RIP-Chip aracılığıyla RNA ilişkili kompleksleri izole ve tanımlamak için adım protokolü bir adım.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

Bu video, fare testisindeki RNA bağlayıcı proteinleri tanımlamak için geliştirilmiş çapraz bağlama immünopresipitasyon (eCLIP) yöntemini göstermektedir. eCLIP, RNA bağlayıcı proteinlerin (RBP'ler) hedef RNA'ları ile etkileşime girdiği bağlanma bölgelerinin hassas bir şekilde tanımlanmasını sağlar.

Fare Testislerinde Proteine Bağlı RNA'nın Verimli Tanımlanması için Gelişmiş Bir Çapraz Bağlama İmmünopresipitasyon Yöntemi

Bu el yazması, ökaryotik hücrelerde oluşan seçilmiş akraba RNP'leri spesifik bir oligonükleotid yönelimli zenginleştirme yoluyla izole etmek için bir yaklaşımı açıklar. Bu yaklaşımın uygulanabilirliğini, DHX9/RNA helikaz A'dan oluşan retroviral 5' çevrilmemiş bölgeye bağlı bir akraba RNP'yi izole ederek gösteriyoruz.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Endogenously kurulan mRNA-protein kompleksleri kurtarılması için bir tandem RNA izolasyon yordam (seyahat) açıklanmıştır. Özellikle, çapraz vivo içindeRNA-protein kompleksleri vardır, poliadenile RNA'ların özleri ile oligo(dT) boncuk etkilenmezsiniz ve belirli mRNA'ların değiştirilmiş RNA antianlamlı oligonucleotides ile yakalanır. MRNA'ların için bağlı proteinler immunoblot analizi ile tespit edilir.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

Burada, endojen RNA bağlayıcı siteleri veya RNA: protein (RNP) kompleksler "ayak izleri" mammalin hücrelerden zenginleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım RNP alt paketleri iki immünoprecipitations içerir ve bu nedenle tandem RNA immünopresipitasyon dubbed (ripit).

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

Burada, memeli hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinlerin (RRB) RNA hedeflerini belirlemek için FLAG-biotin tandem saflaştırma ile FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq protokolü salıyoruz.

Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme

Burada RiboTag sistemini kullanarak erişkin erkek fare mikrop hücrelerinin belirli popülasyonlarından ribozomların ve ilişkili RNA'nın immünopresipitesini tanımladık. Stratejik üreme ve dikkatli immünopresipitasyon, germ hücre translatomu hakkında bilgi veren ve mutant fenotiplerin mekanizmaları hakkında bilgi veren temiz, tekrarlanabilir sonuçlar la sonuçlanır.

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Burada, insan hücrelerinden toplam protein ekstraktını, biyotinile RNA ile kaplanmış streptavidin boncuklarını ve kütle spektrometri analizini kullanarak, spesifik RNA dizilerinin protein interaktörlerini ortaya çıkarmak, ölçmek ve doğrulamak için optimize edilmiş bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Doğrudan LNCRNA-protein etkileşimlerini tanımlamak için UV tabanlı bir ChIRP yöntemi.

Kültürlenmiş Hücrelerden Fare Testisine Doğrudan Etkileşime Giren Proteinlerin Doğrulanabilir Tanımlanması İçin UV Tabanlı ChIRP Yöntemi

Öğrenin fare testisinde RNA bağlayıcı proteinlerin hedeflerini belirlemek için geliştirilmiş eCLIP yöntemini. Bu radyoaktif olmayan protokol, spermatogenez sırasında transkripsiyon sonrası düzenlemeyi anlamak için yüksek sinyal-gürültü oranı sağlar.

Gelişmiş Crosslinking Immünoprecipitation (eCLIP) fare testis protein bağlı RNA verimli tanımlaması için yöntem

Daha fazla video keşfet