Name: Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Öğrenin, kemirgen beyninde protein ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanmayı. Bu yöntem, AMPA/NMDA reseptör oranlarını ve bilişsel belirteçleri incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu raporda yapılan araştırmalar, NIGMS 'den (1P20GM103653) DK 'ya verilen bir hedef hibe tarafından finanse edildi.

Aşağıdaki protokol Delaware Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (IAUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol için yaklaşık 55 – 75 gün eski erkek Sprague Dawley fareler kullanıldı.
1. beyin ekstraksiyon ve doku hazırlama
<ol><li>Anestezi indüksiyon odasında isofluran ile sıçan artık ayak tutam bir yanıt sergiler kadar fare anestezize.</li>
	<li>Bir Giyotin kullanarak hızlı deplitasyon ile fareler feda.</li>
	<li>Kafatası arka ön ve kafatası üst açık deri kes.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde kafatası arka parçasını kaldırmak için rongeurs kullanın ve sonra küçük Diseksiyon makas kullanarak kafatası orta çizgi aşağı kesmek, beyin dokusu zarar görmesini önlemek için her zaman kafatası üst karşı yukarı iterek.</li>
	<li>Beyin ortaya çıkarmak için kafatasının yarısını sağ ve sol soyulmak için rongeurs kullanın.</li>
	<li>Beyin altında kepçe için küçük bir spatula kullanın ve sinirleri sever, dikkatle beyin yükseltmek ve kuru buz üzerinde soğutulmuş isopentane beyni dondurmak (en az-20 °C). Bundan sonra, beyin a-80 ° c dondurucuya kadar dilimleme kadar saklayın.</li>
	<li>-9 °C ve-12 °C arasında tutulan bir kriyostat içinde 30 – 50 μm ' lik ilgi bölgelerindeki beyni dilimleyin. Doğrudan cam slaytlar üzerine dilimleri monte ve a-80 °c buzluğu immünositokimya tahlil zamana kadar saklayın. Not: Bu protokolde beyin bölgelerinde Hippocampus ve amigdala vardı.</li>
</ol>2. tek Immünhistokimyasal reaksiyon
Not: Çift immünhistokimyasal reaksiyon için, protokol tek immünhistokimyasal reaksiyon ile aynıdır, ancak bu reaksiyon farklı konakların iki primer antikoruna sahiptir (örneğin, tavşan ve fare) ve karşılık gelen iki ikincil antikorlar tek bir konak (örneğin, keçi antirabbit ve keçi antimouse) olmalıdır. İkincil antikorlar da yüksek çözünürlüklü tarayıcılar mevcuttur iki farklı Spectra olması gerekir. Örneğin, 680 Nm 'de bir emisyon spektrumunun zirvesine sahip bir ikincil antikor ve bir ikincil antikor 800CW (780 nm 'de emisyon spektrumunun zirvesinde).
<ol><li>Dondurucudan cam slaytları çıkarın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.</li>
	<li>Bir duman kaputu altında, 0,1 M fosfat tampon tuzlu (PBS) Oda sıcaklığında 1 − 2 h için% 4 civarında formaldehite beyin dokusu düzeltin.</li>
	<li>0,1 M Tris tamponlu tuz (TBS) içinde 10 dakika boyunca üç kez durulayın. 30 − 60 dakika boyunca hafif bir deterjanla (örn.% 0,01 deterjan) slaytları inküten hücre membranlarını geçirgen.</li>
	<li>TBS 'deki slaytları her biri 15 dakika boyunca üç kez durulayın.</li>
	<li>Doğru konsantrasyon PBS ilgi protein için primer antikor seyreltilme. Örneğin, hemen erken gen c-fos algılamak için, 1:500 bir konsantrasyon bir tavşan primer Anti c-fos antikor hazırlayın.</li>
	<li>Doğrudan beyin dokusu üzerine pipet primer antikor çözeltisi (yaklaşık 200 μL başına 3 inç x 1 inç slayt).</li>
	<li>4 °C ' de oda sıcaklığında 1 − 2 saat ya da gece (~ 17 saat) için primer antikor seyreltme sırasında beyin dokusunu cam slaytlarda tutmak için kapak fişi kullanın.</li>
	<li>Her biri için dört kez (örneğin,% 0,01 deterjan, "TBS-T") eklenen küçük bir deterjan miktarı olan TBS 'de kapak kuponları ve yıkama kaydırakları çıkarın.</li>
	<li>2 h için oda sıcaklığında ikincil bir antikor içinde beyin bölümlerini kulkaymak için Cover, kullanın. Not: İkincil antikor, doğru seyreltme ve TBS, deterjan ve ana serumun% 1,5 ' ü içeren bir seyreltilme olmalıdır. Örneğin, 1:2000 ' in seyreltilmesi sırasında bir keçi ikincil antikor% 1,5 keçi serumu ve% 0,05 deterjan içerir.</li>
	<li>TBS-T ' y i her biri 20 dakika boyunca dört kez ve sonra TBS 'de 20 dakika boyunca dört kez durulayın.</li>
	<li>Karanlık bir gecede oda sıcaklığında kuru slaytlar. Slaytlar kuru olduğunda, görüntüleme için hazırdır.</li>
</ol>3. görüntüleme
<ol><li>Doku aşağı bakacak şekilde yakın kızılötesi tarama arayüzü üzerine slaytlar yerleştirin. Bir seçim aracını kullanarak bir defada bir cam slayt veya birden fazla slayt görüntü.</li>
	<li>0 Nm uzaklığı ve 21 μm çözünürlüğe sahip en yüksek kalitede ayarı kullanarak görüntü slaytları. Tarama genellikle kullanılan tarama ekipmanınıza bağlı olarak 13 − 19 h alacaktır.</li>
	<li>Görüntü analiz yazılımına (örn. ImageStudio) görüntüleri içe aktarın ve yarı nicel protein analizini görüntüleyin ve işaretleyin.</li>
</ol>4. protein Ifadesi Analizi
<ol><li>Görüntü analiz yazılımını açın ve görüntünün tarandığı çalışma alanını seçin.</li>
	<li>Taramayı görüntülemek için görüntü analiz yazılımında taranan görüntüyü açın ve Ham görüntüyü veya toplam nicelik emisyonu değiştirmeden gösterilen kontrast, parlaklık ve büyütme gibi hangi dalga boylarının görüntülendiği ayarlayın.</li>
	<li>Ölçüme yönelik anahtar bölgeleri tanımlayın ve sayfanın üst kısmındaki analiz sekmesini seçin, ardından dikdörtgen çizin (veya elipsi çizin/FreeHandçizin), nicelleştirilir alan üzerinde bir dikdörtgen çizin.</li>
	<li>Dikdörtgenin boyutunu görüntülemek için ekranın sol alt tarafındaki şekiller 'i seçin, ardından sağ alt tarafında sütunlar 'ı seçin. Şekil boyutunu tanımlamak için Yükseklik ve Genişlik sütunları ekleyin. Not: Ölçü miktarını karşılaştırırken şekil boyutunu kontrol etmek önemlidir. O bölge için emisyonların doğru bir şekilde örnekleme elde etmek için, istenilen miktarın içinde yer alan özdeş şekiller kullanılması önerilir.</li>
	<li>Sonra şekli adlandırın ve tekrarlayın. Tüm bölgeler örneklendikten sonra sütunlar sekmesinden kullanılabilen veriler toplanabilir ve analiz edilebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+Neural+Science%22">Principles of Neural Science</a>. , McGraw Hill. New York. (2013).</li>
<li>Byrne, J. H., Roberts, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aByrne%2C+JH+%22From+Molecules+to+Networks%3A+An+Introduction+to+Cellular+and+Molecular+Neuroscience%22">From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience</a>. , Academic Press/Elsevier. (2009).</li>
<li>Salami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2%2F3+binding+potential+modulates+neural+signatures+of+working+memory+in+a+load-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion.</a> Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+amygdaloid+corticotropin-releasing+hormone+%28CRH%29+mediate+anxiety-like+behaviors%3F+Dissociation+of+anxiogenic+effects+and+CRH+release%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).</li>
<li>English, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+mouse+hippocampus+profiled+by+LC-MS%2FMS+for+label-free+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation.</a> Data in Brief. 7, 341-343 (2016).</li>
<li>David, M. A., Tayebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein+aggregates+in+brain+and+cerebrospinal+fluid+derived+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients.</a> Frontiers in Neurology. 5, 251(2014).</li>
<li>Oliver, C., Jamur, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li>
<li>Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescent+cells+in+rat+brain+can+be+convincing+impostors+in+green+fluorescent+reporter+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-Jun+to+identify+fear+extinction+learning-specific+patterns+of+neural+activity+that+are+affected+by+single+prolonged+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Researach%22%5BJournal%5D)">Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress.</a> Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+via+which+single+prolonged+stress+exposure+leads+to+fear+extinction+retention+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits.</a> Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).</li>
<li>Eagle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+prolonged+stress+enhances+hippocampal+glucocorticoid+receptor+and+phosphorylated+protein+kinase+B+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels.</a> Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Bu makalede sunulan sonuçlar, yüksek çözünürlüklü tarama ile birlikte yakın kızılötesi immünsitokimya beyin dokusunda protein ifadesi yarı niceliksel önlemler elde etmek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Aynı beyin bölgesinde aynı anda iki proteini etiketlemek için de kullanılabilir. Daha önce birden fazla beyin bölgelerinde hemen erken gen ifadesi ölçmek için yakın kızılötesi immünhistokimya kullandık9,10. Hemen erken genler nöral aktivite ölçüsü olar...

Nörobilim çalışma beyin hücrelerin belirli fonksiyonları aracı nasıl bir soruşturma endişeleri1. Bu nasıl glia hücrelerinin merkezi sinir sisteminde dokunulmazlık görüşmek gibi doğada hücresel olabilir ya da dorsal hipokampus nöronların aktivitesinin mekansal navigasyon neden açıklamak amacı deneyler içerebilir. Geniş anlamda, hücresel fonksiyon, bir hücrede ifade edilen proteinler ve bu proteinlerin aktivitesi2ile belirlenir. Sonuç olarak, beyin hücrelerinde proteinlerin ifade ve/veya etkinliğini ölçmek Nörobilim çalışması için önemlidir.
Beyindeki protein ifadesini ölçmek için bir dizi teknik mevcuttur. Bu reseptör yoğunlukları için pozitron emisyon topografyası gibi in vivo yöntemleri içerir3 ve küçük peptitler için mikro-diyaliz4. Daha sık, ex vivo yöntemleri protein fonksiyonu ve ifade incelemek için kullanılır. Bunlar arasında kütle spektrometresi teknikleri5, Batı leke ve enzim bağlantılı İmmünosorbent tahlil (ELISA)6ve immünositokimya7yer aldı. İmmünositokimya Nörobilim alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu teknik, bir protein (veya antijen) ilgi (örn., c-fos) ve proteinli primer antikor kompleksi (Şekil 1) tespit etmek için konjonk ikincil antikor algılamak için birincil antikor kullanımını içerir. Protein-primer antikor-ikincil antikor kompleksinin algılanmasını sağlamak için, ikincil antikorlar, onlara konjuze edilen horserpu peroksidaz (HRP) gibi maddelere oksitleyici sahiptir. Bu ışık mikroskobu7kullanılarak tespit edilebilir hücrelerde çökeller oluşumu için izin verir. İkincil antikorlar da onlara (yani, fluorophores) conjuated kimyasallar floresan olabilir. Ne zaman bu kimyasallar uyarıcı protein-primer antikor-ikincil antikor kompleksleri7algılamak için kullanılabilir ışık, yayar. Son olarak, bazen primer antikorlar azalan ajanlar ve floresan kimyasallara bağlı olarak ikincil antikorlara olan ihtiyacını doğrudan ihmal ediyorlar7 (Şekil 1).
İlginçtir, birçok immünosittokimya yöntemleri beyin hücrelerinde proteinlerin görselleştirme için izin, ancak belirli bir hücre veya beyin bölgesinde protein miktarını ölçmek için yeteneği. Azaltma reaksiyonlarının çökmesini algılamak için ışık mikroskobu kullanarak nöronların ve glia görselleştirme için izin verir, ancak bu yöntem hücrelerde veya belirli bir beyin bölgesinde protein ifadesi ölçmek için kullanılamaz. Teorik olarak, fluoresan mikroskobu için kullanılabilir, çünkü floresan ikincil antikor yayılan ışık protein-primer antikor-ikincil antikor kompleksi bir ölçüsüdür. Ancak, beyin dokusunda otofloresans, beyin dokusunda protein ifadesini ölçmek için Floresan Mikroskobu kullanmak zor yapabilir8. Sonuç olarak, beyin dokusu floresan görüntülerden yayılan ışık nadiren beyinde protein ifadesi ölçmek için kullanılır.
Bu konuların çoğu yüksek çözünürlüklü tarama9,10ile birlikte yakın kızılötesi immünosittokimya kullanılarak ele alınabilir. Bu yazıda, yakın kızılötesi emisyon spektrumunda fluorophores ile birleşen immünositozin, yüksek çözünürlüklü tarama (örneğin, 10 – 21 μm) ile birleştirilip farklı beyin bölgeleri.

<table><tbody><tr><td>Beyin Ekstraksiyonu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anestezi İndüksiyon Odası</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-0530SM</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Giyotin</td><td>Harvard Aparatı</td><td>73-1920</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>16000-14</td><td>kafatasının arkasını çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Hassas Diseksiyon Makası</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-951-5</td><td>kafatasının orta hattı boyunca yukarı doğru kesmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikro Spatula</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-5</td><td>beyni çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Cam Mikroskop Slaytları</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-549-6</td><td></td></tr><tr><td>İmmünohistokimyasal Reaksiyon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Paraformaldehit içinde sabitlendikten sonra hücrelere nüfuz etmek için hafif bir deterjan olarak kullanılır, ayrıca konakçı serum ve ikincil antikor ile kombinasyon halinde hafif deterjan olarak kullanılır;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td> Primer antikor Licor Odyssey tarayıcı Licor Biotechnology Inc. <td>ile kayma slaytlarından sonra TBS-T'yi elde etmek için TBS&nbsp'ye eklenen az miktarda deterjan olarak kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntü</td><td>Stüdyosu Licor Biyoteknoloji A.Ş.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kemirgen beyninde protein ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Nörobilim, beyindeki hücrelerin çeşitli fonksiyonları nasıl Arabulmaya çalışışıdır. Hücresel fonksiyon hücre proteinlerinin bileşimi ve aktivitesi ile belirlendiği için nöronlar ve glia 'da protein ifadesinin ölçülmesi Nörobilim çalışması için önemlidir. Bu yazıda, immünosittokimya 'nın farklı beyin bölgelerinde yarı niceliksel bir protein ifadesi sağlamak için yakın kızılötesi yüksek çözünürlüklü taramayla nasıl birleştirildiğini açıklayacağız. Bu teknik aynı beyin bölgesinde tek veya çift protein ifadesi için kullanılabilir. Bu moda proteinleri ölçme deneysel manipülasyon ile protein ifadesinde göreceli bir değişiklik elde etmek için kullanılabilir, öğrenme ve bellek moleküler imza, moleküler yollardan aktivite, ve birden fazla beyin bölgelerinde nöral aktivite. Doğru proteinleri ve istatistiksel analizi kullanarak, beyin bölgeleri arasında fonksiyonel bağlantı da tespit edilebilir. İmmünosittokimya bir laboratuvarda uygulama kolaylığı göz önüne alındığında, yakın kızılötesi yüksek çözünürlüklü tarama ile immünsitokimya kullanarak bir sistem düzeyinde nörobiyolojik süreçleri incelemek için Nörobilim yeteneği genişletebilirsiniz.

İmmunhistokimya için yüksek çözünürlüklü tarama kullanmadan önce, bir protokol çalıştığını doğrulamak gerekir. Bu aynı hayvanın beyin bölümleri birincil ve ikincil antikorlar, ikincil antikor tek başına, ya da ne birincil ne de ikincil antikor ile inkübe bir doğrulama tahlil kullanılarak gerçekleştirilebilir. Böyle bir doğrulama tahlil sonuçları Şekil 2' de gösterilir. Bu reaksiyonda, dorsal hipokampus ve amigdala 'da hemen erken gen c-Jun tespit edildi. C-Ju...

Burada, İmmünohistokimya ve yüksek çözünürlüklü beyin bölgelerinin proteinleri için tarama ile birlikte yakın kızılötesi boyalar kullanan bir protokol sunuyoruz.

Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Bu protokol önemli çünkü aynı beyin bölgesindeki iki proteinin sayısallaştırılmasına olanak sağlar. Bu deneyci pan ve fosfoproteinler atayarak beyin bölgelerinde moleküler sinyal yolları aktivitesi bakmak için izin verir. Aynı zamanda farklı bilişsel olayların belirteçleri olan proteinleri taramak için kullanılabilir.Biz genellikle daha ilgili teknikler gerektiren soruları cevaplamak için, immünohistokimya gibi nispeten basit bir teknik kullanıyoruz. Moleküler sinyal yollarının aktivitesinin incelenmesi, AMPA/NMDA oranının incelenmesi de dahil. Eksi 9 santigrat derece ve eksi 12 santigrat derece arasında tutulan bir kriyostat kullanarak, dilim daha önce izole ve 30-50 mikrometre ilgi bölgelerinde dondurulmuş sıçan beyin.Doğrudan cam slaytlar üzerine dilim monte ve immünostochemistry kadar eksi 80 santigrat derece saklayın. Dondurucudan cam slaytları çıkarın ve 30 dakika oda sıcaklığına dengede bekleyin. Bir duman kaputu altında çalışma, doku fiksasyonu için oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca 0,1 molar PBS% 4 paraformaldehit slaytlar yerleştirin.Daha sonra slaytları 0,1 molar TBS'de her biri 10 dakika boyunca üç kez durulayın. Hücre zarlarını permeabilize etmek için, 30-60 dakika hafif bir deterjan slaytlar kuluçka. Ve her biri 15 dakika boyunca tbs üç kez tekrar durulayın.El yazmasında açıklandığı gibi pbs'ye ilgi çeken protein için primer antikorları doğru konsantrasyonda seyreltin. Pipet primer antikor solüsyonu doğrudan beyin dokusuna. Kapak kaymalarını kaydıraklara yerleştirin ve beyin dokusunu oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca primer antikor seyreltmede kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra kapak fişlerini çıkarın ve her biri 15 dakika boyunca dört kez dört kez, içine az miktarda deterjan eklenen TBS'de kaydırakları yıkayın. TBS, deterjan ve %1,5 oranında serum içeren bir seyreltmede sekonder antikor seyreltin. Slaytlara ikincil antikor ekleyin, kapak fişleri ile kaplayın ve iki saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, TBS-T'deki slaytları her biri 20 dakika boyunca dört kez, sonra tbs'de her biri 20 dakika boyunca dört kez durulayın. Slaytları bir gecede karanlıkta oda sıcaklığında kurutun. Aşağı bakan doku ile yakın kızılötesi tarama arayüzü üzerine slaytlar yerleştirin.Seçim aracını kullanarak aynı anda birden çok slayt görüntüleyin. 21 mikrometre çözünürlüğe sahip en yüksek kalite ayarını kullanarak slaytları görüntüleyin. Sıfır nanometre bir ofset olarak, görüntü analiz yazılımı içine görüntü analiz yazılımı içine görüntü almak görüntülemek ve yarı kanitatif protein analizi için işaretlemek.Görüntü analizi yazılımını açtıktan sonra, görüntünün tarandığı çalışma alanını seçin. Ardından, görüntüyü görüntülemek ve ham görüntüyü veya toplam sayısallaştırılmış emisyondeğiştirmeden gösterilen dalga boylarını, kontrastı, parlaklığı ve büyütmeyi ayarlamak için görüntü analizi yazılımındaki taranmış görüntüyü açın. Nicelikiçin önemli bölgeleri belirledikten sonra, sayfanın üst kısmındaki analiz sekmesini seçin ve ardından sayısallaştırılacak alanın üzerine dikdörtgen çizmek için dikdörtgen çizin.Dikdörtgen boyutunu görüntülemek için ekranın sol alt kısmındaki şekilleri seçin. Ardından sağ alttaki sütunları seçin. Ardından şekil boyutunu belirlemek için yükseklik ve genişlik sütunları ekleyin.Son olarak, şekli adlandırın ve yineleyin. Tüm bölgeler örnekledikten sonra, sütunlar sekmesinden elde edilen verilerin birleştirilmesi ve çözümlenmesi ile devam edin. Bu protokolün işe yaradığını doğrulamak için beyin bölümleri primer ve sekonder antikorlar, tek başına ikincil antikor veya ne primer ne de sekonder antikor ile kuluçkaya yatırıldı.Dorsal hipokampus ve amigdalada beyin dokusuna hem primer hem de sekonder antikorlar uygulandığında ani erken gen c-jun ekspresyonu saptanır. AMPA reseptörünün GluR1 alt birimi ve NMDA reseptörünün NR2A alt birimi amigdala çekirdeklerinde dışkı proteini tespitinde saptandı. Bu öğrenme ve bellek nörobiyolojik bir imza olan amigdala alt çekirdeklerinde AMPA NMDA reseptörlerinin oranı incelenmesine izin verdi.Ventral hipokampustaki yüksek çözünürlüklü taramalar sonucunda ortalama ve normalleştirilmiş protein ekspresyonu ölçütleri elde edilebildi. Görüntü analiz yazılımı kullanılarak, bir dikdörtgen ilgi bölgesine yerleştirilir ve şekil ışık ortalama yoğunluğu protein ifade ölçüsü olan florofor ifade, bir ölçü olarak kullanılmıştır. Normalleştirilmiş eğriyi elde etmek için, yüksek sinyal ifade eden bir bölge boyunca bir şekil yerleştirildi ve eğrinin altındaki bölgede düşük sinyal protein ifadesinin bir ölçüsü olarak kullanıldı.Bu prosedür ile en büyük mücadele bir antikor bulma ve çalıştığından emin olmaktır. Uygulama basittir. Benim tavsiyem ilk düzenli bir immünohistokimyasal işlem girişimi, daha sonra bu tekniği deneyin olacaktır.Her zaman önce bir doğrulama tonu gerçekleştirin. Hatırlanması gereken en önemli şey antikor seyreltme kontrol etmek ve doğru uygulandığından emin olmaktır. Bu adımlar olmadan, yordam başarısız olur.

using-near-infrared-fluorescence-high-resolution-scanning-to-measure

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada yarı kalın beyin dilimleri görüntü floresan işaretli hücrelerin hızlı ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Sabitleme, dilimleme, beyin dokusu ve optik temizleme standart epifluorescent veya konfokal görüntüleme, sağlam sinir dokusu içinde bireysel hücreleri ve nöral ağların görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

Bu video, belirli bir presinaptik proteinin dağılımını ölçmek için bir fare beyin diliminin immünofloresan boyamasını göstermektedir. İşlem, spesifik olmayan bölgelerin bloke edilmesini, hedef protein için birincil antikorların ve bir referans işaretleyicinin uygulanmasını, ardından ikincil antikor etiketlemesini ve nükleer karşı boyamayı içerir. Referans işaretleyici, tutarlı bir taban çizgisi sağlayarak doğru niceleme sağlar ve presinaptik proteinin dağılımı, konfokal mikroskopi kullanılarak...

İmmünofloresan Kullanarak Fare Beynindeki Bir Presinaptik Proteinin Dağılımının Ölçülmesi

Kaynak: Jolly, S., et.al. Fare Beyin Bölümlerinde Üç Genin Ekspresyonunun Tespiti için Çift Floresan In Situ Hibridizasyonunun İmmünoetiketleme ile Birleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2016). Bu video, fare beyni bölümlerindeki iki RNA hedefinin ekspresyonunu görselleştirmek için çift floresan in situ hibridizasyonun kullanımını göstermektedir. Protokol, floresein, izotiyosiyanat ve digoksijenenin ile etiketlenmiş problar kullanılarak RNA'nın sıralı tespitini ve ardından duyarlılığı artırmak için...

 Fare Beyin Bölümlerinde Gen Ekspresyonunu Tespit Etmek için Çift Floresan In Situ Hibridizasyon Yapılması

Source: Kimmelmann-Shultz, B., et. al. Kemirgen Beynindeki Protein İfadesini Ölçmek için Yakın Kızılötesi Floresan ve Yüksek Çözünürlüklü Tarama Kullanma. J. Vis. Exp. (2019) Bu video, protein ekspresyonunu ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama yöntemini göstermektedir kemirgen beyninde.

Yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanarak kemirgen beynindeki protein ekspresyonunun ölçülmesi 

Kaynak: Lacin, E., et al. Nörotransmiterlerin In Vivo'da Optik Tespiti için Hücre Tabanlı Nörotransmitter Floresan Mühendislik Raportörlerinin (CNiFER'ler) Yapımı. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, fare korteksine önceden enjekte edilmiş özel raportör hücreleri olan hücre bazlı nörotransmitter floresan mühendislik raportörleri (CNiFER'ler) kullanarak in vivo nörotransmitter salınımını görüntülemek için bir tekniği göstermektedir. İki fotonlu bir mikroskop altına yerleştirilen fare, floresan emisyonu...

Hücre Bazlı Nörotransmitter Floresan Mühendislik Raportörleri Kullanılarak Nörotransmitter Salınımının Görüntülenmesi

Bu protokolün amacı, hücre tipine özgü gen ekspresyonunun, epigenetik belirteçlerin ve/veya protein ekspresyonunun sonraki analizi için belirli nöral hücre tiplerini sıralamak için floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) tekniğini kullanmaktır.

Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Bu iletişim kuralı süper çözünürlük ışık mikroskobu birleştiriliyor ve elektron mikroskobu görüntüleri taramak Zebra balığı retina üzerinde hücre altı protein yerelleştirme sonuçları elde etmek için gerekli adımları açıklar.

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

Burada, bir sinaptik protein ayirt boyama kullanarak işaret protein, confocal mikroskobu ve bilgisayar tabanlı analiz göre dağılımını belirlemek için nicel bir yaklaşım açıklar.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

Bu protokol, kemirgen beynin farklı hücresel bölmeler içinde Ubiquitin-proteasome sistemi (UPS) etkinliğini verimli bir şekilde ölçmek için tasarlanmıştır. Kullanıcılar, aynı hayvanlarda nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonlar içinde çalışan UPS 'i inceleyebilir, bu karmaşık analizleri gerçekleştirmek için gereken zaman ve hayvan sayısını azaltır.

Subcellular Ubiquitin ölçümü-kemirgen beyinde proteasom aktivitesi

Kemirgenlerin ve insan deneklerin beyin dokularından alınan ex vivo biyolojik örneklerde aksin filamentlerinin nicelleştirilmesi için basit, zaman verimli ve yüksek verimli floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil rapor ediyoruz.

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

Öğrenin, kemirgen beyninde protein ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanmayı. Bu yöntem, AMPA/NMDA reseptör oranlarını ve bilişsel belirteçleri incelemeye olanak tanır.

Kemirgen beyninde protein Ifadesini ölçmek için yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanma

Daha fazla video keşfet