Name: Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Öğrenin, transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini incelemek için biyolayer interferometri (BLI) yöntemini. Gerçek zamanlı veri ve nicel kinetik parametreler sunarak geleneksel yöntemlere üstünlük sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık Ulusal Enstitüleri (hibe # AI122034 ve AI140167) ve New Jersey Sağlık Vakfı (Grant # PC 20-18) tarafından desteklenmektedir.

1. proteinlerin hazırlanması
<ol><li>Bir diyaliz çantası kullanın (uygun bir cut-off boyutu ile) BLI olarak kullanılan her protein Dialyze için (hem onun tarafından etiketlenmiş ligand ve analit dahil) BLı tampon 1.000 hacimleri karşı (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, 4 °c ' ye ön soğutulmuş) 4 °C için 4 h. Not: BLı asder, ligand, biyosensördeki bağlayıcı siteleri doyuran konsantrasyonlarda ve analitin ligle reaksiyon gösteren molar konsantrasyonlarının bilinmesi için yüksek derecede arındırılmış olması gerekir. Onun-ve strep etiketli proteinlerin ifade ve arıtma metodolojileri burada kapsanmaz, ancak önceki yayınlarda14,15' te bulunabilir. Bu sistem ligand yüksek derecede arıtılmış formda olmasını gerektirmez, ancak test sırasında herhangi bir arabellek değişiklikleri neden beyaz ışık girişim desenleri vardiyaları en aza indirmek için BLI tampon bile saflaştırılmamış Ligleri Dialyze esastır.</li>
	<li>Taze BLı tampon geçiş ve başka bir 4 h için diyaliz devam.</li>
</ol>2. biyosensör hidrasyon ve tahlil ayarlama
<ol><li>Yaklaşık 10 dakika önce bir tahlil başlamadan, pipet 200 μL BLı tampon bir PCR tüp içine.</li>
	<li>Biyosensörün geniş kısmını eldiven ile tutarak orijinal ambalajından bir ni-NTA-biyosensör çıkarın.</li>
	<li>Biosensörün BLı tamponunun içinde sadece biyosensörün cam ucunun batacağı şekilde PCR-Tube üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Tam hidrasyon sağlamak için biyosensör ucunu en az 10 dakika boyunca alt edin.<ol>
<li>Ni-NTA-biosensörün cam ucunun, yukarıdaki adımda BLI tampondan başka bir şeye dokunmaz olduğunu doğrulayın. Not: Bu protokol bir nı-NTA-biosensor bir onun tarafından etiketlenmiş ligand ile birlikte kullanır. Gerekirse, bir sa-streptavidin-biyosensör bir biyotinlenmiş ligand ile birlikte kullanılabilir: (ı) hem ligand ve analit bir onun etiketi taşımak veya (II) hiçbiri yok.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BLItz makinesini açın.</li>
	<li>Makinenin bilgisayarın arkasındaki USB veri çıkış bağlantı noktası üzerinden bilgisayara bağlı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Bilgisayarda, ilişkili yazılımı (örn., BLItz Pro) açın ve ekranın sol tarafındaki Gelişmiş kinetiği tıklayın.</li>
	<li>Yazılım üzerinde, ilgili her başlık altında deneyle ilgili tüm uygun bilgileri (deneme adı, açıklama, örnek KIMLIĞI ve protein konsantrasyonu dahil) yazın.</li>
	<li>Biosensor türü tıklayın ve açılır menüden nı-NTA seçin.<ol>
<li>Çalıştır ayarları başlığının altında, çalkalayıcı 'nın Etkinleştirolarak ayarlandığını doğrulayın.</li>
		<li>Adım türü listesi başlığı altında 5 öğe listelendiğini doğrulayın: başlangıç temel, yükleme, temel, Ilişkilendirme ve dissociation. Not: her adımın süresi gerektiği gibi varsayılan olarak değiştirilebilir. En iyi sonuçlar için, başlangıç taban çizgisi ve taban çizgisi için en az 30 sn kullanın; ve 120 dernek ve dissociation için s. Yükleme adımının süresi (120 ila 240 s arasında değişen), ligand üzerindeki onun-epitope etiketinin ligand ve yakınlık konsantrasyonuna göre ni-NTA-biyosensörüne bağlıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hidralı ni-NTA-biyosensör ' i PCR tüpünden çıkarın ve biosensörün geniş kısmını montajın üzerine kaydırarak makinenin üzerindeki biyosensör montajına takın. Not: deney sırasında biyosensörün kurumasına izin vermeyin.</li>
	<li>0,5 mL 'Lik siyah mikrosantrifüjli tüpü makinenin tüp tutucusuna yerleştirin ve BLı tamponunun 400 μL pipet içine takın.</li>
	<li>Makinenin kaydırıcının, tüp tutucunun makinenin üzerindeki siyah okun önünde yer alan şekilde konumlandırıldığından emin olun.</li>
	<li>Mikrosantrifüjlü tüpteki tamponda biyosensör ucunun batacağı şekilde makinenin kapağını kapatın.</li>
	<li>Ilk taban çizgisini kaydetmeye başlamak için yazılım üzerinde İleri 'yi tıklatın.</li>
</ol>3. biyosensör üzerine ligand yükleme
<ol><li>Başlangıç taban çizgisi adımı kaydı tamamlandıktan sonra makinenin kapağını açın.</li>
	<li>Kaydırıcıyı sağa doğru taşıyın, böylece damla tutucu (tüp tutucu yerine) siyah okun önünde yer alır.</li>
	<li>Pipet 4 μL bir Medil onun tarafından etiketlenmiş ligand (adım 1,1) damla tutucu üzerine ve makinenin kapağını kapatın. Not: kullanılmak üzere ligand optimum konsantrasyon her protein için farklılık gösterebilir. 1,0 ila 2,0 mg/ml arasında bir konsantrasyon genellikle 240 s biyosensör ucunda NTA doyurmak için yeterlidir.</li>
	<li>Yazılım üzerinde, yüklemeye başlamak için İleri 'yi tıklatın.</li>
</ol>4. ek ligand yıkama
<ol><li>Yükleme adımı kaydı tamamlandıktan sonra makinenin kapağını açın.</li>
	<li>Tüp tutucu bir kez daha siyah ok önünde yer alır gibi kaydırıcıyı sola taşıyın.</li>
	<li>Makinenin kapağını kapatın ve biyosensör ucunun tüp tutucudan gelen tüpün BLı tamponunun içine batdığından emin olun.</li>
	<li>Temel kayıt başlatmak için yazılım üzerinde bir kez daha İleri ' yi tıklatın.</li>
</ol>5. dernek analit ligand için
<ol><li>Temel adım kaydı tamamlandıktan sonra makinenin kapağını açın.</li>
	<li>Damla tutucu çıkarın ve herhangi bir protein pipetleme ve çift deiyonize su ile durulama ile temizleyin (ddH2O) Toplam 5 kez.<ol>
<li>Yıkama sonra damla tutucu yüzeyini temizlemek için bir doku silmek kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Damla tutucuyu tekrar makineye yerleştirin.</li>
	<li>Makine üzerindeki kaydırıcıyı sağa doğru taşıyın, böylece damla tutucu bir kez daha siyah okun önünde yer alır.</li>
	<li>4 μL bir Medil analit pipet (adım 1,1) damla tutucu üzerine ve makinenin kapağını kapatın.</li>
	<li>Yazılım üzerinde, Ilişkilendirmeyi başlatmak için İleri 'yi tıklatın.</li>
</ol>6. ligand 'den analitin dağılma
<ol><li>Dernek adımı kaydı tamamladıktan sonra makinenin kapağını açın.</li>
	<li>Makinenin üzerindeki kaydırıcıyı sağa doğru hareket ettirin, böylece tüp tutucu bir kez daha siyah okun önünde yer alır.</li>
	<li>Yazılım üzerinde, dissociation başlamak için İleri ' yi tıklatın.</li>
	<li>Dissociation adım kayıt bittikten sonra, makinenin kapağını açın.</li>
	<li>Damla tutucuyu ve tüp tutucuyu çıkarın.</li>
	<li>Herhangi bir proteini yıkamak için ddH2O ile iyice durulayın.</li>
	<li>Biosensörü çıkarın ve güvenli bir şekilde atın.</li>
</ol>7. farklı konsantrasyonlarda etkileşimler tekrarlanan
<ol><li>Farklı analit konsantrasyonları kullanarak aynı ligand-analit çifti için 2-7 adımları yineleyin. Not: analitin konsantrasyonunun optimum sonuçlar elde etmeden önce birkaç çalıştırma boyunca ayarlanması gerekebilir. Deneyimimizde, 75 nM ile başlayan analit konsantrasyonlarının 1:5:10 oranı genellikle yeterlidir.</li>
</ol>8. yazılımı kullanarak verileri analiz etme
<ol><li>Tüm çalışır bittikten sonra, dosyayı tıklatarak yazılım verileri kaydedin ve sonra ekranın sol tarafında olarak deneme kaydedin .</li>
	<li>Veri Çalıştır başlığının altında adım düzeltmesi ve sığdırma (1:1) öğesini seçin ve kinetik veriler oluşturmak için analiz et 'i tıklatın.</li>
	<li>Nicel verileri bir çalışma sayfasına ayıklamak ve grafikler oluşturmak için CSV 'ye dışa aktar 'ı tıklatın ve kaydedilmiş verileri bir. csv dosyası olarak kaydedin. Elektronik tablo yazılımını kullanarak. csv dosyasını açın.<ol>
<li>Dernek ve dissociation kinetiği en etkili şekilde göstermek için, temel adımından önce tüm çizim noktalarını kaldırın ve sonraki tüm çizim noktalarını son taban çizgisi değerinden Normalleştir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Vvedenskaya, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+RNA+polymerase+and+the+core+recognition+element+are+a+determinant+of+transcription+start+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).</li>
<li>Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+sigma+factors%3A+a+historical%2C+structural%2C+and+genomic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).</li>
<li>Visweswariah, S. S., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+bacterial+transcription+factors%3A+how+proteins+take+on+new+tasks%2C+but+do+not+always+stop+doing+the+old+ones%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones.</a> Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).</li>
<li>Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trachoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Trachoma.</a> Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+incidence+and+prevalence+of+selected+curable+sexually+transmitted+infections%3A+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+and+Reproductive+Health+Matters%22%5BJournal%5D)">Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008.</a> Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).</li>
<li>Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+rate+of+persistence+and+respiratory+tract+symptoms+of+Chlamydia+pneumoniae+infection+in+1211+kindergarten+and+school+age+children%5BTitle%5D)+AND+%22The+Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children.</a> The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).</li>
<li>De Puysseleyr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+presence+and+zoonotic+transmission+of+Chlamydia+suis+in+a+pig+slaughterhouse%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).</li>
<li>Hulin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+preference+and+zoonotic+potential+of+Chlamydia+psittaci+and+C.+gallinacea+in+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry.</a> Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+of+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia.</a> Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).</li>
<li>Belland, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+transcriptional+profiling+of+the+developmental+cycle+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).</li>
<li>Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+stage-specific+gene+regulation+during+the+developmental+cycle+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).</li>
<li>Tan, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTan%2C+M+%22Intracellular+pathogens+I%3A+Chlamydiales%22">Intracellular pathogens I: Chlamydiales</a>. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).</li>
<li>Domman, D., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+Footsteps+of+Chlamydial+Gene+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).</li>
<li>Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+protein+GrgA+activates+transcription+by+contacting+the+nonconserved+region+of+%CF%8366%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).</li>
<li>Desai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+GrgA+in+regulation+of+%CF%8328-dependent+transcription+in+the+obligate+intracellular+bacterial+pathogen+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).</li>
<li>Joy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Detection+of+Biomolecular+Interactions+Using+BioLayer+Interferometry+for+Kinetic+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).</li>
<li>Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+and+its+use+in+biomolecular+interaction+analysis+%28BIA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA).</a> Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).</li>
<li>Nelson, R. W., Krone, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+surface+plasmon+resonance+biomolecular+interaction+analysis+mass+spectrometry+%28BIA%2FMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS).</a> Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).</li>
<li>Visentin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+non-specific+binding+to+measure+the+active+concentration+and+kinetics+of+serum+anti-HLA+antibodies+by+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance.</a> Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).</li>
<li>Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+surface+plasmon+resonance+and+waveguide-enhanced+glucose+biosensing+with+N-alkylaminated+polypyrrole%2Fglucose+oxidase+multilayers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).</li>
<li>Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Surface+Plasmon+Resonance+to+Quantitatively+Assess+Lipid-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).</li>
<li>Wang, D. S., Fan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Surface+Plasmon+Resonance+Sensors%3A+From+Principles+to+Point-of-Care+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications.</a> Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175(2016).</li>
<li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-layer+interferometry+for+measuring+kinetics+of+protein-protein+interactions+and+allosteric+ligand+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383(2014).</li>
<li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computer-Aided+Molecular+Design%22%5BJournal%5D)">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Protein-protein etkileşimleri transkripsiyon ve diğer biyolojik süreçlerin düzenlenmesi için çok önemlidir. En sık PULLDOWN öğrenimi ile incelenmiştir. PULLDOWN analizlerinin gerçekleştirmek nispeten kolay olmasına rağmen, onlar kötü niceliksel ve zayıf ama biyolojik olarak anlamlı etkileşimleri algılamak için başarısız olabilir. Karşılaştırıldığında, bir ligand ve bir analit arasında gerçek zamanlı dernek ve ayrışma tespit ederek, BLI ilişkilendirme ve ayrışma oranı sabitler, yanı sıra, genel benzeşimi sağlar.
<p cl...

DNA 'yı şablon olarak kullanan RNA molekülleri üreten transkripsiyon, Gen ifadesinin ilk adımıdır. RNA polimeraz (RNAP) holoenziminin bir hedef promotör1,2' ye bağlanması sonrasında bakteriyel RNA sentezi başlar. RNAP holoenzim (RNAPholo), organizatör sırasını tanımak için gerekli olan Multi-subunit katalitik çekirdeğinden (RNAPcore) ve σ faktörden oluşur. Transkripsiyon aktivizörleri ve baskıcılar, topluca TFs olarak adlandırılan, RNAPcore, σ faktörleri ve/veya DNA bağlayıcı bileşenleri ile gen ifadesi düzenler. Organizmaya bağlı olarak, genomunun önemli bir kısmı, fizyolojik ihtiyaçlara ve çevresel ipuçları3' e yanıt olarak transkripsiyon düzenleyen TFs 'ye tahsis edilebilir.
Klamidya insan ve hayvanların çeşitli hastalıklarından sorumlu bir zorunlu hücre içi bakterinin4,5,6,7,8. Örneğin, klamidya trachomatis tartışmasız insanlarda dünya çapında bir numaralı cinsel yolla bulaşan patojen ve bazı az gelişmiş ülkelerde körlük önde gelen nedeni4,5. Klamidya , temel vücut (EB) ve retikül vücut (RB)9olarak adlandırılan iki alternatif hücresel form ile karakterize benzersiz bir gelişim döngüsüne sahiptir. Ancak EBs, hücre dışı bir ortamda hayatta kalabiliyorlar, proliferasyon kabiliyetine sahip değiller. EBs, ana hücreleri endositoz yoluyla girip, ana sitoplazmada bir vakumda daha büyük RBs 'e, sonrası inokülasyon saatleri içinde ayırt ederler. Artık bulaşıcı değil, RBS ikili Fission ile çoğalırlar. Yaklaşık 20 h, onlar geri EBs ayırt etmeye başlar, hangi 30-70 civarında ana hücre çıkış h.
Klamidya gelişimsel döngüsünün ilerlemesi transkripsiyon ile düzenlenir. Yaklaşık 1.000 klamidya genlerinin bir büyük çoğunluğu, RBs 'nin aktif olarak çoğaldığı orta döngü sırasında ifade edilse de, sadece az sayıda gen, EBs 'nin girdinin ana hücrelerine girilmesinden hemen sonra dönüştürülmesini başlatmak için yazılmış EBs, RBs içine ve başka bir küçük genleri kümesi, KBS, EBs10,11farklılaşma sağlamak için transkripsiyonu veya giderek transkripsiyonu.
Klamidya genomu σ66, σ28 ve σ54gibi üç σ faktörü kodlıyor. E. coli ve diğer bakterilerin σ70 temizliği ile eşdeğer olan σ66, erken ve orta döngüdeki genlerin yanı sıra bazı geç genler ile ilgili promotörler tanınması nedeniyle, σ28 ve σ54 için gerekli olan Bazı geç genlerin transkripsiyonu. Çeşitli genlerin hem σ66bağlı promotör hem de σ28bağımlı Organizatör12' ye taşınması bilinmektedir.
Karmaşık bir gelişimsel döngüye rağmen, Chlamydiales13' te yalnızca az sayıda TFs bulunmuştur. GrgA (önceden varsayımsal bir protein CT504 c. trachomatis serovar D ve CTL0766 c. trachomatis L2) olarak açıklamalı bir klamidyaözgü TF başlangıçta σ66-bağımlı genler14aktivatörü olarak kabul edilir. Benzeşimi PULLDOWN deneyleri Grga hem σ66 ve DNA bağlayarak kendi transkripsiyon aktive gösterdiğini göstermiştir. İlginç bir şekilde, daha sonra bu GrgA ile σ28ile birlikte çökerek bulundu ve σ28' den bağımlı promotörler in vitro15' ten transkripsiyon aktifleştirir. GrgA 'nın σ66 ve σ28için benzer veya farklı benzerlikleri olup olmadığını araştırmak için Bli 'yi kullanmaya başvurdular. BLı asder, GrgA 'nın σ66 ile bir 30 kat daha yüksek benzeşte σ28Ile etkileşiminin, grga 'nın σ66bağımlı transkripsiyon ve σ28bağımlı transkripsiyon içinde diferansiyel roller oynayabilir olduğunu göstermiştir 15 yaşında.
BLI bir biyosensör ucunda immobilize protein katmanından yansıtan beyaz ışık girişim deseni algılar ve bir iç referans katmanı16karşılaştırır. Bu iki girişim deseninin analizi sayesinde BLı, biyosensörün ucuna bağlı protein miktarı hakkında değerli ve gerçek zamanlı bilgiler sağlayabilir. Biyosensör ucunu immobilize protein ligand olarak adlandırılır ve genellikle ortak bir antikor veya epitopu etiketi yardımıyla immobilize (örneğin, bir Poly-onun-veya biotin-Tag) bir ilişkili parçacık için bir yakınlık vardır (gibi NTA veya Streptavidin) biosensor ucunda. Biyosensörün ucunda ligand ile analit olarak adlandırılan ikincil bir proteinin bağlanması, biosensörlerin opaklığındaki değişimlere neden olur ve bu nedenle girişim desenlerinin değişikliklerine neden olur. Analitin farklı konsantrasyonlarda tekrarlandığında, BLI sadece nitel değil, aynı zamanda ligand ve analit16arasındaki yakınlık hakkında niceliksel bilgiler sağlayabilir.
Bilgimizin en iyisi, biz transkripsiyon15protein-protein etkileşimlerini karakterize etmek için BLI istihdam ilk oldu. Bu yayında, daha önce σ28bağlayıcı için gerekli olduğu gösterilmiştir bir Grga parçası, gerçekten bağlayıcı aracılık gösterir. Bu yazıda BLı 'nin adımları ve bağlayıcı kinetiklerin BLı grafikleri ve parametreleri oluşturulması üzerinde duruluyor. Ligin ve analitlerin üretim (ve arıtma) yöntemleri burada kapsamındadır.

<table><tbody><tr><td>BLItz makinesi</td><td>ForteBio</td><td>45-5000</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü selüloz membran</td><td>MilliporeSigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>Daldırma ve Okuma Ni-NTA biyosensör tepsisi</td><td>ForteBio</td><td>18-5101</td><td>Poly-His etiketli Proteinler için kullanıma hazır Ni-NTA biyosensörler</td></tr><tr><td>Damla tutucu</td><td>ForteBio</td><td>45-5004</td><td></td></tr><tr><td>PCR tüpleri (0.2 mL)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td></td>CLS6571</tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri (siyah)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-391-166</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MilliporeSigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MilliporeSigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AltınBio</td><td>T095100</td><td></td></tr></tbody></table>

transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini incelemek için biolayer interferometri (blı) uygulaması

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Transkripsiyon faktörü (TF), RNA polimeraz, başka bir TF ve/veya şablon DNA 'Sı ile etkileşime girerek gen ifadesini düzenleyen bir proteindir. Grga, özellikle zorunlu hücre içi bakteriyel patojen klamidya 'da bulunan yeni bir transkripsiyon aktivatörü. Benzeşme boncukları kullanarak protein PULLDOWN asdiyor GrgA iki σ faktörleri bağlar ortaya çıktı, yani σ66 ve σ28, hangi ürünleri farklılaşarak gelişimsel aşamalarında gerekli genler için organizatörler farklı setleri tanımak. Biz onaylamak ve daha fazla etkileşimleri karakterize BLı kullandık. BLI PULLDOWN üzerinde çeşitli avantajları gösterir: 1) bu bağlama ortakları arasında gerçek zamanlı dernek ve ayrışma ortaya çıkarır, 2) bu nicel kinetik parametreler üretir Bu özellikler, Chlamydia'daki gen ifade yönetmeliğinde Grga 'nın fizyolojik rollerini ve olası detaylı etkileşim mekanizmalarını anlamak için bize olanak sağladı. Biz bu nispeten ekonomik teknoloji son derece transkripsiyon ve diğer biyolojik süreçler eğitim için yararlı olabilir hayal.

BLı sayesinde, daha önce σ28 ' e Grga bağlanması, Grga15' in 28 amino asit orta bölgesine (kalıntıları 138-165) bağlı olduğunu tespit ettik. Buna göre, N-Terminally onun etiketli tam uzunlukta Grga (NH-Grga), bu bölge (NH-grgaδ 138-165) eksik bir Grga silme yapı ile karşılaştırıldığında bir azalan dernek oranı ve artan ayrışma oranı, genel bir 3.000.000-kat kaybına yol benzeşimi (Tablo 1). Burada, bu Orta bölgenin doğrudan σ28 ' i Grga proteininin yokluğunda ...

RNA polimeraz ile transkripsiyon faktörlerinin (TFs) etkileşimleri genellikle PULLDOWN asder kullanılarak incelenmiştir. GrgA 'nın klamidiyal RNA polimeraz ile etkileşimini karakterize etmek için bir Biolayer Interferometri (BLı) teknolojisi uygulıyoruz. PULLDOWN analizlerine kıyasla, BLı gerçek zamanlı dernek ve dissociation algılar, daha yüksek hassasiyet sunar ve oldukça nicelidir.

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Transkripsiyonda protein-protein etkileşimi geleneksel olarak Por diyalizi kullanılarak incelenmiştir. Ancak, Por diyaliz tamamen kantitatif vardır. Bu sorunun üstesinden gelmek için biyolayer interferometri veya BLI kullanıyoruz.Por dan ile karşılaştırıldığında, BLI bağ ortakları arasında gerçek zamanlı ilişki ve ayrışma algılar. Ayrıca etkileşim mekanizmalarının göstergesi olan nicel kinetik parametreler ilerler. BLI teknolojisi korkutucu gelebilir, ama bu teknolojiyi kullanmak için öğrenmek zor değil, bir BLI aracı ve ilgili yazılım erişimi olması gerekir.Bu video, BLI teknolojisine kolayca uyum sağlamanızı sağlayacaktır. Bir titrenin başlamasından yaklaşık 10 dakika önce, bir PCR tüpüne BLI tamponunun 200 mikrolitre pipeti. Eldivenli bir el kullanarak biyosensörün geniş kısmını tutarak orijinal ambalajından nikel NTA biyosensörçıkarın.Biyosensörü PCR tüpünün üzerine yerleştirin, ki biyosensörün sadece cam ucu BLI tamponuna batırılır. Tam hidrasyon sağlamak için biyosensör ucunu en az 10 dakika su altında tutun. Blitz makinesini aç.Makinenin arka daki USB veri çıkışı bağlantı noktası aracılığıyla makinenin bilgisayara bağlı olduğundan emin olun. Bilgisayarda, ilişkili yazılımı açın ve ekranın sol tarafındaki Gelişmiş Kinetik'e tıklayın. Yazılımda, her ilgili başlık altında deneme yle ilgili tüm uygun bilgileri yazın.Biosensor Type'a tıklayın ve açılır menüden Nikel NTA'yı seçin. Her adımın süresi gerektiğinde varsayılandan değiştirilebilir. En iyi sonuçlar için başlangıç taban çizgisi ve taban çizgisi için en az 30 saniye, ilişkilendirme ve ayrışma için 120 saniye kullanın.Sulu nikel NTA biyosensörünü PCR tüpünden çıkarın ve biyosensörün geniş kısmını montaja kaydırarak makinedeki biyosensör yuvasına yapıştırın. Makinenin tüp tutucusu içine 0,5 mililitrelik siyah mikrosantrifüj tüp ve içine BLI tampon 400 mikrolitre pipet yerleştirin. Biyosensör ucu mikrosantrifüj tüpünde tampon batırılmış olur gibi makinenin kapağını kapatın.İlk taban çizgisini kaydetmeye başlamak için yazılımda İleri'yi tıklatın. İlk taban çizgisi adımı kaydı tamamladıktan sonra makinenin kapağını açın. Kaydırıcıyı sağa doğru hareket ettirin, çünkü bırakma tutucusu siyah okun önünde yer almaktadır.Pipet dört mikrolitre diyaliz emzitli bir ligand damla tutucu üzerine ve otomatik olarak yükleme adımı kaydetmeye başlayacak makinenin kapağını kapatın. Yükleme adımı kaydı bittikten sonra makinenin kapağını açın. Kaydırıcıyı sola doğru hareket ettirin, örneğin tüp tutucu bir kez daha siyah okun önünde yer almaktadır.Makinenin kapağını kapatın ve biyosensör ucunun tüp tutucudaki tüpün BLI tamponuna batırDığından emin olun. Makine ve yazılım otomatik olarak temel adımı kaydetmeye başlar. Temel adım kaydı tamamladıktan sonra makinenin kapağını açın.Damla tutucuyu çıkarın ve herhangi bir proteini pipetleyerek ve toplam beş kez çift deiyonize suyla durulayarak temizleyin. Son yıkamadan sonra damla tutucuyüzeyini temizlemek için bir doku silme kullanın. Bırakma tutucuyu makineye geri değiştirin.Makinedeki kaydırıcıyı sağa doğru hareket ettirin, çünkü bırakma tutucusu bir kez daha siyah okun önünde yer almaktadır. Pipet damla tutucu üzerine bir diyaliz analit dört mikrolitre ve otomatik olarak ilişkilendirme adımı kaydetmeye başlayacak makinenin kapağını kapatın. Ilişkilendirme adımı kaydı nı tamamladıktan sonra makinenin kapağını açın.Makinedeki kaydırıcıyı sağa doğru hareket ettirin, böylece tüp tutucu bir kez daha siyah okun önünde yer aldı ve otomatik olarak ayrışma adımını kaydetmeye başlayacak olan makinenin kapağını kapatın. Dissosyasyon adımı kaydı nı tamamladıktan sonra, makinenin kapağını açın ve damla tutucuyu ve tüp tutucuyu çıkarın. Herhangi bir proteini temizlemek için her ikisini deiyonize suyla iyice durulayın.Biyosensörü çıkarın ve güvenli bir şekilde atın. Farklı analit konsantrasyonları kullanarak aynı ligand analit çifti için bu adımları tekrarlayın. Tüm çalıştırmalar tamamlandıktan sonra, ekranın sol tarafındaki Dosya ve Kaydet Denemesini tıklatarak yazılımın verilerini kaydedin.Verileri Çalıştır başlığı altında, Adım Düzeltme ve Montaj'ı bire bir seçin ve kinetik veriler oluşturmak için Analyze'ı tıklatın. Nicel verileri bir çalışma sayfasına ayıklamak ve grafikler oluşturmak için CSV'ye Dışa Aktar'ı tıklatın ve kaydedilen verileri CSV dosyası olarak kaydedin. Bir elektronik tablo yazılımı kullanarak CSV dosyasını açın.Tam uzunlukta GrgA 288 amino asitten oluşur. Burada gösterildiği gibi, bir 28 amino asit orta bölge Sigma 28 doğrudan bağlar. Burada bir son terminal ilerlemiile etiketlenmiş orta bölge His-tag ligand olarak kullanılmıştır, ilk olarak bir nikel NTA biyosensör ucuna hareketsiz oldu.Ligand bağlamadan 30 saniye önce başlayan ve son yıkamanın başlamasından iki dakika sonra sona eren üç farklı analit konsantrasyonuna sahip deneylerin kayıtları gösterilir. Ligand analit ilişkisinin ve ayrışmanın geliştirilmiş görselleştirilmesi, ilk iki aşamadaki değerlerin kaldırılması ve taban çizgisinin sıfırlanması sonrasında gösterilir. Bağlanmamış ve terminal Onun etiketli GrgA 138-165 biyosensör kapalı yıkandıktan sonra, analit ile gerçek zamanlı ilişki Sigma 28 eklenmesinden sonra kaydedildi.Son olarak, gerçek zamanlı dissociation yıkama sonrasında kaydedildi. BLI tahlilleri önce, gliserol ligands ve analitler kaldırılır. BLI'nin metinde anlatıldığı gibi diyalizden hemen sonra yapılmasını öneririz.Protein-protein etkileşimlerini BLI ile transkripsiyonda karakterize ettikten sonra, etkileşimin transkripsiyon başlatma, uzama ve sonlandırmayı nasıl etkilediği araştırılabilir.

application-biolayer-interferometry-bli-for-studying-protein-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, ligandlar ve hedef analitler arasındaki moleküller arası etkileşimleri gerçek zamanlı olarak tespit etmek için biyokatman interferometrisi (BLI) teknolojisini gösteriyoruz. BLI, çözelti içindeki analitlerle etkileşime girerken bir biyosensör yüzeyi üzerindeki hareketsizleştirilmiş ligandlardan oluşan bir tabakadan yansıyan beyaz ışığın girişim modelindeki değişiklikleri ölçer.

Ligand ve Analit Arasındaki Etkileşimleri Tespit Etmek için Biyokatman İnterferometri Teknolojisi

Burada protokolleri Bio-tabaka interferometrisi ile protein-protein etkileşimleri kinetik analizleri tarif eder. Hücresel enerji metabolizmasında yer alır F tipi ATP sintaz, bakteriler kendi ε alt birimi ile inhibe edilebilir. Biz, ε inhibitör C-terminal alanı ile katalitik kompleksinin etkileşimleri incelemek için Bio-tabaka interferometre adapte edilmiştir.

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

İletişim kuralı küçük molekül lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) ile arıtılmış hEAG1 iyon kanal protein etkileşimleri açıklar. Ölçüm BLI roman küçük molekül iyon kanal ligand tarama için potansiyel bir yöntem olabilir gösterir.

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Burada, memeli hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinlerin (RRB) RNA hedeflerini belirlemek için FLAG-biotin tandem saflaştırma ile FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq protokolü salıyoruz.

Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme

Bu makale, streptavidin bazlı bir biyokatman interferometrisi (BLI) sistemi kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemek için bir protokolü açıklamaktadır. Etkileşimin denge bağlanma afinitesini(KD) belirlemek için temel veya ileri bağlanma kinetiğini kullanmak için temel adımları ve hususları ana hatlarıyla belirtir.

DNA-Protein Etkileşimlerinin Streptavidin Tabanlı Biyotabaka İnterferometrisi ile İncelenmesi

Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD'ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Protokol tarafından enzimatik alkalin hidroliz keratin hidrolizat tavuk tüyleri üzerinden hazırlamak için ve keratin hidrolizat içine bir kozmetik merhem temel cilt bariyer fonksiyonunu artırır ekleme olup olmadığını sınamak için hedeftir (hidrasyon heightening ve «««azalan) transepidermal su kaybı. Erkek ve kadın üzerinde testler yapılır gönüllüler.

Keratin hidrolizat tavuk tüyleri ve kozmetik kendi uygulamasında hazırlanması

Öğrenin, transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini incelemek için biyolayer interferometri (BLI) yöntemini. Gerçek zamanlı veri ve nicel kinetik parametreler sunarak geleneksel yöntemlere üstünlük sağlar.

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

Daha fazla video keşfet