Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma

Bu protokol, parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde kullanılabilecek nöral kök hücrelere kan ve mononükleer hücreleri yeniden programlamak için bir yöntem açıklar. Bu nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmek için bir otolog hücre kaynağı sunuyor. Ayrıca, indüklenen nöral kök hücrelere dönüşüm ve istenilen hücre tiplerine farklılaşma için gerekli zaman dilimi indüklenen pluripotent kök hücreleriçin daha kısadır.

İndüklenen nöral kök hücreler iyi bir proliferatif kapasiteye sahiptir ve uygulamadan önce ölçeklendirilebilir. INSCs farklı bölgeye özgü nöral hücrelere belirtilebilir yana, spinal kord nöronlar veya motor nöronlar gibi, Bu yöntem diğer nörolojik hastalıkların tedavisi için uzatılabilir. Tüm yordam, ilgili ve kritik tüm adımlar ile uzun bir zaman alır, bu yüzden görsel gösteri hücrelerin nasıl göründüğü hakkında bir fikir verir ve istenen hücrelerin başarılı bir nesil sağlamak için bazı ipuçları sağlar.

Başlamak için, 50 mililitrelik konik tüp içine daha önce izole periferik venöz kan transferi, ve steril Dulbecco PBS eşit hacimli seyreltmek. Başka bir 50 mililitrekonik tüp, sterilize yoğunluk gradyan orta 15 mililitre hazırlamak. Tüpü 45 derecelik bir açıyla yatırın ve yoğunluk gradyan ortamının üzerine 30 mililitre seyreltilmiş periferik kan yavaşça ve dikkatlice yerleştirin.

Tüpü 800 kez g'de oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüj edin ve kapalı konumda ki santrifüj freni ayarlayın. Sarı, üst plazma tabakasıaspire ve atın. Mononükleer hücreler içeren beyaz, bulutlu ince film tabakasını 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.

MNC'ler ile tüpe 30 mililitre D-PBS ekleyin ve 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 600 kez g santrifüj. Supernatant attıktan sonra, D-PBS 45 mililitre ekleyin ve hücreleri askıya. 400 kez g dört santigrat derece de 10 dakika boyunca tüp santrifüj sonra, supernatant atın.

D-PBS beş mililitre ile hücreleri yeniden askıya, trypan mavi dışlama yöntemi ile canlı hücreleri saymak, genişleme için gerekli MNCs bir kenara koymak ve gelecekteki kullanım için kalan hücreleri dondurmak. Gün eksi 14, tohum MNCs mililitre başına mililitre başına 2-3 milyon hücre yoğunluğunda altı iyi plaka 1.5 mililitre ile 37 derece santigrat mililitre, önceden ısıtılmış MNC orta. 37 santigrat derecede kuluçkaya yat, iki gün boyunca %5 karbondioksit.

Gün eksi 11, orta hücreleri toplamak ve yeni bir 15 mililitrekonik tüp transfer sterilize pipet kullanın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 kez g'de santrifüj yapın, süpernatant'ı atın ve önceden ısıtılmış bir Mililitre MNC ortamında hücreleri yeniden askıya alın. Trypan mavisi ile canlı hücreleri sayarak sonra, altı kuyulu bir plaka içinde önceden ısıtılmış MNC ortamda mililitre başına bir milyon hücre yoğunluğunda MNC tohum.

37 santigrat derece, üç gün boyunca% 5 karbondioksit, kuluçka ve gün eksi sekiz ve eksi dört MNC ortamda hücre toplama, santrifüj ve kaplama tekrarlayın. Bu işlemde Sendai virüsü tehlikelidir ve Sendai virüsü içeren tüm prosedürler bir güvenlik kabininde yapılmalıdır. Ve tüm ipuçları ve tüpler Sendai virüsü maruz kalmadan önce etanol veya çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir.

Gün sıfır, MNC orta hücreleri toplamak ve 15 mililitrelik konik tüp aktarın. Hücreleri 200 kez g'de beş dakika santrifüj ettikten sonra, süpernatantı aspire edin ve bir mililitre önceden ısıtılmış MNC ortamı ile hücreleri yeniden askıya alın. Trypan mavisi ile canlı hücreleri sayın ve daha sonra önceden ısıtılmış MNC orta ile 200, 24-iyi plakalar kuyu başına 000 hücre konsantrasyonu onları yeniden askıya.

37 derecelik santigrat su banyosunda Sendai virüsü içeren eksi 80 derecelik santigrat deposundan çıkarılan tüpleri 5 ila 10 saniye eritin ve oda sıcaklığında erimeye bırakın. Çözüldükten sonra, hemen buza yerleştirin. 10 enfeksiyon çokluğu ile MNCs ile 24-iyi plaka kuyularına çözülmüş Sendai virüs ekleyin.

Hücrelerin bağlanmasını kolaylaştırmak için, plakaları 1,000 kez g'de 30 dakika santrifüj edin ve bundan sonra plakaları 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ile kuvöze yerleştirin. İlk gün, 15 mililitrelik bir santrifüj tüp orta ile hücreleri aktarın. Kalan hücreleri daha fazla ayırmak için, kuyu başına bir mililitre MNC orta ile kuyuları durulayın ve tüporta ile hücreleri ekleyin.

Hücre süspansiyonuna 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj edildikten sonra, süpernatantı aspire edin, 500 mikrolitre taze önceden ısıtılmış MNC ortamı yla hücreleri yeniden askıya alın ve 24 kuyulu bir plaka kuyusuna ekleyin. İkinci gün, d-PBS'de mikrolitre poli-D-lizin başına daha önce seyreltilmiş 50 mikrogram başına bir mililitre kullanın ve oda sıcaklığında en az iki saat boyunca altı kuyulu plakaları kaplayın. Altı kuyulu plakalardan poli-D-lizin aspire edin ve dikey temiz tezgahta yaklaşık 10 dakika kurulayın.

Sonra altı kuyu plakaları için mililitre laminin başına daha önce seyreltilmiş beş mikrogram kuyu başına bir mililitre ekleyin ve kat 37 derece santigrat dört ila altı saat kuluçka. Kullanmadan önce plakaları D-PBS ile yıkayın. Üçüncü gün, poli-D-lizin/laminin kaplı altı kuyulu plakalar üzerinde indüklenen nöral kök hücre orta tüm Sendai virüs transdüktülen MNCs plaka.

Beş ve yedi gün, yavaşça 37 derece santigrat bir mililitre ekleyin, altı iyi plakalar her iyi için önceden ısıtılmış iNSC orta. Dokuzuncu günden 28. iNSC kolonilerinin ortaya çıkışını izleyin ve yaklaşık iki ila üç hafta içinde yanmış cam pipetler kullanarak uygun morfolojiye sahip kolonileri seçin ve her kolonu genişlemek için altı kuyulu bir plakanın ayrı bir kuyuya aktarın.

Tek taraflı 6-hyroxydopamin-lezyonlu fare modelleri kurmak için, anestezi, yetişkin, erkek, SCID-bej fare başkanı tıraş ve eritromisin göz merhemi uygulamak. Fareyi stereotaksik aygıtın üzerine yerleştirin ve fareyi kesici çubuklarla düzeltin. Fare kafasını güvenli ve uygun bir şekilde konumlandırmak için kulak kaplarını doğru şekilde takın.

Povito iyot ve izopropil alkol ile baş sterilize, ve sonra kafa derisi üzerinde yaklaşık 1,5 santimetre sagittal kesi yapmak için bir neşter bıçak kullanın, kafatası açığa. Kesici çubuğu ve kulak çubuklarını ayarlayarak bregma ve lambda arasındaki yükseklik farkını 0,1 milimetrenin daha azına indirin. Mikroşinga iğnesinin ucunu bregma'ya doğru yavaşça hareket ettirin ve indirin ve bregma'yı sıfır noktası olarak değerlendirin.

Ucu ön koordinatları 0,5 milimetre ve lateral 2,1 milimetre bregma göre bir konuma taşıyın. Ucu geri çek, noktayı bir kalemle işaretle işaretle ve elektronik bir matkapla kafatasına küçük bir delik aç. Mikroşinga içine mililitre 6-hyroxydopamin çözeltisi başına beş mikrogram iki mikrolitre ayıklayın.

İğneyi işaretli noktaya geri döndürün ve iğneyi 3,2 milimetre dorsal/ventral'a takın. Dakikada bir mikrolitre hızında şırıngadan 6-hyroxydopamin çözeltisi enjekte, başka bir beş dakika için yerinde enjeksiyon iğne bırakın, ve sonra yavaş yavaş geri çekin. Kesiyi dikişlerle kapattıktan sonra, eritromisin göz merhemini tekrar gözlere uygulayın.

Fareyi stereotaksik cihazdan çıkarın, kurtarma kafesine koyun ve bilincini geri kazanana kadar yiyecek ve suya erişime izin verin. PBMNC'ler SeV ile enfekte olduktan sonra morfolojileri değişiyordu ve hücreler beşinci güne kadar şiddetli bir şekilde öldüler. INSC kolonileri 12.

Bir dizi pasaj için genişleme için iNSC klonlarını seçip aktardıktan sonra, iyi bir morfoloji gösterdiler ve iNSC ortamında, ya tek katmanlı bir biçimde ya da küre olarak kendini yenileyebildiler. 24 günlük farklılaşmadan sonra, iNSC'ler dopaminerjik nöronlar olarak tanımlandı ve bunların çoğu tirozin hidroksilaz, forkhead kutusu A2 ve nörona özgü sınıf III beta-tubulin belirteçleri olarak tanımlandı. Tek taraflı 6-hyroxydopamin-lezyonlu Parkinson hastalığı fare modelleri kurulduktan sonra, Parkinson hastalığı belirtilerini tahmin etmek için davranışsal değerlendirme yapıldı.

Hücre nakli yapılan fareler motor fonksiyonlarında önemli bir iyileşme gösterdi. 6-hyroxydopamin indüklenen lezyon derecesi striatum TH için post-mortem immünfloresan boyama ile doğrulandı, medial ön beyin demeti, ve substantia nigra pars compacta. TH-pozitif sinyaller büyük ölçüde hücrelerin implante edildi ve aynı zamanda hafif SN kurtarıldı striatum kurtarıldı. Transplantasyondan üç ay sonra, hayatta kalan hücreler arasında yaklaşık %13.84'ü TH-pozitif dopaminerjik nöronlardı.

TH pozitif hücrelerin yaklaşık %91,72'si yetim nükleer reseptörü, yaklaşık %86,76'sı FOXA2'yi ifade etti ve yaklaşık %98,77'si G-protein-çiftleşen içe dönük düzeltici potasyum ile birlikte etiketlendi. Yoğunluk gradyan ortamının üzerine 30 mil sulandırılmış periferik kan döşeyirken, lütfen degrade arabirimini bozmamak için yavaşça ve dikkatlice yapın. Yüksek bir virüs aktivitesi sağlamak için Sendai virüsünün tekrar tekrar çözülmesini ve dondurulmasını önlemeye özen izlenmelidir.

Periferik kan mononükleer hücrelerini indüklenen nöral kök hücrelere yeniden programlarken, lütfen her gün hücrelerin morfolojisini yakından gözlemleyin. Ayrıca, 6-hidroksidopamin ışığa ve ısıya duyarlıdır. Çözeltiyi ışıktan korumaya dikkat edin ve kullanmadan önce buzda tutun.

Bu prosedürü takiben, bir kültürde ailesel PD hasta kaynaklı dopaminerjik nöronlar kullanarak hastalık mekanizmaları çalışmaya devam edebilirsiniz. Bir de nakledilen hücrelerin hasarlı nöronal devreleri nasıl etkilediğini araştırmaya devam edebilirsiniz.