Name: Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Keşfedin, insan nöral organoidleri oluşturma ve glioblastoma ile Parkinson hastalığını modelleme yöntemlerini. Pluripotent kök hücrelerden üç boyutlu organoid geliştirme protokollerini öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar la Ligue Genevoise contre le Cancer (Cenevre, Isviçre), ıSREC Vakfı (Lozan, Isviçre) ve Clayton Araştırma Vakfı (Houston, TX, ABD) mali destek için teşekkür ederiz. Dahası, yazarlar, HES-HO ve Wyss merkezi mali destek için teşekkür ederiz. Krause 'nin laboratuvarına yararlı tartışmalar ve destek ve Dr. Halah Kutaish 'i proofreading için teşekkür ederiz.

Bu protokol Cenevre Üniversitesi insan Araştırmaları Etik Komitesi 'nin yönergelerine uyur.
1. farklılaşmış insan embriyonik kök hücrelerinin bakım ve kültürü (hESCs)
<ol><li>Belirli bir ekstrelüler matris ile ön kaplama yemekleri ile besleyici içermeyen koşullarda hSECs 'nin bakım ve genişlemesini gerçekleştirin.<ol>
<li>Çözülme 300 μL 4 °C ' de (tipik menzil konsantrasyonu 18-22 mg/mL, buz üzerinde tutun) ve 15 mL soğuk DMEM orta ile hafifçe karıştırın, ekstrellüler matrisin erken bir jelasyonunu önlemek için. Ekleme 7,5 ml her iki T150 flasks için ekstrellüler girmiyorsun.</li>
		<li>37 °C ' de en az 1 saat (maksimum gecede) için ekstrellüler matriks ile kaplanmış yemekleri inküt.</li>
		<li>Orta ve tohum hESCs 6,5 x 104 hücreli/cm2yoğunluğuna çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HESC orta ve 1% penisilin/streptomisin içinde H1 (hESC hücre hattı) koruyun.</li>
	<li>Hücreleri enzimatik prosedürle geçirin: 37 °C ' de 1-2 dk. T75 cm2 Flask 'A 7,5 ml enzimatik çözelti ekleyin. Hücreler tamamen ayrıldıktan sonra, 7,5 mL DMEM-F12 ekleyin ve sonra 300 x g'de 5 dakika santrifüjün. Daha iyi bir hayatta kalma için izin vermek için, istenen yoğunlukta hücre dışı matris kaplı yemekler üzerine yeniden plaka hücreleri, Rho ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü (10 μM) içeren aynı ortamda 24 saat.</li>
</ol>2. GBM çalışmaları için hESC-türev nöral organoidler
<ol><li>3D kültürünü başlatmadan önce 24 saat, hESC ortamını, 10 μM kaya inhibitörü ile takviye edilen serum içermeyen bir ortam ile değiştirin (her iki bileşen de bir mikrokuyu içinde toplama aşamasında hücre hayatta kalma ve spontan nöroküre oluşumunu desteklemek için gereklidir. plaka). Hücreler 60% konfluency olmalıdır. Ertesi gün (0. gün), hESC kolonilerini tek hücreler olarak ayırın: ortamı çıkartın, sonra CA2 +/mg2 +olmadan PBS ile durulayın, 5 ml enzimatik çözünme solüsyonu ekleyin ve 37 °c ' de 1-2 dk. boyunca inküye yapın.</li>
	<li>10 μM kaya inhibitörü ile serum içermeyen ortamdaki hücreleri toplayın ve 5 dakika boyunca 300 x g 'lik hücrelerde Santrifüjü kaldırın ve 10 μm kaya inhibitörü ile tamamlayıcı olarak 10 ml serum-ücretsiz orta hücrelerde sayınız.</li>
	<li>Paralel olarak, mikrowell plaka ile durulayın 2 mL serum-ücretsiz orta başına ve plaka Santrifüjü 1200 x g 5 dakika tüm kabarcıkları kaldırmak için, hangi nöroküre oluşumu önleyebilir.</li>
	<li>10 μM kaya inhibitörü ile takviye edilen serum-ücretsiz orta 12,5 mL hücrelerde 28,2 x 106 hazırlayın. 1000 hücreleri/mikrokuyu dispense. Hücreleri 5 dakika 300 x g 'de santrifüjler ve plakayı, 37 °c ' de (maksimum 36 h), kuluçorda yerleştirin. Örneğin: 30 insan nöral organoidleri elde etmek için,% 70-% 80 ' lik bir T150 Flask kullanın (yaklaşık 30.000.000 hücre).</li>
	<li>Ertesi gün (gün 1), küreler toplamak (bir P1000 ile) ve 6 iyi plaka yerleştirin. Her iyi, eklemek 2 mL B27 orta ve DMEM-F12 GlutaMAX ve Nörobasal Orta (Mix 1:1), ile tamamlayıcı 1% B27 takviyeleri ve 1% olmayan esansiyel amino asitler (NEAA). Hızlı nöral indüksiyon tanıtmak için, 10 μM TGFβ/Activin/nodal inhibitörü ve 0,5 μM kemik morfojenik protein (BMP) inhibitörü oluşan Dual-SMAD inhibisyonu kokteyl ile orta ek. Bu adımda ileri, küreler rotasyon kültürlü (60 rpm, orbital Shaker). Rotasyon küreler birlikte veya plaka yapışmasını önlemek için önemlidir.</li>
	<li>Her 2-3 gün Orta değiştirin: plaka viraj ve küreler 5 dakika aşağı düşmek izin, Orta (2 mL) yarısını kaldırmak ve büyüme faktörleri ve inhibitörleri ile tamamlayıcı 2 mL taze B27 orta ekleyin. Küreler Santrifüjü yapmayın.</li>
	<li>Aşağıdaki zaman kursuna göre nöral indüksiyon gerçekleştirin:<ol>
<li>Gün 1-4, bir kültür, bir çift-SMAD ile desteklenen B27 orta küreler. Dual-SMAD inhibisyonu kokteyl (10 μM TGFβ/Activin/nodal inhibitörü ve 0,5 μM BMP inhibitörü) nöral indüksiyon teşvik.</li>
		<li>4-11 günden itibaren, 10 ng/ml epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 10 ng/ml temel fibroblast faktörü (bFGF) ekleyerek çift-Smad kokteyli ile desteklenen B27 ortamına HESC türevi nöral rozet (küreler içine) proliferasyonu teşvik. Not: 11. günde, hücrelerin çoğu Nestin için pozitif olmalıdır.</li>
		<li>Gün 11-13, bir kültür, B27, 0,5 μM BMP inhibitörü ile desteklenen orta küreler.</li>
		<li>Gün 13-21, kültür, 10 ng/mL glial türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF), 10 ng/mL beyin türeyen nörotrofik faktör (BDNF) ve 1 μM γ-secretaz inhibitörü ile tamamlayıcı B27 orta küreler. GDNF ve BDNF nöronal ve glial farklılaşma teşvik. Γ-secretaz inhibitörü daha fazla nöral olgunlaşma sağlar.</li>
		<li>21. gün, bir hidrofilik Politetrafloroetilen (PTFE) membran (6 mm çapı, 0,4 μm) üzerinde küreler (yaklaşık 1.000 küreler) plaka 6 kuyu plakası için tasarlanmış bir kültür plaka Ekle yatırılır. Bu adımda herhangi bir döndürme durdurun. Parlak alan mikroskobu ile gözlenen Rosettes varlığı, nöral farklılaşma başlamasını gösterir. Nöral rozet PTFE membran üzerinde kaplama küreler sonra 2-3 gün görülebilir.</li>
		<li>Büyüme faktörleri ve inhibitörleri ile tamamlayıcı 1 mL B27 orta ekleyin (takip gibi) her iyi membran Ekle altında, her 2-3 gün (genellikle Pazartesi, Çarşamba ve Cuma), farklılaşma aşağıdaki 3 hafta için.</li>
		<li>21-25 günden itibaren, aynı nöral olgunlaşma ortamında insan sinirsel organoidleri yetiştirmek (CF. Adım 2.7.4).</li>
		<li>Gün 25-28, sadece 1 μM γ-secretaz inhibitörü ile B27 orta tamamlayıcı.</li>
		<li>Gün 28-39, γ-secretaz inhibitörü eklemeyi durdurun ve sadece B27 orta insan nöral nevuslardır kültürü devam. Not: 3 hafta sonra, nöral organoidler GıC implantasyonu için kullanıma hazırdır. Nöral olgunlaşma boyunca, nöral olgunlaşmamış Marker Nestin 'in azalması ve olgun nöral işaretçilerinin β3-tubulin ve GFAP artışı gözlenmiştir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. glioblastoma-başlatma hücrelerinin yalıtım ve ekimi (Gıcs)
<ol><li>Yüksek dereceli insan GBM biyopsisi ile GICs izole. 0,1 mm EDTA (4:1)% 0,25 tripsin içeren bir kabı içinde tümör parçası transfer ve yavaşça 30-60 dk (tümör boyutuna bağlı olarak) için 37 °c ' de karıştırın.</li>
	<li>Plate 75 cm2 doku kültürü şişeler içinde ayrılmış hücreler cm2 başına 2500-5000 hücrelerde kaplama: dmem/F-12 orta (1:1) içeren 1% N2, 1% B27, ve 1% G5 takviyeleri (GIC hayatta kalma lehine), bFGF ve EGF ile tamamlayıcı (her ikisi de 10 ng/ml,) ve penisilin/streptomisin% 1 ' i teşvik etmek.</li>
	<li>Bir kez GıC iyi kurulan ve büyüyen, GıC orta N2 ve G5 takviyeleri kaldırın.</li>
	<li>Hücreler organoid üzerine eklemeden önce bir gün, Gıcs ayırmak ve onları saymak.</li>
	<li>2 mL GıC orta ile mikrowell plaka durulayın ve kabarcıkları kaldırmak için maksimum hızda plaka Santrifüjü (1000 x g). Microwell başına bir gliomasphere elde etmek için 1.000 hücrelerinde GICs yerleştirin. Gece 37 °C ' de (Şekil 1C) Inküye yapın. Bu adım anahtardır ve iyi kalibre edilmiş GIC 'ler için izin verir ( Şekil 2a,C'de nekrotik ve aşırı boyutlu gics örneği gösterilir).</li>
	<li>GBM istilası başlatmak için, büyük bir pipet ucu (Şekil 1F) ile nöral doku üzerine bir gliomasphere ekleyin. 6 kuyu plakasını dikkatlice kuluçevine yerleştirin.</li>
</ol>4. PD çalışmaları için hESC-türev dopaminerjik organoidler
<ol><li>Gün 0:% 60 konfluency (gün 0) kadar 2D kültürde hESCs yükseltmek, sonra serum-ücretsiz orta ile hESCs pluripotency özelliklerini korumak için kullanılan kök hücre medya değiştirin. 0,5 μM BMP inhibitörü ve 10 μM TGFβ/Activin/nodal inhibitörü (Dual-SMAD inhibisyonu kokteyli) ile kültür ortamını tamamlayıcı olarak nöral indüksiyon başlatın, sonra 10 μM kaya inhibitörü ekleyin 24 h geçiş sırasında hücrelerin hayatta kalma oranını artırmak için.</li>
	<li>1. gün: 0,5 μM BMP inhibitörü, 10 μm tgfβ/activin/nodal inhibitörü ve 10 μm kaya inhibitörü ile tamamlayıcı serum-ücretsiz orta başına 2,5 ml ile mikrokuyu plaka hazırlayın. Nöral tüpün ventral desenine doğru hücreleri belirlemek için 100 ng/mL Sonic Hedgehog (SHH), 100 ng/mL fibroblast büyüme faktörü 8 (FGF8) ve 2 μM düzgünleştirilmiş agonist ekleyin. Plaka Santrifüjü (sadece orta ve hücrelerle birlikte) 1200 x g 'de 5 dakika boyunca hava kabarcıklarını mikrokuyulardan çıkarmak için.<ol>
<li>2D nöral indüksiyon 1 gün sonra, orta çıkarın ve CA2 +/MgCl2 +olmadan PBS ile hızlı bir şekilde yıkayın. T75 cm2 flask 'de 7,5 ml rekombinant enzimatik çözeltisi ekleyerek kolonileri tek hücrelerde süspansiyon ile ayırın. 37 °C ' de 2 dakika boyunca inkübe sonra 7,5 mL DMEM-F12 ile tamamlayın.</li>
		<li>300 x g 'de hücre süspansiyon ve Santrifüjü toplayın 5 dk. süpernatant kaldırmak ve mikrowell plaka hazırlamak için kullanılan aynı ortamda hücreleri saymak.</li>
		<li>Mikrowell başına 1000 hücre içeren nörokürler oluşturmak için izin veren bir hücre süspansiyonu elde etmek için orta hacmi ayarlayın (örneğin, burada kullanılan mikrokuyu plaka iyi başına 4.700 Mikrokuyucuklu içerir). Yani, hazırlamak 4.700.000 hücreleri Orta 2,5 mL ve önceden plaka yerleştirilen orta önceki 2,5 mL ekleyin.</li>
		<li>Her bir mikrokuyu hücrelerinde doğru dağıtmak için, hafifçe plaka sallayın ve 5 dk için mikrokuyu plaka 300 x g Santrifüjü, Ocak 37 °c ' de 24 h için küreler oluşturmak için tabur.</li>
	</ol></li>
	<li>2. gün: mikrokuyuları hafif bir şekilde orta ve topla ve ardından küreler doku-tedavi altı-kuyu plakasında aktarın. % 1 B27, 1x NEAA, 2 mM L-glutamin ve penisilin/streptomisin 1% ile desteklenen Nörobazal orta ile orta değiştirin. Ayrıca, bölge faktörleri SHH, FGF8, düzleştirilmiş agonist ve Dual-SMAD inhibisyonu küçük molekülleri ekleyin.<ol>
<li>37 °C ' de (60 rpm, orbital Shaker) rotasyonlu küreler yerleştirin ve her 2-3 günde bir yarım orta taze takviye yapın.</li>
	</ol></li>
	<li>3. gün: nöral indüksiyon geliştirmek ve bir orta beyin kimliği ile nöral progenatörler dönüştürmek Için, 3 μM GSK-3β inhibitörü ile orta ek, WNT/β-katenin yol etkinleştirir. 13. güne kadar orta GSK-3β inhibitörü koruyun. Hem Küre yoğunluğunu azaltmak hem de küre toplama önlemek için iki yeni doku-tedavi 6 kuyu plakaları bölünmüş. Not: 8. gün, hücrelerin çoğu Nestin için pozitif olmalıdır.</li>
	<li>8. gün: nöral olgunlaşma başlatın: bölgeselleşme faktörleri Shh, FGF8, düzeltilir agonist ve Dual-Smad inhibisyonu kokteyl 0,5 mm dibutyryl Camp (olgunlaşma lehine), 20 Nm inhibitörü histon deasetilaz (hücre döngüsü çıkışı için), 1 μM γ-secretase değiştirin inhibitör ve büyüme faktörleri, 10 ng/ml GDNF, 10 ng/ml BDNF, 1 ng/ml dönüşüm büyüme faktörü β3 (tgfβ3), ve 5 ng/ml FGF20 (her iki lehine da progenitör Survival). Her 2-3 günde bir ortamı değiştirin.</li>
	<li>21. gün: nöral organoid oluşturun: PTFE membran (6 mm çapında) üzerinde hava-sıvı arayüz koşulları altında 100 nörokürler etrafında tohum. Membranı bir kültür plakası sokasına (0,4 mm) aktarın ve daha önce açıklandığı gibi nöroküre farklılaşması için kullanılan 1,2 mL nöral olgunlaşma ortamını ekleyin.<ol>
<li>Bu adımda herhangi bir döndürme durdurun. Gerekli farklılaşma zaman noktası elde edilinceye kadar her 2-3 günde bir ortamı değiştirin. Not: nöral olgunlaşma Ile Ilgili olarak, nöral olgunlaşmamış işaretçinin Nestin 'in azalması ve olgun nöral işaretçilerinin β3-tubulin ve GFAP artışı gözlenmiştir. Yüksek TH ve NURR1 ifadeleri (Şekil 3c) gözlenen ve nöral nevuslardır olgunluk onaylamak11.</li>
	</ol></li>
</ol>5. dopaminerjik farklılaşma geçerliliği için TH ve Nurr1 Gen ifadesinin ölçülmesi
<ol><li>RNA ekstraksiyonu: belirtilen farklılaşma gününde, 350 μL RLT tampon ile Lyse 40 nörokürler (RNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilir) 2-mercaptoetanol ile 3,5 μL ile desteklenmektedir. Üreticinin talimatlarını takiben RNA ekstraksiyon kiti kullanarak RNA 'ya lysed nörokürlerin özü.</li>
	<li>Toplam RNA konsantrasyonlarını ölçün.</li>
	<li>Nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) için Ters transkripsiyon kiti kullanılarak toplam RNA ekstraksiyonu 300 ng Ters transkripsiyon gerçekleştirin ve üreticinin talimatlarını izleyin.</li>
	<li>Asimetrik Siyanin boya tespiti temelinde gerçek zamanlı PCR algılama sistemlerinde qPCR analizini gerçekleştirin. Temizlik genler ile veri normalleştirmek: gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) ve uzama faktörü 1-alfa (EF1). Astar dizileri Tablo 1' de açıklanmıştır.</li>
</ol>6. yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) tespiti
<ol><li>Dopamin varlığını algılamak için elektrokimyasal algılama ile yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) kullanın. Dopamin 100 ml 0,1 N perklorik asit (HClO4) içinde parçalanması nöral organoidler tarafından çıkarılan 15 dk 4 °c ' de her 5 dakikada bir güçlü bir vortekslenir ile. Santrifüjden sonra, dopamin dozu için süpernatant 'ı-20 °c ' de toplayın ve saklayın.</li>
	<li>Analitleri, 1 mL/dakika akış hızında izokrat modda ters fazlı HPLC ile ayırmak için C-18 sütununu (5 μm, 4,6 mm x 150 mm) kullanın. Dopamin tespiti + 200 MV potansiyeline sahip klima hücresi seti ile bir Kulometrik Dedektör kullanılarak yapılmalıdır.</li>
</ol>7. microelectode dizi (MEA) platformu ile ham veri kaydı
<ol><li>Nöroküreler gözenekli MEA cihazının merkezine aktarmak için bir diseksiyon mikroskop kullanın.</li>
	<li>Elektrofizyolojik kayıtlar için bir amplifikatör ve veri toplama sistemi kullanın. Sinyal-gürültü oranı (SNR) 5 dakika kayıt sırasında voltajın standart sapması olarak ölçer, aynı 5 dk dönemde kaydedilen sivri ortalama zirve-to-pik voltaj olarak sinyal kullanarak.</li>
</ol>

<ol><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System%3A+a+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Daphu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+animal+models+for+studying+brain+metastasis%3A+value+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">In vivo animal models for studying brain metastasis: value and limitations.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 30 (5), 695-710 (2013).</li>
<li>Huszthy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+primary+brain+tumors%3A+pitfalls+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo models of primary brain tumors: pitfalls and perspectives.</a> Neuro Oncology. 14 (8), 979-993 (2012).</li>
<li>Nayernia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+brain+tumor+cell+invasion+of+engineered+neural+tissues+and+in+vivo+features+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The relationship between brain tumor cell invasion of engineered neural tissues and in vivo features of glioblastoma.</a> Biomaterials. 34 (33), 8279-8290 (2013).</li>
<li>Cosset, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue+engineering+allows+the+identification+of+active+miRNA+regulators+of+glioblastoma+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness.</a> Biomaterials. 107, 74-87 (2016).</li>
<li>Pringsheim, T., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+Parkinson%27s%27s+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">The prevalence of Parkinson's's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Movement Disorders. 29 (13), 1583-1590 (2014).</li>
<li>Rajput, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globus+pallidus+dopamine+and+Parkinson%27s+motor+subtypes%3A+clinical+and+brain+biochemical+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Globus pallidus dopamine and Parkinson's motor subtypes: clinical and brain biochemical correlation.</a> Neurology. 70 (16 Pt 2), 1403-1410 (2008).</li>
<li>Jellinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+Parkinson%27s%27s+disease.+Changes+other+than+the+nigrostriatal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Chemical+Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Pathology of Parkinson's's disease. Changes other than the nigrostriatal pathway.</a> Molecular and Chemical Neuropathology. 14 (3), 153-197 (1991).</li>
<li>Bernheimer, H., Birkmayer, W., Hornykiewicz, O., Jellinger, K., Seitelberger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+dopamine+and+the+syndromes+of+Parkinson%E2%80%99s+and+Huntington.+Clinical%2C+morphological+and+neurochemical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurological+Science%22%5BJournal%5D)">Brain dopamine and the syndromes of Parkinson’s and Huntington. Clinical, morphological and neurochemical correlations.</a> Journal of Neurological Science. 20 (4), 415-455 (1973).</li>
<li>Tieng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+midbrain+organoids+containing+long-lived+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons.</a> Stem Cells and Development. 23 (13), 1535-1547 (2014).</li>
<li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Biomimetic+Cultures%3A+The+Next+Platform+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">3D Biomimetic Cultures: The Next Platform for Cell Biology.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 798-800 (2016).</li>
<li>Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+dimensions+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">New dimensions in cell migration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 743-747 (2012).</li>
<li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNCA+triplication+Parkinson%27s%27s+patient%27s+iPSC-derived+DA+neurons+accumulate+alpha-synuclein+and+are+susceptible+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">SNCA triplication Parkinson's's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress.</a> PLoS ONE. 6 (11), e26159(2011).</li>
<li>Flierl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+vulnerability+and+stress+sensitivity+of+neuronal+precursor+cells+carrying+an+alpha-synuclein+gene+triplication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Higher vulnerability and stress sensitivity of neuronal precursor cells carrying an alpha-synuclein gene triplication.</a> PLoS ONE. 9 (11), e112413(2014).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Bu protokolün en önemli yönlerinden biri, hücre kültürü ve küreler ve nöral nevuslardır morfoloji yakın izlenmesi sırasında HESC pluripotency bakımı içerir. hESCs çok duyarlıdır ve her manipülasyon erken kontrolsüz farklılaşma yanı sıra hücre ölümü yol açabilir. Deneysel yeniden üretilebilirliği artırmak ve anormal karyotip olayların oluşumunu önlemek için, kromozom stabilitesini doğrulamadan sonra en düşük geçit sırasında birkaç hESCs toplu saklama tavsiye edilir. Dahası, her deneme için yeni bir şişe çözme ve hücrelerin davranışını her gün kontrol etmek için tavsiye edilir. Eğer küreler anormal yüksek boyutta daha az refraktif ise, muhtemelen toplama ve ölmek başlayacaktır.
Bu sistem üzerine bir gelişme ya perfüzyon ya da bir vaskülarize sistemi uygulama (endotel hücreleri ekleyerek veya bir 3D fluidik mikroçip içinde)12,13. Ancak, nöral nevuslardır kalınlığı kontrol (≤ 300 μm) oksijen ve besin verimli pasif perfüzyon sağlar ve nekroz önler. Başka bir gelişme bağışıklık hücrelerinin (microglia) giriş olduğunu. Bu sınırlamalar akılda, nöral organoids artı bir GıC sistemi çeşitli nedenlerle ilgili bir araç olabilir. İlk olarak, bu sistem ilaç taramasının bir terapötik bileşiğin bir nevuslardır veya tümör hücresini nasıl etkileyebileceğini izlemesine izin verir. İkincisi, hücre-hücre etkileşimleri incelenebilir ve bireysel ve toplu istilalar temel mikro-çevresel belirleyici görselleştirilebilir ve5,6,13keşfedilebilir.
Parkinson hastalığı bağlamında, da nöronlar içinde zenginleştirilmiş bir nöral nevuslardır hastalık gelişimini incelemek için ilgili ve doğru bir 3D modeli temsil edebilir. Önceki çalışmalarda, Parkinson hastalarına indüklenen pluripotent kök hücreleri da nöronlar doğru ayırt etkilenen nöronal alt türleri incelemek için kullanılmıştır. Dikkat, α-synuclein birikimi ve oksidatif strese duyarlılık gibi hastalıkla ilgili bazı fenotürleri14,15. Dahası, nöral nevuslardır terapötik molekülleri ekrana bir araç olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, dopamin üretimi ve elektrofizyolojik aktivite gibi DA nöron hayatta kalma ve işlevselliğini değerlendirmek için belirli ve ilgili okumalar ayarlanmalıdır. Bu protokol, nöral organoidler oluşturmak için iki standart ve doğru kök hücre tabanlı yaklaşımlar sağlar.

Dünya Sağlık Örgütü (WHO) düşük dereceli (sınıf ı II) veya yüksek dereceli (grade III ve IV) olarak astrositomları sınıflandırır. Glioblastoma multiforme (GBM) bir astrositom grade IV, primer beyin tümörlerinin en ölümcüldür, bu tedaviler tüm mevcut formları dayanıklıdır1. Nöroşirürji, kemoterapi ve radyoterapi dahil olmak üzere standart bakım tedavisine rağmen, GBM ölümcül kalır ve 15 aylık genel hayatta kalma oranı son 15 yıl2' de önemli ölçüde değişmemiştir. GBM patogenezini anlamada önemli ilerlemeler sağlamak için ilgili modellerin kullanımı anahtardır. Şimdiye kadar, GBM çalışma hücre hatları, kemirgen organottifik dilimleri ve fare veya transjenik fareler içine hasta türeyen hücrelerin ksenotransplantasyon güvenmiştir spontan tümörler geliştirmek3,4. Bu modeller beyin metastam ve tümör saldırganlık çalışması için yararlı olmasına rağmen, onlar türler arasında farklılıklar ile sınırlıdır, ve sonuç yanlış insan dokularına çevrilebilir olabilir. Dahası, insan hücreleri ile mevcut modeller de ana doku yokluğunda sınırlıdır/tümör etkileşimleri3,4. Deneysel modeller temel bilimin terapötik hedeflere çevirisi için önemlidir. Bu nedenle, GBM-başlatma hücreleri (Gıcs) ile birlikte kültürlü insan nöral organoidler üretmek için bir protokol açıklayan GBM gelişimi morfolojik ve fonksiyonel özellikleri taklit ilgili bir sistem sağlayabilir. Bu sistem, işgal hücrelerin ve nekroz alanlarının difüzör göçü gibi GBM gelişiminin bazı in vivo özelliklerini yeniden üretir ve tümör Biyolojisi ile ilgili gen ifadesini vurgular. Daha önce ortaya çıktığı gibi, bazı kritik MicroRNAs 3D sinir dokusu içinde GIC geliştirme sırasında indüklenir5,6.
PD büyük bir nörodejeneratif bozukluk ve multipl nöronal alt türleri7ile ilişkili. Belirtiler (örneğin, bradikezi, asimetrik dinlenme tremor, rijitlik ve duruş istikrarsızlık) Progressive başlangıçlı olsa bile, tam etiyolojisi açıkça kurulmaz. Nitekim, birçok çalışmada büyük risk faktörleri genetik ve çevresel faktörlerin bir arada neden olabilir kanıtlar vurgulandı. Parkinson belirtileri, dopaminergik nöronların bilateral dejenerasyonu ile ilişkilidir (sn), bu da striatum8,9' a yansıtılmaları için (da) aksonların kaybolmasına yol açan. Bu nedenle, striatal dopamin düzeylerinin azaltılması PD hastalarında motor fonksiyon bozukluğu ilerlemesi ile ilişkilidir. Dopaminerjik nöronlar tirozin hidroksilaz (TH) içerir, dopamin10için amino asit l-Tirozini l-3, 4-dihiddroxyphenylalanine (l-dopa, dopamin öncüsü) dönüştüren katekolaminergik nörotransmitter sentezinde anahtar bir enzim. TH proteini ifadesinde bir düşüş sonrasında ıncı aktivitesinin erken kaybı PD 'nin bir damgasını oluşturur.
Bu çalışmada, insan nöral organoidleri kullanarak iki protokol açıklanmaktadır, özellikle TH-pozitif hücreler ile zenginleştirilmiş bir orta beyin benzeri fenotip doğru odaklı bir.

<table><tbody><tr><td>6 kuyulu plaka (6 kuyulu plaka)</td><td>Falcon / Corning</td><td>07-201-588</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7900 HT algılama sistemi&nbsp; (Gerçek Zamanlı PCR tespit sistemleri)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Durdurulan</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 (Microwell kültür plakaları)</td><td>StemCell Technologies</td><td>34421</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör (W2100-HS32)&nbsp; (Amplifikatör)</td><td>Çok Kanallı Sistemler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFR (fosfo Y1101) antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab76195</td><td>1/100 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Antikoru Dako&nbsp;</td><td>Z334&nbsp;</td><td>1/1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-Nestin, İnsan Antikoru</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>ABD69&nbsp;</td><td>1/400 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-Sinapsin I Antikoru</td><td>Chemicon&nbsp;</td><td>AB1543P&nbsp;</td><td>1/500 seyreltme</td></tr><tr><td>B27 takviyeleri (B27)</td><td>Yaşam Teknolojileri / Invitrogen</td><td>1238</td><td>Her iki protokol için de stok çözelti 100x, nihai çözelti 1x</td></tr><tr><td>Beyin kaynaklı nörotrofik faktör&nbsp; (BDNF)</td><td>Hücre Kılavuzluğu</td><td>GFH1-2</td><td>Her iki protokol için,&nbsp; stok çözeltisi 100 & mikro; saf H2O içinde g / mL, nihai çözelti 20 ng / mL</td></tr><tr><td>CHIR-99021 (GSK-3 ve beta; inhibitör)</td> <td>Axon Medchem</td><td>ct99021</td><td>Dopaminerjik protokol için, &nbsp; DMSO'da stok çözeltisi 7.5 mM, nihai çözelti 3 ve mikro; </td></tr><tr><td>M, Bileşik, E, A & gama; &ndash; sekretaz inhibitörü (&gamma; &ndash; sekretaz inhibitörü</td>) <td>Calbiochem</td><td>CAS 209986-17-4</td><td>Her iki protokol için (gama-sekretaz inhibitörü XXI), &nbsp; DMSO'da stok çözeltisi 5 mM, nihai çözelti 1 ve mikro; M</td></tr><tr><td>Coulochem III&nbsp; (Kulometrik dedektör parametreleri)</td><td>Termo bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dibutiril siklik-AMP (Dibütiril cAMP)</td> <td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Dopaminerjik protokol için, &nbsp; DMSO'da stok çözeltisi 0.5 M, nihai çözelti 0.5 mM</td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit Saf (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C6164</td><td>Bileşikleri çözücü, kullanıma hazır</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12491-015</td><td>Hücre kültürü için, hazır </td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta Karışımı F-12'yi kullanmak için (DMEM-F12)</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>Hücre kültürü için kullanıma hazır</td></tr><tr><td>EDTA 0.1 mM (EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9912</td><td>Hücre kültürü için kullanıma hazır</td></tr><tr><td>Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)</td><td>Gibco</td><td>PHG0313</td><td>GIC kültürü için,&nbsp; stok çözeltisi 100 &mikro; saf H2O içinde g/mL, nihai çözelti 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Fibroblast Büyüme Faktörü 20 (FGF20)</td><td>Peprotech</td><td>100-41</td><td>Dopaminerjik protokol için,&nbsp; stok çözeltisi 100 & mikro; saf H2O içinde g/mL, nihai çözelti 5 ng/mL</td></tr><tr><td>fibroblast büyüme faktörü 8&nbsp; (FGF8)</td><td>Peprotech</td><td>GFH176-5</td><td>Dopaminerjik protokol için,&nbsp; stok solüsyonu 100 & mikro; saf H2O içinde g/mL, nihai çözelti 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Fibroblast büyüme faktörü-bazik (bFGF)</td><td>Gibco</td><td>PHG0024</td><td>GIC kültürü için,&nbsp; stok çözeltisi 100 &mikro; saf H2O içinde g/mL, nihai çözelti 10 ng/mL</td></tr><tr><td>G5 takviyeleri (G5)</td><td>İnvitrojen</td><td>17503012</td><td>GIC kültürü için, stok çözelti 100x, nihai çözelti 1x</td></tr><tr><td>Glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF)</td><td>Hücre Rehberliği</td><td>GFH2-2</td><td>Her iki protokol için,&nbsp; stok çözelti 100 & mikro; saf H2O içinde g / mL, nihai çözelti 20 ng / mL</td></tr><tr><td>Hidrofilik politetrafloroetilen ve nbsp; membran (PTFE membran)</td> <td>BioCell-Interface Durdurulan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189 (BMP inhibitörü)</td> <td>Axon Medchem / Stemgen</td><td>04-0072-02 / 1509</td><td>Çift / Smad, &nbsp; DMSO'da stok çözeltisi 5 mM, nihai çözelti 0.5 ve mikro; M</td></tr><tr><td>L-glutamin (L-glutamin)</td> <td>Gibco</td><td>25030081</td><td>L-Glutamin (200 mM), stok çözeltisi 200 mM, nihai çözelti 2 mM</td></tr><tr><td>Matrigel (hücre dışı matris)</td> <td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>hESC nitelikli Matris, stok çözeltisi 18-22 mg / mL, nihai çözelti 180-220 ve mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Millicell-CM Kültür plakası eki ve nbsp; (0.4 & mikro; m) (Kültür plakası eki)</td> <td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal Anti-&beta;-Tubulin III antikoru</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T8660 ve nbsp;</td><td>1/1000 seyreltme</td></tr><tr><td>MS Orbital Çalkalayıcı, MS-NOR-30 (Orbital çalkalayıcı)</td><td>Major Science</td><td>MS-NRC-30</td><td></td></tr><tr><td>N2 takviyeleri (N2)</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>GIC kültürü için, stok çözelti 100x, nihai çözelti 1x</td></tr><tr><td>Nanodrop (Nanodrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific Durdurulan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal (Nörobazal)</td><td>Yaşam Teknolojileri / Gibco</td><td>21103049</td><td>Embriyonik nöronal hücre popülasyonlarının idame ve olgunlaşması, kullanıma hazır</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitlerin idame ettirilmesi ve olgunlaşması. (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler 100X, stok çözelti 100x, nihai çözelti 1x</td></tr><tr><td>Nurr1 Antikoru (M-196)</td> <td>Santa Cruz</td><td>Sc-5568</td><td>1/100 seyreltme</td></tr><tr><td>Nutristem&nbsp; (hESC ortamı)</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>05-100-1A</td><td>Kök hücre ortamı, kullanıma hazır</td></tr><tr><td>Penicilin / Streptomycin&nbsp; (Penisilin / Streptomisin)</td><td>Yaşam Teknolojileri / Gibco</td><td>15140122</td><td>Hücre kültürü için stok çözelti 5 mg/mL, nihai çözelti 50 & g/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Perklorik asit 0.1N (HCLO4)</td> <td>Merck</td><td>100519</td><td>HPLC için,</td></tr><tr><td>Ca2 + / Mg2 +& nbsp içermeyen kullanıma hazır Fosfat Tamponlu Salin; (Ca2+/Mg2+ olmadan PBS)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190250</td><td>Hücre kültürü için kullanıma hazır</td></tr><tr><td>PrimeScript RT-PCR Kiti (Ters transkripsiyon kiti)</td><td>Takara</td><td>RR014A</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamin (düzleştirilmiş agonist)</td><td>Calbiochem</td><td>SML0868</td><td>Dopaminerjik protokol için,&nbsp; DMSO'da stok çözelti 10 mM, nihai çözelti 2 ve mikro; M</td></tr><tr><td>Rho ile ilişkili Kinaz Y-27632 (ROCK)</td> <td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120129-1</td><td>Kaya İnhibitörü, &nbsp; DMSO'da stok çözeltisi 50 mM, nihai çözelti 10 ve mikro; M</td></tr><tr><td>RNeasy mini kiti (RNA ekstraksiyon kiti)</td> <td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542 (TGF ve beta; / Aktivin / Nodal inhibitörü)</td> <td>Ascent</td><td>Asc- 163</td><td>Dual-Smad, &nbsp; DMSO'da stok çözeltisi 50 mM, nihai çözelti 10 ve mikro; M</td></tr><tr><td>Sonic Hedgehog (SHH)</td> Dopaminerjik protokol için <td>Hücre Kılavuzu</td><td>GFH168-5</td><td>, &nbsp; stok çözeltisi 100 & mikro; saf H2O içinde g/mL, nihai çözelti 100 ng/mL</td></tr><tr><td>StemPro Accutase (hESC enzimatik solüsyon)</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>hESC enzimatik solüsyon, kullanıma hazır</td></tr><tr><td>Simetri C-18,5 mm (4.6 150mm2)&nbsp; (Ters faz sütunu)</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T150 şişesi (T150 şişesi)</td> <td>Falcon</td><td>08-772-1F</td><td></td></tr><tr><td>TH Antikoru (F-11)</td> <td>Santa Cruz</td><td>Sc-25269</td><td>1/200 seyreltme</td></tr><tr><td>Dönüştürücü Büyüme Faktörleri beta 3 (TGF ve beta; 3)</td> Dopaminerjik protokol için <td>Hücre Rehberliği</td><td>GFH109-2</td><td>, &nbsp; stok çözeltisi 100 ve mikro; saf etanol içinde g / mL, nihai çözelti 1 ng / mL</td></tr><tr><td>Trichostatine A (histon deasetilaz inhibitörü)</td> <td>Sigma</td><td>T8552</td><td>Dopaminerjik protokol için, &nbsp; stok çözeltisi 100 & mikro; DMSO'da M, nihai çözelti 20 nM</td></tr><tr><td>TrypLE (rekombinant enzimatik çözelti)</td><td>İnvitrojen</td><td>12604021</td><td>rekombinant enzimatik çözelti, kullanıma hazır</td></tr><tr><td>Tripsin %0.25 (enzimatik çözelti)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15050065</td><td>enzimatik çözüm, kullanıma hazır</td></tr><tr><td>W2100, Çok Kanallı Sistemler (Veri toplama sistemi)</td><td></td><td>WAT045905</td><td></td></tr><tr><td>X-vivo (serumsuz ortam)</td><td>Lonza</td><td>BE04-743Q</td><td>serum içermeyen ortam, kullanıma hazır</td></tr></tbody></table>

beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesi için insan nöral organoidler

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

İlgili in vitro nöral modellerin eksikliği nöropatoloji için tıbbi ilerlemede önemli bir engeldir. İlgili hücresel modellerin kurulması, bu hastalıkların patolojik mekanizmalarını daha iyi anlamak ve yeni terapötik hedefleri ve stratejileri belirlemek için çok önemlidir. Uygun olmak için, bir in vitro model bir insan hastalığının patolojik özelliklerini çoğaltmak gerekir. Ancak, nörodejeneratif hastalık bağlamında, ilgili bir in vitro model değerli bir terapötik fırsat olarak nöral hücre değiştirme sağlamalıdır.
Böyle bir model sadece terapötik moleküllerin taramasına izin vermez ama aynı zamanda nöral protokol farklılaşması optimize etmek için kullanılabilir [Örneğin, Parkinson hastalığında transplantasyon bağlamında (PD)]. Bu çalışmada, insan sinirsel organoids (No) ve 2) nöron dopaminerjik (da) farklılaşma üç boyutlu (3D) organoid üreten içinde 1) insan glioblastoma gelişimi iki in vitro protokolleri açıklanmaktadır. Bu amaçla, insan embriyonik kök hücresi (hESC) farklılaşma elde edilen boyut kalibrasyonlu nörokürlerin üretimini sağlayan iyi standartlaştırılmış bir protokol kuruldu. İlk model, nöral nevuslardır içinde glioblastoma gelişimi sırasında meydana gelen moleküler ve hücresel olayları ortaya çıkarmak için kullanılabilir, da nevuslardır sadece Parkinson hastalığında hücre tedavisi için da nöronların uygun bir kaynak temsil değil, aynı zamanda olabilir ilaç testi için kullanılabilir.

Bu protokolün kritik adımlarının iyi tanımlanmalı ve düzgün şekilde işlenmesi gerekir. Bu nedenle, her adım için zaman aşımı ve farklılaşma protokolü için kullanılan bileşikler gösteren kültür koşullarının bir diyagramı sırasıyla Şekil 1a ve No artı GBM ve da nöral organoidler Için Şekil 3A 'da gösterilmektedir. Şekil 1B, C, D, E, F, hücreleri, küreler ve Hayır gösterir ve her adım için tipik morfoloji gösterir. Şekil 1G, H, ben bazı nöral işaretçileri ile immünofluorescence boyama gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59682/59682fig1.jpg"> Şekil 1 : İnsan nöral nevuslardır (No) farklılaşma protokolü. (A) insan embriyonik kök hücrelerinden (HESC) türetilen No nesil için standardize protokol. (B) HESC ortamdaki ekstrasellüler matriks üzerinde korunur. (C) kalibre edilmiş nöroküreler oluşturmak için microwell plakaları kullanılmıştır. 2 hafta içinde, nörokürler PTFE membranı içeren kesici uç üzerine kaplama yapıldı (ölçek çubuğu = 50 μm). (D) 6 kuyu plakasının bir kuyusu içinde eklemin içine No makroskopik görünümü. İlk günlerde, rozet (siyah ok) (E) görüldü. (F) üst KıSMıNDA bir No artı GIC küre makroskopik görünümü. (G-ı) NO artı GIC küre immünofluorescence Analizi (EGFR-pozitif; ölçek çubuğu = 50 μm) (G) ve tek başına, nöronal Marker βııı-tubulin için bağışıklık reaktivite gösterdi ve nestin için biraz olumlu; Ancak, synapsin 1 zayıf bir sinyal gösterdi (H, ı) (ölçek çubukları = 100 μm ve 50 μm, sırasıyla). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59682/59682fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59682/59682fig2.jpg"> Şekil 2 : Necrotik küreler ve OLGUNLAŞMAMıŞ No Illustration. Nöroküreler (A) ve No (B), iyi veya büyük boyutlu (C) (ölçek çubuğu = 10 μm) çok fazla olduğunda nekroz geçirilebilir. (D) bir domates muhabiri ile enfekte biri hiçbir tümör hücresi istilası izlemek için yardım, ölçek Bar, 10 μm. nöral tüpler (E) ve hiçbir nöral tüpler (F) (ölçek çubuğu = 50 μm) ile olgunlaşmamış No örneği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59682/59682fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59682/59682fig3.jpg"> Şekil 3 : Da nöral nevuslardır üretimi için standardize protokol ve elektrofizyolojik ve morfolojik analizler. (A) da nöral organoidlerin üretimi için standartlaştırılmış protokol. (B) da nöral organoid immünofluorescence Analizi; TH-İmmünoreaktif hücreler Co-ifade Nurr1, bir orta beyin özel Marker (ölçek çubuk = 50 μm). Veriler ortalama ± SEM (n = 3) olarak temsil edilir. (C) grafikler QRT-PCR tarafından DEĞERLENDIRILEN TH ve Nurr1 Gen ifadesinin kinetiği temsil eder. (D) temsilci HPLC: dopamin zirvesinde (ok) HPLC tarafından da nöral nevuslardır lizat tespit edildi. (E) Mea platformuyla kaydedilmiş ham veri örneği. Kalan izleme gürültü ise her başak dikey bir çizgi (zaman damgaları) tarafından görüntülenir. (F) Mea 'da bir nöroküre temsil eden resim. (G) ham verilerden algılanan tipik sivri (mavi ve kırmızı eğrilerin) süper konumu. Siyah kalın eğrisi, karşılık gelen kırmızı eğrilerin ortalamasını gösterir. (H) raster grafiği algılanan her başak ile ilişkili zaman damgalarını gösterir. Farklı renkler farklı elektrotları vurgulamaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59682/59682fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gen</td>
			<td>Foward</td>
			<td>Ters</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nurr1</td>
			<td>(Aktaş)</td>
			<td>GGAGGTCCATGCTAAACTTGACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>TH</td>
			<td>GÜLSEN</td>
			<td>BIR daha</td>
		</tr>
<tr>
<td>EEF1</td>
			<td>Emre k</td>
			<td>(GCCTGGATGGTTCAGGATA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HÜSEYIN bozkurt</td>
			<td>Gcacaagagagalagaalağakarararararar</td>
			<td>AGGGGAGATTCAGTGTGGGT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Bu protokolde kullanılan astar.

Bu çalışmada, iki spesifik insan nöral organoidleri, insan sinirsel organoidlerin içinde sadece insanlarda ve 2) nöron dopaminerjik olarak eğitim için ilgili ve doğru bir model olarak 1) insan glioblastoma gelişimi türetmek için protokoller tanıtır ve açıklanmaktadır üç boyutlu bir organoid üreten farklılaşma.

Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

Rejeneratif tıpta, pluripotent kök hücrelerin belirli bir nöral hücre tipine doğru farklılaşması için sağlam bir protokol değerli bir araçtır. Bizim olgumuzda, bu protokoller hem glioblastoma gelişimi hem de Parkinson hastalığını incelemek için çok yararlı oldu. Yani ilk olarak, üç boyutlu organoid üretimi fizyolojik gelişimi yakından taklit avantajına sahiptir, ve ayrıca pluripotent kök hücrelerden boyut kalibre nörosferüretimi yüksek tekrarlanabilirlik vardır.Aşağıdaki prosedür Manon Locatelli, bizim laboratuvardan bir doktora öğrencisi tarafından gösterecektir. Üç Boyutlu kültüre başlamadan 24 saat önce hESC ortamını 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş serumsuz ortamla değiştirin. Hücreler %60 birleşmeyle olmalıdır.Ertesi gün, orta kaldırarak ve kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile durulama hESC kolonileri tek hücre olarak ayırın. Daha sonra, enzimatik çözünme çözeltisi beş mililitre ekleyin ve bir ila iki dakika için 37 santigrat derece kuluçka. Daha sonra, 10-mikromolar ROCK inhibitörü ile serumsuz ortamda hücreleri toplamak ve beş dakika boyunca 300 kez g hücreleri santrifüj.Santrifüjden sonra hücre peletinin boyutunu kontrol edin. Supernatant çıkarın ve 10-mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenen serum içermeyen orta 10 mililitre hücreleri saymak. Buna paralel olarak, mikrokuyu plakayı her kuyuda serumsuz iki mililitre ile durulayın ve nörosfer oluşumunu önlemek için tüm kabarcıkları çıkarmak için 1, 200 kez g beş dakika boyunca plakayı santrifüj edin.Daha sonra, 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenen serumsuz orta 12,5 mililitre 28,2 milyon hücre hazırlamak. Mikrokuyu başına 1000 hücre dağıtın. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin ve mikroskop altında mikrokuyu plakasındaki hücrelerin homojen olarak yeniden bölünmesini kontrol edin.Tabağı gece boyunca 37 derecede kuvöze yerleştirin. Ertesi gün, her mikrokuyuda oluşan kürelerin boyutunu kontrol etmek için microwell plakasını inceleyin. Hızlı nöral indüksiyonu teşvik etmek için çift SMAD inhibisyonu kokteyli ile desteklenen ortamı kullanarak küreleri altı kuyulu bir tabağa aktarın.Bu adımdan itibaren küreler, birbirine yapışmasını veya plakaya yapışmasını önlemek için 60 rpm'de rotasyonla kültürlenir. Birinci günden 4'e kadar, sinirsel indüksiyon yapmadan önce her 2-3 günde bir ortamı değiştirin. Dördüncü günden 11'e kadar, egf ve bFGF'yi mililitrebaşına 10 nanogramda, çift SMAD kokteyli ile desteklenen B27 ortamına ekleyerek hESC kaynaklı nöral rozetlerin çoğalmasını teşvik edin.Gün 11-13, kültür B27 orta küreler 0.5 mikromolar BMP inhibitörü ile takviye. Gün 13-21, kültür B27 orta alanlarda GDNF ve BDNF mililitre başına 10 nanogram ve bir mikromolar gama-sekretaz inhibitörü ile desteklenmiştir. 21. günde, bir kültür plakasını yeni bir altı kuyuluk kuyununiçine yerleştirin.Daha sonra, büyüme faktörleri ve inhibitörleri ile desteklenen bir mililitre B27 ortamı nı membran ucunun altındaki her bir kuyuya ekleyin. Daha sonra, bir kültür plakası eklemek üzerinde biriken bir hidrofilik PTFE membran küreler plaka ve farklılaşma aşağıdaki üç hafta boyunca her iki ila üç günde bir orta değiştirin. Bu adımdan döndürmeyi durdurun.Rozetlerin varlığı sinirsel farklılaşmanın başlangıcını gösterir. 21.günden 25'e kadar, aynı sinirsel olgunlaşma ortamında insan sinir organoidleri yetiştirin. Sonra, gün 25-28, sadece bir mikromolar gama-sekreten inhibitörü ile B27 orta tamamlayıcı.28.günden 39'a kadar gama salgı inhibitörlerini eklemeyi bırakın ve sadece B27'de insan nöral organoid kültürüne devam edin. Üç hafta sonra, nöral organoidler GIC implantasyonu için kullanıma hazırdır. Sıfır ın gününde, iki B kültüründeki hESC'leri %60'a kadar yükseltin.Daha sonra, hESC'lerin pluripotency özelliklerini korumak için kullanılan kök hücre ortamını, ertesi gün geçiş sırasında hücrelerin sağkalım oranını artırmak için nöral indüksiyon ve 10 mikromolar ROCK inhibitörü başlatmak için çift SMAD inhibisyonu kokteyli içeren serumsuz bir ortamla değiştirin. İlk gün, aynı ROCK inhibitörü ve çift SMAD inhibisyon molekülleri içeren serumsuz ortamın kuyusu başına 2,5 mililitre ile mikrokuyu plakasını hazırlayın. Nöral tüp ventral desen doğru hücreleri ayırt etmek için, mililitre başına 100 nanogram ve iki mikromolar agonist düzeltilmiş SHH ve FGF8 ekleyin.Orta ekledikten sonra, mikrowells hava kabarcıkları kaldırmak için beş dakika boyunca 1, 200 kez g plaka santrifüj. Microwell plakayarı ayırt edici orta ile kullanıma hazır olduğunda, hESC'lerin ortasını çıkarın ve kalsiyum ve magnezyum klorürsüz PBS ile hızlı bir şekilde yıkayın. Bir T75 şişesine 7,5 mililitre rekombinant enzimatik çözelti ekleyerek kolonileri tek hücreli süspansiyona ayırın.Hücreleri 37 santigrat derecede iki dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 7,5 mililitre DMEM F12 ekleyin. Daha sonra, hücre süspansiyon ve santrifüj toplamak 300 kez g beş dakika. Sonra, supernatant çıkarın ve microwell plaka hazırlamak için kullanılan aynı ortamda hücreleri saymak.Orta hacmi, mikrowell başına 1,000 hücre içeren nöroküreler oluşturmak için bir hücre süspansiyon elde etmek için ayarlayın orta 2.5 mililitre içinde 4.7 milyon hücre hazırlayarak, ve zaten plaka yerleştirilen orta önceki 2.5 mililitre ekleyerek. Her mikrokuyudaki hücreleri doğru bir şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın ve 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin. Daha sonra, küreler oluşturmak için 24 saat boyunca 37 santigrat derecede plaka kuluçka.İkinci gün, mikro kuyuları hafifçe orta ile temizle ve küreleri doku yla tedavi edilen altı kuyuluk tabakta aktarın. Küreleri 37 santigrat derecede döndürün ve her iki ila üç günde bir temiz orta ile ortamın yarısını değiştirin. Gün üç ila 13, nöral indüksiyon geliştirmek ve bir orta beyin kimliği ile nöral atalara dönüştürmek için, üç mikromolar GSK-3-beta inhibitörü ile orta tamamlayın.Küre yoğunluğunu azaltmak ve küre toplamaönlemek için iki yeni doku tedavi altı-iyi plakalar halinde örnek bölün. Sekizinci günde, büyüme faktörleri ile yeni ortama geçerek nöral olgunlaşmaya başlayın ve her iki ila üç günde bir ortamı değiştirin. 21. günde, bir kültür plakasını yeni bir altı kuyulu plakanın bir kuyuya yerleştirin ve membran ucunun altına nörosfer farklılaşması için kullanılan 1,2 mililitre nöral olgunlaşma ortamı ekleyin.Daha sonra, ptfe membranını bir kültür plakası ekleme sokuluüzerine yerleştirin. Son olarak, nöral organoid oluşturmak için, PTFE membran üzerinde hava-sıvı arayüz koşulları altında yaklaşık 100 nörosfer tohumu. Bu adımdan rotasyonu durdurun ve gerekli farklılaşma süresi elde edilene kadar her iki ila üç günde bir orta yı değiştirin.Burada dopaminerjik nöral organoidlerin üretimi için standart bir protokol şeması. Bu görüntülerde gösterilen dopaminerjik nöral organoidlerin immünoresans analizi, orta beyne özgü bir belirteç olan Nurr1'i coexpressing TH immünoreaktif hücreleri gösterir. Bu iki grafik, nicel RT-PCR tarafından değerlendirilen TH ve Nurr1 gen ekspresyonunun kinetiklerini temsil eder.Burada MEA platformu ile kaydedilen ham veri bir örnektir. Her başak dikey bir çizgi yle görüntülenirken, kalan iz gürültüdür. Ve bu resim MEA'da biriken bir nörosferi temsil eder.Bu grafikler, ham verilerden algılanan tipik ani artışların süperpozisyonunu gösterir. Siyah kalın eğri, ilgili kırmızı eğrilerin ortalamasını gösterir. Bu raster arsa algılanan her başak ile ilişkili zaman damgaları gösterir.Farklı renkler farklı elektrotları vurgular. Bu protokoller araştırmacı nöral organoid ile kanser hücresi etkileşimi hakkında soruya cevap yanı sıra dopaminerjik organoid ile doğrudan tarama sağlar.

human-neural-organoids-for-studying-brain-cancer-neurodegenerative

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden insan beyni organoidleri üretmek için bir yöntemi göstermektedir. Nörosferin, diğer mikrop tabakalarının oluşumunu baskılayan bir nöroektodermal tabaka oluşturduğunu gösterir. Nöroküreler bir 3D jel matrisine gömülüdür ve nöroepitelyal tomurcuklar oluşturur. Organoid medya ile inkübe edildiğinde, bu nöroepitelyal tomurcuklar belirli beyin bölgelerine farklılaşır ve bu da olgun beyin organoidlerinin oluşumuna neden olur.

İnsan Beyni Organoidlerini Oluşturmak için İn Vitro Bir Yöntem

Bu videoda, İnsan embriyonik kök hücrelerinin nöral organoidlere dönüştürülmesi için aşamalı bir protokol gösterilmektedir. Yöntem, nöronal rozet oluşumunun indüklenmesini, ardından tam gelişmiş nöral organoidler elde etmek için kontrollü olgunlaşmayı ve hidrofobik bir zar üzerinde son kültürlemeyi içerir.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Nöral Organoidlere Farklılaşması ve Olgunlaşması

İnsan beyni gelişiminin modellenmesi, nöral epitel dokusunun benzeri görülmemiş karmaşıklığı nedeniyle engellenmiştir. Burada, insan beyninin gelişiminin erken olaylarını tanımlamak ve mikrosefaliyi in vitro olarak modellemek için sağlam beyin organoidleri üretimi için bir yöntem açıklanmaktadır.

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi beyin organoidlerinin üretimi ve mitokondriyal hastalıkların modelinde kullanımları için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Mitokondriyal Hastalık Modellemesi için İnsan Beyni Organoidlerinin Üretimi

Bu çalışmada, standart besleyicisiz hPSC kültürlerini kullanarak basit ama sağlam bir kortikal organoid kültür sistemi için ayrıntılı bir teknik sunuyoruz. Bu, in vitro beyin yaşlanmasının yönlerini modelleyen organoidler üretmek için hızlı, verimli ve tekrarlanabilir bir protokoldür.

Beyin Nöronal Yaşlanmasını Modellemek için Kortikal Beyin Organoidlerinin Sağlam ve Yüksek Oranda Yeniden Üretilebilir Üretimi In Vitro

Burada, etiketli nöral hücrelerin insan serebral organoidlerine nakli ve izlenmesi için bir protokol açıklıyoruz.

Nöral Hücre Transplantasyonunun İnsan Serebral Organoid Modeli

Primat serebral organoidlerinin elektroporasyonu, primat (pato) fizyolojik neokorteks gelişimine yakın bir model sistemde farklı progenitör tiplerine ve nöronlara geçici genetik modifikasyonları tanıtmak için kesin ve etkili bir yaklaşım sağlar. Bu, nörogelişimsel ve evrimsel süreçlerin incelenmesine izin verir ve hastalık modellemesi için de uygulanabilir.

Genetik Modifikasyon için Primat Serebral Organoidlerinin Hedefe Yönelik Mikroenjeksiyonu ve Elektroporasyonu

Burada, genotip-fenotip bağımlılıklarını araştırmak ve glioblastoma tedavisi için potansiyel ilaçları taramak için laboratuvar mühendisliği glioblastoma organoidleri (LEGO) üretmek ve kullanmak için kapsamlı bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz.

Laboratuvar Mühendisliği: Glioblastoma Organoid Kültürü ve İlaç Taraması

Plasmonic cımbız ve fotonik kristal nanoyapıların optik yakalama mikro ve nano-parçacıklar verimlilik ve yönlendirme kontrolü yararlı geliştirmeler üretmek için gösterilmiştir.

Gelişmiş mikro ve Nanopartikül Manipülasyon Plasmonic ve Fotonik Kristal Nanoyapıların Kullanımı

Mikrovasküler ölçekli kanallar (&lt;30 um) ile bir mikroakışkan cihazın bütün iç yüzeyi boyunca kültürün 3B, endotel hücre mono tabakasında için bir yöntem tarif edilmiştir.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Keşfedin, insan nöral organoidleri oluşturma ve glioblastoma ile Parkinson hastalığını modelleme yöntemlerini. Pluripotent kök hücrelerden üç boyutlu organoid geliştirme protokollerini öğrenin.

Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler

Daha fazla video keşfet