Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri geniş alan tek foton optik kayıt
20 Haziran 2019
Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri için tekrarlanabilir ve istikrarlı bir optik kayıt yöntemi sunuyoruz. Bu yazıda konvansiyonel hipokampal dilim preparatları kullanılarak voltaj duyarlı boya boyama ve optik sinyallerin kaydedilmesi açıklanmaktadır.
Voltaj duyarlı boya ile optik kayıt yöntemi beynin nasıl çalıştığını görselleştirmek için ideal bir teknoloji olduğu düşünülmektedir. Bu yöntem bize psişik aktivite hakkında bir görünüm verilen, 12 saat içinde bir nöropsizor dinamikleri stably ve güvenilir kayıt için izin verdi. Biz anneler için değerli asit uygulaması gibi geliştirme nin tüm aşamasında kimyasalların neden olduğu devre değişiklikleri tespit etmek için uygulama genişletmek için çalışıyoruz.
Teknik zaten iyi kurulmuştur. Lütfen burada sunulan yöntemi izleyerek çalışmaları yeniden oluşturmaya çalışın. Bu prosedüre başlamak için, kafası kesilmiş başı buz gibi ACSF'ye paslanmaz çelik cerrahi tepsiye batırın.
Bir dakika içinde beyin ayıklayın ve beş dakika boyunca soğutulmuş ACSF içeren bir beher yerleştirin. Daha sonra, bir neşter ile orta hatta beyin bölümü bölmek ve% 4 agar blok üzerine her iki yarımkürede yerleştirin. Sonra, her iki yarımküreile beyin bloğu yerleştirin 4% agar blok üzerine.
Fazla ACSF'yi bir filtre kağıdıyla bloktan silin. Daha sonra, vibratom platformuna superglue uygulayın. Üzerine agar blok yerleştirin ve bir filtre kağıdı ile aşırı yapıştırıcı silin.
Yavaşça fazla superglue katılaşmaya yardımcı olmak ve beyin kapsayan ve dilimleme rahatsız tutkal önlemek için beyin agar blok üstünden buz gibi ACSF az miktarda uygulayın. Daha sonra, vibratom tepsisine platform düzeltmek ve değiştirilmiş ACSF dökün. Vibratomu yavaş bir hıza ayarlayın ve bıçak frekansını maksimum ayarında ayarlayın.
O zaman dilimlemeye başla. Dilimlerin sırası kolayca ayırt edilebilmesi için dilimleri sırayla dilim odasının köşesine yerleştirin. Genellikle bir yarımküreden 3-5 dilim elde edilebilir.
Sonra, 30 gauge iğne kullanarak beyin sapı kısmını kesti. Küçük uçlu bir boya fırçası kullanarak, dilimi pleksiglas halkaile tutulan membran filtresine yerleştirin. Halkayı nemli bir geri kazanım odasına yerleştirin ve iç basıncı yüksek tutmak için kapağı sabitlayın.
Dilimi membran filtresine yerleştirirken, dilimin halka içindeki yönünü ve konumunu iyi ortalandığından ve tutarlı bir yöne sahip olduğundan emin olmak için ayarlayın. Numuneyi 28 derecede 30 dakika, oda sıcaklığında ise en az 10-30 dakika bekletin. Dilimleri boyamak için, boyama çözeltisinin 100 mikrolitresini her dilimin üzerine hafifçe uygulayın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Ardından, bir kapta 50 ila 100 mililitre ACSF hazırlayın. Boyama çözeltisini durulamak için halkayı numunenin içinde yerleştirin. Daha sonra, durulanan dilimleri başka bir kuluçka odasına aktarın.
Denemeden önce iyileşme için bir saatten fazla bekleyin. Bu yordamı başlatmak için amplifikatör, bilgisayar ve kamera sistemini açın ve yazılımı açın. 50 mililitrelik bir tüp acsf dökün ve carbogen ile kabarcık.
ACSF'yi sirküle etmek ve akış hızını dakikada yaklaşık bir mililitreye ayarlamak için peristaltik bir pompa kullanın. Daha sonra emme pipetinin yüksekliğini, deney odasının içindeki sıvı seviyesinin her zaman sabit olması için ayarlayın. Zemin elektrot'u odaya yerleştirin.
Daha sonra, cam elektrot acsf küçük bir miktar ile doldurun ve elektrot tutucu yerleştirin. Tutucuyu manipülatörün çubuğuna takın. Bir amplifikatör kullanarak, elektrot direnci yaklaşık bir megaohm olduğundan emin olun.
Kayıt oturumunda, nemli odadan deneysel bir odaya bir dilim aktarın. Halkanın kenarına silikon o-halkaya sıkıca bastırın. Deney odasının zarını veya altını kırmamaya dikkat edin.
Mikroskop altında uyarıcı elektrot ucu ve alan potansiyel kayıt elektrot dilim yerleştirin. Bir uyarıcı sunarak uyarılmış yanıtı kontrol edin. Görüş alanının optik kayıt sistemindeki doğru sinir devresini kapsadığını doğrulayın.
Ardından, uyarma ışık yoğunluğunu kameradaki maksimum kapasitenin yaklaşık %70 ila %80'ine ayarlayın. Floresan ışık kaynağını kullanarak, odak satın alma sistemi ile ayarlayın. Ardından, kaydı başlatın ve satın alma dan sonra bir görüntü edinme yazılımındaki verileri analiz edin.
Bu rakam bir fare hipokampal dilim alan CA1 Schaffer collaterol elektrikstimülasyon üzerine temsili optik sinyal gösterir. Bu ardışık görüntüler, herhangi bir aralıklı ve zamansal filtre uygulanmadan önce optik sinyali gösterirken, bu görüntüler beşe beş kübik filtreyi iki kez uyguladıktan sonra aynı verileri gösterir. Yüksek kare hızı ve yüksek uzamsal çözünürlük nedeniyle, filtreuygulaması sinyali değiştirmedi, ancak tek bir denemede pikselolarak kaydedilen zaman diliminde de gözlemlenebilen gürültüyü filtreledi.
Burada fare ve sıçan arasındaki hipokampal dilimlerin alan CA1 tipik tepkilerin karşılaştırılmasıdır. Fare hipokampal diliminde 24 milisaniye sonra CA1 distal tarafında küçük hiperpolarize yanıt gözlenir, ancak daha büyük hiperpolarize yanıt sıçan hipokampal dilimde depolarize yanıt geçti. Dilimler boyandıktan sonra 12 saatten fazla dayanmalıdır ve üzerlerinde başka elektrofizyolojik kayıtlar yapabilirsiniz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, hipokampal nöron sinyalleşmesine odaklanarak beyin dilimleri için voltaj duyarlı boya kullanan stabil bir optik kayıt yöntemini sunmaktadır. Bu teknik, uzun süreler boyunca nöropsişik dinamiklerin güvenilir bir görünümünü sağlayarak, kimyasal uygulamalara bağlı devre değişikliklerinin araştırılmasını kolaylaştırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Elektrofizyoloji
- Optik Görüntüleme
Arka Plan
- Voltaj duyarlı boyalar, beyin aktivitelerini görselleştirmek için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel hipokampal kesit preparatları biyolojik model olarak kullanılır.
- Çalışma, nöropsişik dinamikleri ve devre değişikliklerini araştırmaktadır.
- Önceki yöntemler, uzun kayıt süreleri boyunca güvenilirlikten yoksundu.
Çalışmanın Amacı
- Beyin kesitlerinde optik kayıt için tekrarlanabilir bir yöntem sunmak.
- Kimyasalların beyin devresi dinamikleri üzerindeki etkilerine dair içgörüler sağlamak.
- Nöronal aktivitenin ve yanıtların uzun süreli gözlemlenmesini mümkün kılmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kullanılan platform, fare hipokampusundan hazırlanan ex vivo beyin kesitleridir.
- Temel model, elektriksel aktivite üzerine çalışmaları kolaylaştıran hipokampal kesitleri içerir.
- Herhangi bir multiomik iş akışından bahsedilmemiştir; odak noktası optik ve elektrofizyolojik tekniklerdir.
- Hazırlık süreci; kesitlerin soğutulması, boyanması ve inkübe edilmesi gibi titiz adımları içerir.
- Kayıt oturumları, hassas kurulum gereksinimleri olan bir deney odacığında gerçekleştirilir.
Temel Sonuçlar
- Optik yöntem, 12 saatlik bir süre boyunca güvenilir veri toplanmasına olanak tanır.
- Fare ve sıçan hipokampal dilimleri arasındaki yanıtların karşılaştırılması, belirgin nörofizyolojik profiller göstermektedir.
- Hiperpolarize edici yanıtlar gibi elektrofizyolojik değişiklikler, optik kayıtlar ile desteklenmektedir.
- Bu teknik, çeşitli koşullar altında nöronal devre dinamikleri hakkındaki anlayışımızı geliştirmektedir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, beyin devrelerini ve nöropsikolojik fenomenleri incelemek için önemli bir ilerleme sunmaktadır.
- Araştırmacıların nöronal sinyallemedeki gerçek zamanlı değişiklikleri gözlemlemesine olanak tanır.
- Bu mekanizmaların anlaşılması, plastisite ve potansiyel terapötik uygulamalar hakkında bilgiler sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve Uygunluk
Geniş alanlı tek foton voltaj duyarlı boya görüntüleme, beyin kesitlerindeki nöral devrelerin stabil ve uzun süreli fonksiyonel değerlendirmesine olanak tanıyarak, nörobilimdeki hedef doğrulamada karşılaşılan temel bir zorluğu çözer. Bu yöntem, preklinik keşif sürecinde bileşiklerin devre dinamikleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kritik olan, nöronal aktivitenin uzun süreler boyunca kantitatif ve yüksek çözünürlüklü optik okumalarını sağlayarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hipokampal devrelerdeki gerçek zamanlı nöronal sinyalleşme dinamiklerini görselleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef etkileşiminin ve yolak modülasyonunun boylamsal değerlendirmesini destekleyerek 12 saatin üzerinde stabil ve tekrarlanabilir kayıtlar sağlar.
- Tahmin Değeri: Kimyasal uygulamaların tetiklediği devre değişikliklerinin tespitini kolaylaştırarak nöroaktif bileşik etkilerinin erken belirlenmesine yardımcı olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: 10 kHz kare hızı ve 100x100 piksel çözünürlüğe ulaşarak, nöral yanıtların yüksek kapasiteli zamansal ve mekansal analizini mümkün kılar.
- Sinyal Kalitesi: Kayıt sonrası filtreleme, sinyal-gürültü oranını artırarak analiz hassasiyeti için kritik olan eşik altı devre değişikliklerinin güvenilir şekilde tespit edilmesini sağlar.
- Tekrarlanabilirlik: Stabil kesit işleme ve boyama protokolleri mekanik artefaktları minimize ederek, tekrarlar ve deneysel oturumlar arasında tutarlı veriler sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Bilişsel ve nöropsikiyatrik bozukluklarla ilişkili bir bölge olan hipokampal ağlardaki devre değişikliklerinin değerlendirilmesini destekler.
- Translasyonel Süreklilik: Paralel optik ve elektrofizyolojik kayıtlar sağlayarak, farklı ölçüm modaliteleri arasındaki fonksiyonel sonuçların doğrulanmasını güçlendirir.
- Risk Ayarlı Gelişim: Fare ve sıçan kesitleri arasındaki belirgin yanıt profilleri, türler arası translasyona ışık tutar ve preklinik aday seçimindeki risklerin azaltılmasına yardımcı olur.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle devre düzeyinde fenotipik değerlendirme gerektiren nöroaktif bileşikler için hedef doğrulama ile öncü bileşik belirleme arasında köprü kuran fonksiyonel devre çıktıları sağlayarak erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Belirli nöral devrelerdeki uyarılan optik sinyallerin doğrudan görselleştirilmesi yoluyla, nöropsişik dinamiklerin hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Bileşik kaynaklı nöral aktivite değişikliklerinin otomatik analizi ve karşılaştırılmasına uygun, kantitatif ve yüksek çözünürlüklü optik çıktılar sağlar.
- Analizler: Gürültüden sinyalin ayrıştırılması için spasyotemporal filtrelerin uygulanmasına olanak tanıyarak, devre yanıtlarının objektif kantifikasyonunu ve değişkenlik değerlendirmesini kolaylaştırır.
- Translasyonel Araştırma: Bileşik etkilerinin stabilitesini ve tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için uzun süreler boyunca tekrarlanan kayıtlara izin vererek, keşif aşamasındaki devre gözlemlerini preklinik doğrulamaya bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standartlaştırılmış kesit hazırlama ve görüntüleme platformu, birden fazla proje ve bileşik serisi genelinde yeniden kullanıma destek vererek, nörobilim tarama basamaklarındaki metodolojik değişkenliği azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamadaki belirsizlikleri azaltarak ve nörofarmakolojik taramalarda öngörü güvenini destekleyerek nöronal devre fonksiyonuna dair mekanistik içgörü sağlar.
- Operasyonel Değer: Fizyolojik koşulları korur ve dilim hareketini önleyerek güvenilir bileşik taraması için stabil, artefakt içermeyen veri elde edilmesini sağlar.
- Stratejik Değer: Hedef dışı veya advers devre etkilerinin erken tespitine olanak tanıyarak, MSS ilaç geliştirme sürecindeki geç aşama başarısızlık riskini azaltır ve go/no-go kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Fonksiyonel devre profillerine dayalı olarak bileşiklerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini destekler ve preklinik süreçlerde sermaye verimliliğini artırır.
Uygulama Hususları
- Kesit canlılığının ve boyama verimliliğinin uygun şekilde sağlanması için elektrofizyoloji, optik görüntüleme ve doku işleme konularında uzmanlık gerektirir.
- Uzun süreli kayıtlar için fizyolojik koşulları sürdürebilen yüksek hızlı kamera sistemlerine, floresan ışık kaynaklarına ve perfüzyon düzeneklerine bağımlıdır.
- Optik sinyal baz çizgisi ve yanıt verme kapasitesindeki değişkenliği minimize etmek için ekipler arasında kesit yöneliminin, boyama süresinin ve recovery protokollerinin standartlaştırılması gereklidir.
- Diğer beyin bölgelerine veya hastalık modellerine uyarlama, boyama verimliliğinin ve devreye özgü sinyal ekspresyonunun doğrulanmasını gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında, tespit için yeterli sinyal genliğini korurken fototoksisiteyi önlemek amacıyla eksitasyon ışığı yoğunluğunun dikkatle optimize edilmesi gerekliliği yer alır.
