Name: Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri geniş alan tek foton optik kayıt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Öğrenin, gerilim duyarlı boya ile beyin dilimlerinde geniş alan tek foton optik kayıt yöntemini. Fare hipokampusu kullanarak 12 saat boyunca stabil nöron aktivitesi gözlemlenebilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TT, MEXT 'den JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 ve JP15K00413) ve sağlık, çalışma ve refah Bakanlığından (MHLW-Kagaku-ıppan-H27 [15570760] ve H30 [18062156]) alınan hibe aldı. Biz Ingilizce dil düzenleme için Editage (www.editage.jp) teşekkür etmek istiyorum.

Tüm hayvan deneyleri, Tokushima Bunri Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokollere göre yapılmıştır. Dilim hazırlama için aşağıdaki protokol neredeyse standart bir prosedür27 , ancak değişiklikler VSD ile boyama ve kayıt protokolleri olmuştur.
1. deneme gününden önce hazırlık
<ol><li>A (Tablo 1), hisse senedi B (Tablo 2) ve hisse senedi C (Tablo 3) çözümleri ve bir buzdolabında saklamak stok hazırlayın.</li>
	<li>Hazırlamak 1 L Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) (Tablo 4, adım 3 bakın) ve buzdolabında tutmak.</li>
	<li>1 L modifiye ACSF (Tablo 5) hazırlayın ve buzdolabında tutun.</li>
	<li>2 ml 'lik şişelerin içinde fetal sığır serumu (FBS) ve bir dondurucu içinde depolar 500 μL plakaya dispense.</li>
	<li>Bir mikrodalga içinde ACSF (CA. 120 mL) içinde agar tozu% 4 çözülür ve bir 90 mm tek kullanımlık Petri çanak dökün. Agar plaka daha fazla kullanmadan önce soğutulmuş olmalıdır.</li>
	<li>Deneyden bir gün önce bir dondurucu içine aşağıdaki öğeleri yerleştirin: bir cerrahi tepsi, bir dilimleyici konteyner ve alüminyum soğutma bloğu (120 x 120 x 20 mm3).</li>
	<li>Dilim işleme sistemi için membran filtreleri ile yeterli Pleksiglas yüzük olduğundan emin olun17,28 (bkz. Adım 6,12).</li>
	<li>Bir mikrodalga içinde 3 M KCl 50 mL 'de agar tozu% 2 çözülür. Topraklama elektrot için bir mikropipet kullanarak 200 μL ipuçları içinde sıcak agar-KCl disçözücüsü 85 μL civarında alın. Ucu hala sıcak agar 3 M KCl jel ayırın. % 2 agar ile 20-40 ipuçları hakkında doldurmak için adım tekrarlayın.</li>
</ol>2. VSD (di-4-ANEPPS) stok çözümünün hazırlanması
<ol><li>Hazırlamak 1 mL 10% polietokilated Hint yağı çözeltisi ile ultra-saf su.</li>
	<li>1 mL bir şişe di-4-ANEPPS (5 mg şişe), Vortex ve 10 dakika sonikat için etanol ekleyin. Çözüm, di-4-ANEPPS kristallerinin olası küçük kalıntıları ile derin kırmızı bir renge dönüşür. Not: Bu adımda kullanılan etanol taze açılmalıdır.</li>
	<li>Çözümü, O-Ring ile 2 mL 'Lik bir mikrotüpe aktarın. Eriyik aşağı spin ve eklemek 500 μL% 10 poliokilated Hint yağı çözeltisi. Not: Boya çok lipophilic olduğunu. Dmso ve Poloksamer aynı zamanda dı-4-anepps çözülür ancak membran potansiyelinin değişmesi üzerine optik sinyal açısından da kullanılabilir, biz etanol-poliokilated Hint yağı kullanımı gürültü oranı daha iyi bir sinyal verir bulundu. Bu hücre membranı için solvent transfer oranı ile ilgili olabilir.</li>
	<li>Girdap ve boya tamamen çözünmüş kadar sonikat.</li>
	<li>Işığa maruz kalma kaçının ve bir buzdolabında tutun. Dondurucuda saklama. Stok birkaç ay sürebilir. Not: Deneme gününde 3-9 adımlarını izleyin.</li>
</ol>3. ACSF günlük hazırlanması (1 L) (Tablo 4)
<ol><li>NaCl, NaHCO3ve glikoz bir Flask ağırlığında.</li>
	<li>950 mL damıtılmış su ile Flask ekleyin ve 95% O2/5% Co2 Gas ile kabarcıklanma başlar.</li>
	<li>2,5 mL stok Ekle Flask bir çözüm ve oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca inkük.</li>
	<li>2,5 mL stok C çözeltisi Flask ekleyin.</li>
	<li>1 L çözüm yapmak için distile su ekleyin.</li>
</ol>4. boyama VSD Ssolution günlük hazırlanması
<ol><li>500 μL FBS ve VSD stok solüsyonu (adım 2) bir ultra-sonicator içinde 5 dakika boyunca sonikat.</li>
	<li>FBS şişe içine taze hazırlanmış ACSF 500 μL ekleyin.</li>
	<li>20 (fareler durumunda) veya 40 (fareler durumunda) μL VSD stok çözeltisi şişeye ekleyin.</li>
	<li>Ultra-sonikat ve çözüm kadar şişenin girdap soluk turuncu olur.</li>
</ol>5. cerrahi hazırlığı
<ol><li>300 mL paslanmaz çelik konteyner, bir 300 mL Beaker ve plastik bir kap içinde ayrı olarak soğutulmuş ACSF 100 mL alın ve bir dondurucuya yerleştirin. Dökün 150 ml soğutulmuş değiştirilmiş acsf (Tablo 2) başka bir kabı ve dondurucuya yerleştirin. Çözümler soğutulmuş kadar bekleyin; alınan süre ölçülmeli ve önceden belirlenmelidir.</li>
	<li>Fold bir jilet kırmak için (karbon çelik, endüstriyel sınıf 0,13 mm kalınlığında, her iki tarafta bıçak) dilimleyici için yarım. Not: Diğer yarısı uygun bir bıçak tutucu ile diseksiyon için kullanılabilir.</li>
	<li>Bir ayar jig ile ACSF 4% agar plaka bir blok hazırlayın (Şekil 1).</li>
	<li>Beyin dilimlerini fizyolojik olarak canlı tutmak için nemli bir kuluçl odası (arayüz tipi oda; modifiye 1,2 ı silikon Ambalajla sıkı mühürlü kutu) hazırlayın (Şekil 2); 95% O2/5% Co2 Gas ile küçük bir konteyner ve karbonat acsf ekleyin ve üst için acsf ile bir 90 mm x 20 mm Petri çanak doldurun. Not: Daha küçük bir petri tabağı (60 mm x 20 mm), çanak üzerinde bir filtre kağıdı desteklemek için 90 mm çanak ortasına yerleştirilmelidir.</li>
	<li>Kutuyu bir Isıtma cihazına koyun ve 28 °C ' ye kadar ısıtmak için 20 dakika bekleyin.</li>
	<li>Dilimleyici konteyner içine ezilmiş buz ekleyin. Aşağıdaki aletleri buzda paslanmaz çelik bir KDV (küçük) olarak yerleştirin: neşter, bıçak tutucu, halka cımbız, agar bloğu ve Dilimleyici bir aşama. 95% O2/5% Co2 Gas (aka. karojen) ile buz ve balon üzerinde dondurulmuş ACSF ve modifiye acsf tutun.</li>
	<li>Aşağıdaki aletleri bir KDV (büyük): makas (büyük, küçük), cımbız, bir spatula, bir kaşık ve diyagonal pense yerleştirin.</li>
</ol>6. cerrahi (fareler)
<ol><li>Bir duman kaputu Isoflurane kullanarak fareyi anestezize. Ayak tutam üzerine hayvanın pedal refleks kontrol ederek anestezi seviyesini değerlendirmek.</li>
	<li>Faresi batırın ve kafası buz gibi soğuk ACSF 'e paslanmaz çelik cerrahi tepsiye daldırın.</li>
	<li>1 dakika içinde beyin ayıklamak ve 5 dakika boyunca soğutulmuş acsf içeren bir kabı yerleştirin.</li>
	<li>Beyninizi kabı 'dan çıkarın ve bir neşter kullanarak beyin bloğunu kırpın (Şekil 3A).</li>
	<li>Beyin bloğunu% 4 agar bloğu üzerine yerleştirin (adım 5,3, Şekil 3B). Her iki yarımküre de bir agar bloğuna monte edilebilir. Aşırı ACSF 'i bloktan filtre kağıdıyla silin.</li>
	<li>Dilimleyici tablosuna ince yapıştırıcı (Süper Tutkal) uygulayın. Agar bloğu üzerine yerleştirin ve bir filtre kağıdı kullanarak aşırı yapıştırıcı silin.</li>
	<li>Yavaşça beyin-agar bloğunun üst kısmındaki bir pipet kullanarak buz-soğuk ACSF (~ 5 mL) küçük bir miktar uygulayın. Bu aşırı süper tutkal sağlamlaştırmak ve beyin kapsayan ve dilimleme rahatsız tutkal önlemek yardımcı olacaktır.</li>
	<li>Dilimleyici tepsisine (Şekil 3c) Dilimleme tablosunu düzeltin ve değiştirilmiş acsf dökün.</li>
	<li>Dilimleyicisini en fazla bıçak frekansı ile yavaş bir hızda ayarlayın.</li>
	<li>Dilim kalınlığını 350-400 μm olarak ayarlayın ve dilimleme başlatın (Şekil 3c). Dilimleri, dilimlerin derinliğinin kolayca ayırt edilebilmek için bir sırayla dilim tepsisinin köşesine yerleştirin. Genellikle üç ila beş dilim bir yarımküden elde edilebilir.</li>
	<li>30 G iğne kullanarak beyin kökü kısmını kesip (şekil 3D). Not: Eğer gerekirse, bir dürbün mikroskop altında bu aşamada CA3-CA1 sınırı arasında bir kesim gibi beyin dilimi üzerinde mikrocerrahi yapılmalıdır.</li>
	<li>Küçük uçlu bir boya fırçası kullanarak, dilim pleksiglass halkası17 (15 mm dış çapı, 11 mm iç çapı, 1 mm kalınlığı, Şekil 3e) ile tutulan membran filtresinin (0,45 ΜM gözenekleri, PTFE-membran, 13 mm çapında) ortasına yerleştirin. Halkası nemli kurtarma odasına yerleştirin (Şekil 2) ve iç basıncı yüksek tutmak için kapağı sabitleyin. Not: Dilimlerde membran 30 dakika içinde yapışacak ve kayıt odasında sonraki adımlarda yüzüklerle ele alınabilir. Dilim yerinde tutmak için ağırlık veya diğer önlemleri kullanmak için gerek yoktur.</li>
	<li>İyi merkezli ve tutarlı bir yönde olduğundan emin olmak için yüzük dilimi yönünü ve konumunu ayarlayın (bkz. Adım 9,3).</li>
	<li>Numuneyi 30 dakika boyunca 28 °C ' de, sonra da dilimlerin kurtarılması için oda sıcaklığında en az 10 ila 30 dakika bırakın. Not: Dilim şimdi en az 15 h için iyi bir fizyolojik durum koruyabilirsiniz.</li>
</ol>7. dilimlerin boyama ve durulama (fareler)
<ol><li>Boya çözeltisi 100-110 μL 'i (adım 4), bir mikropipet kullanarak halka üzerindeki her dilim üzerine hafifçe uygulayın. 8 ila dokuz dilim, 4. adımda hazırlanan bir boyama çözümüyle lekelenebilir. Dilimleri boyama için 20 dakika bırakın.</li>
	<li>Bir konteynır 50-100 mL ACSF hazırlayın ve boyama çözümünü durulamak için halkası dilimlenmiş numuneye yerleştirin.</li>
	<li>Durulama dilimi başka bir kuluçka odasına saklayın. Deneyden önce kurtarma için 1 h 'den fazla bekleyin. Not: Kuluçta odası gazdan ayrılabilir ve sıkı mühürlü bir durumda kayıt yerine taşınmış olabilir. Dilim gaz kaynağı olmadan en az 20 dakika canlı kalabilir. Bu durum, dilimi kayıt için başka bir yere taşımanız gerektiğinde yararlıdır.</li>
</ol>8. deneysel cihazların günlük hazırlanması
<ol><li>Amplifikatör, bilgisayar ve kamera sistemini açın ve yazılımın çalıştığını kontrol edin.</li>
	<li>Bir 50 mL tüp ve kabarcık kargengen ile yer ACSF.</li>
	<li>ACSF dolaşmak için bir peristaltik pompa kullanın. Akış hızını yaklaşık 1 mL/dak olarak ayarlayın.</li>
	<li>Emme Pipetinin yüksekliğini, deney odasının içindeki sıvı seviyesinin her zaman sabit olması için ayarlayın. Not: Çözümün düzeyi istikrarlı bir kayıt elde etmek için önemlidir, bu nedenle, ayarlama bir Mikromanipülatör kullanılarak yapılmalıdır.</li>
	<li>3 M KCl agar (% 2) ile dolu sarı yongalı zemin elektrot yükleyin (adım 1,8), az miktarda 3 M KCl çözeltisi olan bir Ag-AgCl kabloyla bir tutucuya yerleştirin.</li>
	<li>Küçük bir miktarda acsf (hacminin yaklaşık iki üçte birini) cam elektrot (1 mm dış çapı, 0,78 mm iç çapı bir mikropipet çektirme ile çekilen) içine konik ince tüplü sarı ucu kullanarak doldurun ve elektrot tutucusuna yerleştirin.</li>
	<li>Tutucuyu manipülatöre takılı olan ÇUBUKa takın. Elektrot direnci yaklaşık 1 MΩ olduğu bir amplifikatör kullanarak emin olun. Not: Uzun şaft geniş açılış (4-8 μm açılış) yama tipi elektrot alan kaydı için iyi olmalıdır ve uyarıcı bir elektrot olarak.</li>
</ol>9. kayıt oturumu başlatılıyor
<ol><li>Nemli odasından forseps ile bir dilim hazırlama alın.</li>
	<li>Dilimi hızlı bir şekilde mikroskop altındaki deneysel bir odaya yerleştirin (Şekil 4).</li>
	<li>Halka kenarına sıkıca silikon O-Ring içine itin. Membran veya deney odasının alt kırmak için dikkatli olun. Not: Dilimin yönü, görüş alanında uyarıcı ve kayıt elektrotlarının yönüne göre dikkate alınmalıdır. Sağlıklı dilim, ağırlık ve naylon kafes gibi dilimleri düzeltmek için diğer cihazları kullanmaya gerek kalmamak için membran filtresine yapışmalıdır.</li>
	<li>Uyarıcı elektrot ve alan potansiyel kayıt elektrot ucunu aktarılan ışık ile mikroskop altında dilim üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Yanıtı kontrol etmek için elektrofizyolojik kayıt sistemini kullanın. Verilen konfigürasyona sahip her zamanki (lekesiz) elektrofizyolojik kaydı onaylayın. Not: Kayıt elektrot atlanabilir ama dilim fizyolojisi kontrol etmek yararlıdır.</li>
	<li>5 adet su daldırma objektif objektif ve 1x PLAN APO tüp lensi ile 10 kHz 'de örnekleme yaparken numunede 13-15 mW/cm2 ' ye karşılık gelen kameranın maksimum kapasitesinin% 70-80 ' üne uyarma ışık yoğunluğunu ayarlayın. Uyarma ışık dalga boyu 530 nm ve emisyon filtresi 590 nm > olmalıdır. Not: Uyarma ışığı miktarını en aza indirmek için bir deklanşör kullanın. Sürekli ışık pozlama dilim fizyolojisi bozulabilir. Işığın olası zararlı etkisi ışığın yoğunluğuna ve süresine bağlıdır. Işığın etkisini değerlendirmek için elektrofizyolojik kayıt kullanın. 13-15 mW/cm2mukavemeti durumunda, yaklaşık 1 s pozlama toleransı üst sınırı olmalıdır.</li>
	<li>Odak dalga boyunda bağlı olarak farklı olabilir ve edinme başlatmak çünkü floresan ışık kaynağını kullanarak edinme sistemi ile odağı ayarlayın.</li>
	<li>Görüntü edinme yazılımında verileri inceleyin. Not: Ayrıntılı analiz için sayısal analiz yazılımının orijinal mikroprogramlama paketini kullandık.</li>
</ol>

<ol><li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+%28LTP%29+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389(2018).</li>
<li>Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSD+Imaging+Method+of+Ex+Vivo+Brain+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+and+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation.</a> Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).</li>
<li>Homma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+and+two-photon+imaging+of+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li>
<li>Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+fluorescence%2C+turbidity%2C+and+birefringence+associated+with+nerve+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).</li>
<li>Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Scattering+and+Birefringence+Changes+during+Nerve+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity.</a> Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).</li>
<li>Hill, D., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opacity+changes+in+stimulated+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Opacity changes in stimulated nerve.</a> The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).</li>
<li>Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Large+Change+in+Axon+Fluorescence+that+Provides+a+Promising+Method+for+Measuring+Membrane+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+New+Biology%22%5BJournal%5D)">A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential.</a> Nature New Biology. 241 (109), 159(1973).</li>
<li>Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Recording+of+Impulses+in+Individual+Neurones+of+an+Invertebrate+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System.</a> Nature. 246 (5434), (1973).</li>
<li>Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Methods+for+Monitoring+Neuron+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical Methods for Monitoring Neuron Activity.</a> Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).</li>
<li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+change+in+dye+absorption+during+the+action+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A large change in dye absorption during the action potential.</a> Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).</li>
<li>Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge-shift+probes+of+membrane+potential.+Characterization+of+aminostyrylpyridinium+dyes+on+the+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).</li>
<li>Loew, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naphthyl+analog+of+the+aminostyryl+pyridinium+class+of+potentiometric+membrane+dyes+shows+consistent+sensitivity+in+a+variety+of+tissue%2C+cell%2C+and+model+membrane+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations.</a> The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).</li>
<li>Mullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Fluorescence+Dyes+for+Monitoring+Neuronal+Activity+in+the+Embryonic+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).</li>
<li>Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Dyes+for+Long-Term+Recording+of+Neural+Activity+in+the+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus.</a> Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).</li>
<li>Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. , US 6,448,063 B2 (2002).</li>
<li>Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+viability+of+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extending the viability of acute brain slices.</a> Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).</li>
<li>Tanemura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+with+Tau+Accumulation+in+a+Transgenic+Mouse+Expressing+V337M+Human+Tau%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).</li>
<li>Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+response+profiles+of+CA1+pyramidal+cells+probed+with+voltage-sensitive+dye+optical+imaging+in+rat+hippocampal+slices+reveal+the+impact+of+GABAA-mediated+feed-forward+inhibition+in+signal+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation.</a> Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).</li>
<li>Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entorhinal+Cortex+Layer+III+Input+to+the+Hippocampus+Is+Crucial+for+Temporal+Association+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory.</a> Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).</li>
<li>Juliandi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+and+Cognitive+Impairments+following+Prenatal+Treatment+of+the+Antiepileptic+Drug+Valproic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid.</a> Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).</li>
<li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro%3A+network+dynamics%2C+filter+properties%2C+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160(2015).</li>
<li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+%28LTP%29+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389(2018).</li>
<li>Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+Plasticity+Involved+in+the+Spread+of+Neural+Activity+Within+the+Rhinal+Cortices+as+Revealed+by+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging+in+Mouse+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20(2019).</li>
<li>Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPopovic%2C+M+%22Journal+of+visualized+experiments%22">Journal of visualized experiments</a>. , (2012).</li>
<li>Sakmann, B., Stuart, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , (1995).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+long-lasting+depolarization+on+burst+stimulation+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices.</a> Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).</li>
<li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Voltage-Sensitive+Dyes+Modulate+GABAAReceptor+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).</li>
<li>Canitano, R., Pallagrosi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autism+Spectrum+Disorders+and+Schizophrenia+Spectrum+Disorders%3A+Excitation%2FInhibition+Imbalance+and+Developmental+Trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories.</a> Frontiers in Psychiatry. 8, 69(2017).</li>
<li>Anticevic, A., Murray, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebalancing+Altered+Computations%3A+Considering+the+Role+of+Neural+Excitation+and+Inhibition+Balance+Across+the+Psychiatric+Spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum.</a> Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).</li>
<li>Busche, M., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+neural+circuit+function+in+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429(2016).</li>
<li>Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687(2012).</li>
<li>Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+toolbox+for+remote+control+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits.</a> Nature Methods. 5 (4), 293(2008).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+nonscanning+confocal+microscopy+module+for+functional+voltage-sensitive+dye+and+Ca2%2B+imaging+of+neuronal+circuit+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Dilim fizyolojisi doğru sinyali toplamak için hayati önem taşımaktadır. Bu protokolde halka membran filtre sisteminin kullanımı, dilimin sağlıklı kalmasını ve prosedür2,16,17boyunca bozulmasını sağlar. Diğer sistemler kayıt sırasında dilim fizyolojisini korumak için kullanılabilir, ancak görüntüleme, dilimin her parçası sağlıklı olması için gerektiğinde herhangi bir zamanda deforme olmamalıdır. Ring-membran filtre sistemi de boy...

Geniş alan tek foton voltaj duyarlı boya (VSD) toplu lekeli beyin dilim preparatları görüntüleme nöral devrelerin dinamiklerini değerlendirmek için yararlı bir nicel aracı haline gelmiştir1,2,3,4 . Membran uyarma5,6,7, VSD görüntüleme nedeniyle optik özelliklerdeki değişikliklerin analizinden sonra ilk olarak 1970 ' lerin başında Cohen ve diğerleri tarafından tanımlanmıştır6,8, 9.; boya doğrudan membran potansiyel değişiklikler (yani, nöronların birincil sinyali) problar gibi gerçek zamanlı olarak beyin fonksiyonlarını izlemek için uygun bir yöntemdir.
İlk VSDs beyin sistemi anlamak için arzu edilen özelliklere sahip, gibi hızlı bir zaman sabit nöronal membran potansiyel olayların hızlı kinetiği takip etmek, ve membran potansiyelinin değişikliği ile doğrusallık9, 10 ' dan fazla , 11 ' i , 12 tane , 13 ' ü , 14 , 15. diğer görüntüleme deneylerine benzer şekilde, bu teknik, istenilen sonuçları başarmak için kameralar, optik, yazılım ve dilim fizyolojisi gibi geniş bir yelpazede özel ayarlamalar gerektirir. Bu teknik tuzaklar nedeniyle, ilk çabaları sırasında beklenen faydaları mutlaka bu teknikte uzmanlaşmadı laboratuvarların çoğu için gerçekleştirmez.
Teknik zorluk ilkel nedeni, dilim preparatlarının toplu boyama uygulandığında membran potansiyel değişim doğru VSD düşük duyarlılığı oldu. Optik sinyal büyüklüğü (yani, floresan fraksiyonel değişim) genellikle 10-4-10-3 kontrol (F0) fizyolojik koşullar altında sinyal. Bir nöron membran potansiyel değişim zaman ölçeği yaklaşık milisaniyeye kadar birkaç milisaniye. Neuron membran potansiyelinin değişikliklerini ölçmek için, kayıt için kullanılan kamera yüksek hızda (10 kHz-100 Hz) görüntüleri elde edebilmek gerekir. VSD 'nin düşük duyarlılığı ve sinir sinyalini takip etmek için gereken hız, yüksek bir sinyal-gürültü oranı (S/N)2,16ile yüksek hızda fotoğraf makinesinde toplanan büyük miktarda ışık gerektirir.
Kayıt sisteminin optik yeterli ışık toplama ve S/N geliştirmek için de kritik bir unsurdur. Optik tarafından elde edilen büyütme genellikle aşırı düşük, 1X gibi 10X, yerel fonksiyonel nöral devre görselleştirmek için. Örneğin, hipokampal devresinin dinamiklerini görselleştirmek için yaklaşık 5 ' in büyütme uygun olacaktır. Bu kadar düşük büyütme düşük floresan verimliliğine sahiptir; Bu nedenle, gelişmiş optik bu tür kayıt için yararlı olacaktır.
Buna ek olarak, dilim fizyolojisi de esastır. Görüntüleme analizi dilimlerin bozulmamış olmasını gerektirdiğinden, dikkatli dilim işleme17gereklidir. Ayrıca, daha uzun bir süre için dilim canlılığı korumak için alınan önlemler önemlidir18.
Bu makalede dilimler, VSD boyama ve ölçümler hazırlanması için protokol açıklanmaktadır. Makale Ayrıca VSDs, görüntüleme aygıtı ve optik geliştirmeleri ve diğer ek geliştirmeler için bu yöntemi etkin bir basit, güçlü ve nicel tahlil olarak kullanılmak üzere etkinleştirmiş deneysel sisteme özetliyor beyin fonksiyonlarının değiştirilmesi19,20,21,22,23,24,25. Tekniği de yaygın hipokampal dilimleri CA1 alanında uzun vadeli potansiyasyon için kullanılabilir1. Dahası, bu teknik aynı zamanda tek bir sinir hücresi26membran potansiyelleri optik kayıt yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>Yüksek hızlı görüntü elde etme sistemi</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>MiCAM - Ultima</td><td>Görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>: Yüksek hızlı görüntü elde etme sistemi</td><td>, Brainvision co., Ltd.</td><td>MiCAM 02</td><td></td></tr><tr><td>Geniş alan görüntüleme için Macroscepe</td><td>görüntüleme sistemi Brainvision co., Ltd.</td><td>THT makroskop</td><td>makroskop</td></tr><tr><td>Foto-diodod stabilliizatör ile yüksek güçlü LED aydınlatma sistemi</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>LEX-2G</td><td>LED aydınlatma</td></tr><tr><td>Görüntü elde etme yazılımı</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>BV-ana</td><td>görüntü elde etme yazılımı</td></tr><tr><td>Çok fonksiyonlu elektrik stimülatörü</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>ESTM-8</td><td>Uyaran izolatörü + AD / DA dönüştürücü</td></tr><tr><td>Dilimleyici</td><td>Leica</td><td>VT-1200S</td><td>dilimleyici</td></tr><tr><td>Dilimleyici</td><td>Leica</td><td>VT-1000</td><td>dilimleyici</td></tr><tr><td>Dilimleyici</td><td>Tüy Güvenlik Tıraş Bıçağı Co., Ltd.</td><td># 99027</td><td>karbon çelik tıraş bıçağı</td></tr><tr><td>Dilim desteği için membran filtre</td><td>Merk Millipore Ltd., MA, ABD</td><td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 ve mikro; m gözenekler,</td> <td>membran filtre / 0.45 13</td></tr><tr><td>Sayısal analiz yazılımı</td><td>Wavemetrics Inc., OR, ABD</td><td>IgorPro</td><td>analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Stimülasyon izolatörü</td><td>WPI Inc.</td><td>A395</td><td>Uyaran izolatörü</td></tr><tr><td>AD/DA dönüştürücü</td><td>Instrutech</td><td>ITC-18</td><td>AD/DA dönüştürücü</td></tr><tr><td>Gerilime duyarlı boya Di-4-ANEPPS</td><td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>katalog numarası: D-1199</td><td>VSD: Di-4-ANEPPS</td></tr><tr><td>Poloxamer</td><td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>Pluronic F-127 P30000MP</td><td>poloksamer/Pluronic F-127 (DMSO'da %20 çözelti)</td></tr><tr><td>Polietoksillenmiş hint yağı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cremophor EL C5135</td><td>polietoksillenmiş hint yağı</td></tr></tbody></table>

gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri geniş alan tek foton optik kayıt

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Beyin dilim preparatlarının geniş alan tek foton voltajı duyarlı boya (VSD) görüntülenmesi, nöral devrelerde fonksiyonel bağlantı değerlendirmek için yararlı bir araçtır. Işık sinyalinde fraksiyonel değişiklik nedeniyle, bu yöntemi bir nicel tahlil olarak kullanmak zor olmuştur. Bu makalede, özel optik ve dilim işleme sistemleri, bu tekniği istikrarlı ve güvenilir hale açıklar. Bu makalede, dilim işleme, boyama ve VSD lekeli hipokampal dilimleri ayrıntılı olarak kaydedilmesini gösterir. Sistem uzun süre fizyolojik koşulları korur, iyi boyama ile, ve kayıtlar sırasında dilim mekanik hareketlerini önler. Dahası, küçük bir miktar boya ile dilimlerin boyama sağlar. Optik, 100 piksel x 100-piksel uzamsal çözünürlüğe sahip, 10 kHz maksimum kare hızında VSD sinyalinin kaydedilmesine olanak sağlayan düşük büyütmede yüksek sayısal diyaframı elde edilir. Yüksek kare hızı ve uzamsal çözünürlüğe bağlı olarak, bu teknik, nöral devrelerdeki değişiklikleri değerlendirmek için yeterli sinyal-gürültü oranı sağlayan kayıt sonrası filtrelerin uygulanması sağlar.

Şekil 5 , bir fare hipokampal DILIMININ CA1 bölgesinde Schaffer teminatın elektrik stimülasyon üzerine temsili optik sinyali gösterir. Şekil 5A 'daki ardışık görüntüler, uzamsal ve temporal filtreler uygulanmadan önce optik sinyali gösterirken, Şekil 5B 5 x 5 x 5 Kübik filtre (Gauss çekirdeği konvolüsyonu, 5 x 5 uzamsal-ve 5 ' e kadar) uygulandıktan sonra aynı verileri gösterir Geçici boyut) iki kez....

Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri için tekrarlanabilir ve istikrarlı bir optik kayıt yöntemi sunuyoruz. Bu yazıda konvansiyonel hipokampal dilim preparatları kullanılarak voltaj duyarlı boya boyama ve optik sinyallerin kaydedilmesi açıklanmaktadır.

Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri geniş alan tek foton optik kayıt

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Voltaj duyarlı boya ile optik kayıt yöntemi beynin nasıl çalıştığını görselleştirmek için ideal bir teknoloji olduğu düşünülmektedir. Bu yöntem bize psişik aktivite hakkında bir görünüm verilen, 12 saat içinde bir nöropsizor dinamikleri stably ve güvenilir kayıt için izin verdi. Biz anneler için değerli asit uygulaması gibi geliştirme nin tüm aşamasında kimyasalların neden olduğu devre değişiklikleri tespit etmek için uygulama genişletmek için çalışıyoruz.Teknik zaten iyi kurulmuştur. Lütfen burada sunulan yöntemi izleyerek çalışmaları yeniden oluşturmaya çalışın. Bu prosedüre başlamak için, kafası kesilmiş başı buz gibi ACSF'ye paslanmaz çelik cerrahi tepsiye batırın.Bir dakika içinde beyin ayıklayın ve beş dakika boyunca soğutulmuş ACSF içeren bir beher yerleştirin. Daha sonra, bir neşter ile orta hatta beyin bölümü bölmek ve% 4 agar blok üzerine her iki yarımkürede yerleştirin. Sonra, her iki yarımküreile beyin bloğu yerleştirin 4% agar blok üzerine.Fazla ACSF'yi bir filtre kağıdıyla bloktan silin. Daha sonra, vibratom platformuna superglue uygulayın. Üzerine agar blok yerleştirin ve bir filtre kağıdı ile aşırı yapıştırıcı silin.Yavaşça fazla superglue katılaşmaya yardımcı olmak ve beyin kapsayan ve dilimleme rahatsız tutkal önlemek için beyin agar blok üstünden buz gibi ACSF az miktarda uygulayın. Daha sonra, vibratom tepsisine platform düzeltmek ve değiştirilmiş ACSF dökün. Vibratomu yavaş bir hıza ayarlayın ve bıçak frekansını maksimum ayarında ayarlayın.O zaman dilimlemeye başla. Dilimlerin sırası kolayca ayırt edilebilmesi için dilimleri sırayla dilim odasının köşesine yerleştirin. Genellikle bir yarımküreden 3-5 dilim elde edilebilir.Sonra, 30 gauge iğne kullanarak beyin sapı kısmını kesti. Küçük uçlu bir boya fırçası kullanarak, dilimi pleksiglas halkaile tutulan membran filtresine yerleştirin. Halkayı nemli bir geri kazanım odasına yerleştirin ve iç basıncı yüksek tutmak için kapağı sabitlayın.Dilimi membran filtresine yerleştirirken, dilimin halka içindeki yönünü ve konumunu iyi ortalandığından ve tutarlı bir yöne sahip olduğundan emin olmak için ayarlayın. Numuneyi 28 derecede 30 dakika, oda sıcaklığında ise en az 10-30 dakika bekletin. Dilimleri boyamak için, boyama çözeltisinin 100 mikrolitresini her dilimin üzerine hafifçe uygulayın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.Ardından, bir kapta 50 ila 100 mililitre ACSF hazırlayın. Boyama çözeltisini durulamak için halkayı numunenin içinde yerleştirin. Daha sonra, durulanan dilimleri başka bir kuluçka odasına aktarın.Denemeden önce iyileşme için bir saatten fazla bekleyin. Bu yordamı başlatmak için amplifikatör, bilgisayar ve kamera sistemini açın ve yazılımı açın. 50 mililitrelik bir tüp acsf dökün ve carbogen ile kabarcık.ACSF'yi sirküle etmek ve akış hızını dakikada yaklaşık bir mililitreye ayarlamak için peristaltik bir pompa kullanın. Daha sonra emme pipetinin yüksekliğini, deney odasının içindeki sıvı seviyesinin her zaman sabit olması için ayarlayın. Zemin elektrot'u odaya yerleştirin.Daha sonra, cam elektrot acsf küçük bir miktar ile doldurun ve elektrot tutucu yerleştirin. Tutucuyu manipülatörün çubuğuna takın. Bir amplifikatör kullanarak, elektrot direnci yaklaşık bir megaohm olduğundan emin olun.Kayıt oturumunda, nemli odadan deneysel bir odaya bir dilim aktarın. Halkanın kenarına silikon o-halkaya sıkıca bastırın. Deney odasının zarını veya altını kırmamaya dikkat edin.Mikroskop altında uyarıcı elektrot ucu ve alan potansiyel kayıt elektrot dilim yerleştirin. Bir uyarıcı sunarak uyarılmış yanıtı kontrol edin. Görüş alanının optik kayıt sistemindeki doğru sinir devresini kapsadığını doğrulayın.Ardından, uyarma ışık yoğunluğunu kameradaki maksimum kapasitenin yaklaşık %70 ila %80'ine ayarlayın. Floresan ışık kaynağını kullanarak, odak satın alma sistemi ile ayarlayın. Ardından, kaydı başlatın ve satın alma dan sonra bir görüntü edinme yazılımındaki verileri analiz edin.Bu rakam bir fare hipokampal dilim alan CA1 Schaffer collaterol elektrikstimülasyon üzerine temsili optik sinyal gösterir. Bu ardışık görüntüler, herhangi bir aralıklı ve zamansal filtre uygulanmadan önce optik sinyali gösterirken, bu görüntüler beşe beş kübik filtreyi iki kez uyguladıktan sonra aynı verileri gösterir. Yüksek kare hızı ve yüksek uzamsal çözünürlük nedeniyle, filtreuygulaması sinyali değiştirmedi, ancak tek bir denemede pikselolarak kaydedilen zaman diliminde de gözlemlenebilen gürültüyü filtreledi.Burada fare ve sıçan arasındaki hipokampal dilimlerin alan CA1 tipik tepkilerin karşılaştırılmasıdır. Fare hipokampal diliminde 24 milisaniye sonra CA1 distal tarafında küçük hiperpolarize yanıt gözlenir, ancak daha büyük hiperpolarize yanıt sıçan hipokampal dilimde depolarize yanıt geçti. Dilimler boyandıktan sonra 12 saatten fazla dayanmalıdır ve üzerlerinde başka elektrofizyolojik kayıtlar yapabilirsiniz.

wide-field-single-photon-optical-recording-brain-slices-using-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, boyalar, ayarlanabilir bir çözünürlüğe sahip, sağlam sinir ağları gibi kobay enterik sinir sistemi plexuses gibi optik kayıt sağlayan elektriksel aktivitenin ne kadar voltaj duyarlı göstermektedir ki, tek hücrelerden çok ganglion devre arasında değişmektedir.

Gerilim duyarlı Boyalar kullanarak Gine domuzu Enterik Ağları Elektrik Faaliyet Optik Kayıt

Kortikal nöronlarda işlev popülasyonlarının düzeyinde ortaya çıkar, çünkü omurgalı merkezi sinir sisteminin fonksiyon anlama çok nöronların kayıtları gerektirir. Burada tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktiviteyi kaydetmek için bir optik yöntem tarif, rasgele erişim tarama titrek. Kadar yüksek zamansal çözünürlüğe sahip 100 nöronlara Bu yöntem kayıtları somatik flüoresan kalsiyum sinyalleri. Maksimum-olabilirlik algoritması somatik flüoresan kalsiyum sinyallerinden...

Tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktivitenin Optik kaydı

Alt-mikrometre mekansal ve alt milisaniyelik zamansal çözünürlüğe sahip membran potansiyeli değişiklikleri izleme için bir görüntüleme tekniği tarif edilmiştir. Gerilim karşı hassas boyaların lazer uyarma göre yöntem, aksonların ve akson kollateral, terminal dendritik dalları, ve bireysel dendritik omurga sinyallerin ölçümleri sağlar.

Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Bu video, voltaja duyarlı bir boya ile boyanmış bir beyin dilimindeki nöronal aktivitedeki değişiklikleri gözlemlemek için bir prosedürü göstermektedir. Boya, floresan yoğunluğunu değiştirerek nöronun zar potansiyelindeki değişiklikleri yansıtır. Elektriksel uyaranların ve gelişmiş görüntüleme tekniklerinin uygulanması yoluyla bu işlem, VSD floresansına dayalı olarak nöronal membran potansiyelindeki gerçek zamanlı değişikliklerin görsel olarak izlenmesini sağlar.

Gerilime Duyarlı Bir Boya ile Boyanmış Beyin Dilimlerinde Nöronal Aktivitenin Optik Kaydı

Bu videoda, nörona özgü floresan proteinler içeren transgenik beyin dilimlerinden elektriksel aktivitenin aynı anda görüntülenmesi ve kaydedilmesi için bir yöntem özetlenmektedir. Prosedür, beyin diliminin havalandırılmış yapay beyin omurilik sıvısı ile bir perfüzyon odasında tutulmasını, floresan etiketli hücreleri uyarmak için bir ışık kaynağı kullanılmasını ve elektrik sinyallerinin çok kanallı bir prob ve yama kelepçesi ile kaydedilmesini içerir.

Beyin Dilimlerindeki Nöronal Hücrelerin Eş Zamanlı Optik ve Elektrofizyolojik İzlenmesi

Bu video, medial prefrontal korteks (mPFC) aksonlarını optogenetik olarak uyararak ve LEC'deki piramidal nöronların yanıtlarını kaydederek lateral entorinal kortekste (LEC) sinaptik verimliliği inceleme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, sinaptik plastisiteyi incelemek için yama-kelepçe kayıtlarını ışık stimülasyonu ile sinaptik aktivasyon ile birleştirir.

Sıçan Beyin Dilimlerinde Sinaptik Olayların Optogenetik Stimülasyonu ve Elektrofizyolojik Kaydı

Burada, foto-reaktif doğal olmayan bir amino asidi, kültürde veya in vivo nöronlarda eksprese edilen bir hedef nöronal proteine genetik olarak kodlayarak kısa bir ışık darbesi ile bir nöronal proteini seçici olarak aktive etmek için bir prosedür sunulmaktadır.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Ex vivo beyin dilimleri, uçucu anesteziklerin afferent girdilere uyarılmış yanıtlar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. Optogenetik, talamokortikal ve kortikokortikal afferentleri primer olmayan neokortekse bağımsız olarak aktive etmek için kullanılır ve sinaptik ve ağ yanıtları izofluran ile modüle edilir.

Beyin Dilimlerinde Afferent Yolakların Optogenetik Aktivasyonu ve Uçucu Anesteziklerle Yanıtların Modülasyonu

Bu protokol, transgenik olmayan omurgasız türlerde, absorbans voltajı duyarlı boyalar ve bir fotodiyot dizisi kullanılarak nöronal popülasyon aktivitesini tek hücreli çözünürlükle görüntüleme için bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, görüntüleme ve analizin tek bir gün boyunca takip edilebildiği hızlı bir iş akışı sağlar.

Transgenik Olmayan Omurgasızlarda Tek Nöron Çözünürlüğü ile Ağ Dinamiklerini Kaydetmek için Fotodiyot Tabanlı Optik Görüntüleme

Bu makale, farelerde yatay hipokampal beyin dilimleri elde etmek için sistematik bir protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodolojinin amacı, dentat girus ile ilgili nörolojik süreçleri değerlendirmek için perforant yol ve yosunlu lif yolu gibi hipokampal lif yollarının bütünlüğünü korumaktır.

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

Öğrenin, gerilim duyarlı boya ile beyin dilimlerinde geniş alan tek foton optik kayıt yöntemini. Fare hipokampusu kullanarak 12 saat boyunca stabil nöron aktivitesi gözlemlenebilir.

Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri geniş alan tek foton optik kayıt

Daha fazla video keşfet