Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

RNA polimeraz ile transkripsiyon faktörlerinin (TFs) etkileşimleri genellikle PULLDOWN asder kullanılarak incelenmiştir. GrgA 'nın klamidiyal RNA polimeraz ile etkileşimini karakterize etmek için bir Biolayer Interferometri (BLı) teknolojisi uygulıyoruz. PULLDOWN analizlerine kıyasla, BLı gerçek zamanlı dernek ve dissociation algılar, daha yüksek hassasiyet sunar ve oldukça nicelidir.

Transkripsiyonda protein-protein etkileşimi geleneksel olarak Por diyalizi kullanılarak incelenmiştir. Ancak, Por diyaliz tamamen kantitatif vardır. Bu sorunun üstesinden gelmek için biyolayer interferometri veya BLI kullanıyoruz.

Por dan ile karşılaştırıldığında, BLI bağ ortakları arasında gerçek zamanlı ilişki ve ayrışma algılar. Ayrıca etkileşim mekanizmalarının göstergesi olan nicel kinetik parametreler ilerler. BLI teknolojisi korkutucu gelebilir, ama bu teknolojiyi kullanmak için öğrenmek zor değil, bir BLI aracı ve ilgili yazılım erişimi olması gerekir.

Bu video, BLI teknolojisine kolayca uyum sağlamanızı sağlayacaktır. Bir titrenin başlamasından yaklaşık 10 dakika önce, bir PCR tüpüne BLI tamponunun 200 mikrolitre pipeti. Eldivenli bir el kullanarak biyosensörün geniş kısmını tutarak orijinal ambalajından nikel NTA biyosensörçıkarın.

Biyosensörü PCR tüpünün üzerine yerleştirin, ki biyosensörün sadece cam ucu BLI tamponuna batırılır. Tam hidrasyon sağlamak için biyosensör ucunu en az 10 dakika su altında tutun. Blitz makinesini aç.

Makinenin arka daki USB veri çıkışı bağlantı noktası aracılığıyla makinenin bilgisayara bağlı olduğundan emin olun. Bilgisayarda, ilişkili yazılımı açın ve ekranın sol tarafındaki Gelişmiş Kinetik'e tıklayın. Yazılımda, her ilgili başlık altında deneme yle ilgili tüm uygun bilgileri yazın.

Biosensor Type'a tıklayın ve açılır menüden Nikel NTA'yı seçin. Her adımın süresi gerektiğinde varsayılandan değiştirilebilir. En iyi sonuçlar için başlangıç taban çizgisi ve taban çizgisi için en az 30 saniye, ilişkilendirme ve ayrışma için 120 saniye kullanın.

Sulu nikel NTA biyosensörünü PCR tüpünden çıkarın ve biyosensörün geniş kısmını montaja kaydırarak makinedeki biyosensör yuvasına yapıştırın. Makinenin tüp tutucusu içine 0,5 mililitrelik siyah mikrosantrifüj tüp ve içine BLI tampon 400 mikrolitre pipet yerleştirin. Biyosensör ucu mikrosantrifüj tüpünde tampon batırılmış olur gibi makinenin kapağını kapatın.

İlk taban çizgisini kaydetmeye başlamak için yazılımda İleri'yi tıklatın. İlk taban çizgisi adımı kaydı tamamladıktan sonra makinenin kapağını açın. Kaydırıcıyı sağa doğru hareket ettirin, çünkü bırakma tutucusu siyah okun önünde yer almaktadır.

Pipet dört mikrolitre diyaliz emzitli bir ligand damla tutucu üzerine ve otomatik olarak yükleme adımı kaydetmeye başlayacak makinenin kapağını kapatın. Yükleme adımı kaydı bittikten sonra makinenin kapağını açın. Kaydırıcıyı sola doğru hareket ettirin, örneğin tüp tutucu bir kez daha siyah okun önünde yer almaktadır.

Makinenin kapağını kapatın ve biyosensör ucunun tüp tutucudaki tüpün BLI tamponuna batırDığından emin olun. Makine ve yazılım otomatik olarak temel adımı kaydetmeye başlar. Temel adım kaydı tamamladıktan sonra makinenin kapağını açın.

Damla tutucuyu çıkarın ve herhangi bir proteini pipetleyerek ve toplam beş kez çift deiyonize suyla durulayarak temizleyin. Son yıkamadan sonra damla tutucuyüzeyini temizlemek için bir doku silme kullanın. Bırakma tutucuyu makineye geri değiştirin.

Makinedeki kaydırıcıyı sağa doğru hareket ettirin, çünkü bırakma tutucusu bir kez daha siyah okun önünde yer almaktadır. Pipet damla tutucu üzerine bir diyaliz analit dört mikrolitre ve otomatik olarak ilişkilendirme adımı kaydetmeye başlayacak makinenin kapağını kapatın. Ilişkilendirme adımı kaydı nı tamamladıktan sonra makinenin kapağını açın.

Makinedeki kaydırıcıyı sağa doğru hareket ettirin, böylece tüp tutucu bir kez daha siyah okun önünde yer aldı ve otomatik olarak ayrışma adımını kaydetmeye başlayacak olan makinenin kapağını kapatın. Dissosyasyon adımı kaydı nı tamamladıktan sonra, makinenin kapağını açın ve damla tutucuyu ve tüp tutucuyu çıkarın. Herhangi bir proteini temizlemek için her ikisini deiyonize suyla iyice durulayın.

Biyosensörü çıkarın ve güvenli bir şekilde atın. Farklı analit konsantrasyonları kullanarak aynı ligand analit çifti için bu adımları tekrarlayın. Tüm çalıştırmalar tamamlandıktan sonra, ekranın sol tarafındaki Dosya ve Kaydet Denemesini tıklatarak yazılımın verilerini kaydedin.

Verileri Çalıştır başlığı altında, Adım Düzeltme ve Montaj'ı bire bir seçin ve kinetik veriler oluşturmak için Analyze'ı tıklatın. Nicel verileri bir çalışma sayfasına ayıklamak ve grafikler oluşturmak için CSV'ye Dışa Aktar'ı tıklatın ve kaydedilen verileri CSV dosyası olarak kaydedin. Bir elektronik tablo yazılımı kullanarak CSV dosyasını açın.

Tam uzunlukta GrgA 288 amino asitten oluşur. Burada gösterildiği gibi, bir 28 amino asit orta bölge Sigma 28 doğrudan bağlar. Burada bir son terminal ilerlemiile etiketlenmiş orta bölge His-tag ligand olarak kullanılmıştır, ilk olarak bir nikel NTA biyosensör ucuna hareketsiz oldu.

Ligand bağlamadan 30 saniye önce başlayan ve son yıkamanın başlamasından iki dakika sonra sona eren üç farklı analit konsantrasyonuna sahip deneylerin kayıtları gösterilir. Ligand analit ilişkisinin ve ayrışmanın geliştirilmiş görselleştirilmesi, ilk iki aşamadaki değerlerin kaldırılması ve taban çizgisinin sıfırlanması sonrasında gösterilir. Bağlanmamış ve terminal Onun etiketli GrgA 138-165 biyosensör kapalı yıkandıktan sonra, analit ile gerçek zamanlı ilişki Sigma 28 eklenmesinden sonra kaydedildi.

Son olarak, gerçek zamanlı dissociation yıkama sonrasında kaydedildi. BLI tahlilleri önce, gliserol ligands ve analitler kaldırılır. BLI'nin metinde anlatıldığı gibi diyalizden hemen sonra yapılmasını öneririz.

Protein-protein etkileşimlerini BLI ile transkripsiyonda karakterize ettikten sonra, etkileşimin transkripsiyon başlatma, uzama ve sonlandırmayı nasıl etkilediği araştırılabilir.